إنشاء الدائرة المغلقة في الموقع perfusion من أعضاء البطن السفلي وأطراف هند في الفئران

Summary

يوصف بروتوكول للضخ الموضعي للجسم السفلي للماوس ، بما في ذلك المثانة والبروستاتا والأعضاء الجنسية والعظام والعضلات وبشرة القدم.

Abstract

السابقين فيف الكبد هو أداة فسيولوجية هامة لدراسة وظيفة الأجهزة المعزولة (مثل الكبد والكلى). في الوقت نفسه ، بسبب صغر حجم أعضاء الماوس ، فإن قذف الجسم الحي السابق للعظام والمثانة والجلد والبروستاتا والأعضاء التناسلية أمر صعب أو غير مجد. هنا، ونحن تقرير لأول مرة في الموقع دائرة التسريب الجسم السفلي في الفئران التي تشمل الأنسجة المذكورة أعلاه، ولكن يتجاوز أعضاء إزالة الرئيسية (الكلى والكبد والطحال). يتم تأسيس الدائرة عن طريق تعلية الشريان الأورطي البطني و الوريد السفلي فوق الشريان الحرقفي والوريد وتكوية الأوعية الدموية الطرفية. يتم تنفيذ perfusion عن طريق مضخة م peristaltic مع تدفق perfusate الحفاظ على لمدة تصل إلى 2 ساعة. في الموقع تلوين مع الليكتين الفلورسنت وحل Hoechst أكد أن microvasculature تم بنجاح. يمكن أن يكون هذا النموذج الماوس أداة مفيدة جدا لدراسة العمليات المرضية، فضلا عن آليات تسليم المخدرات، والهجرة / الانبثاث من الخلايا السرطانية تعميم داخل / من الورم، وتفاعلات الجهاز المناعي مع الأجهزة والأنسجة المحصنة.

Introduction

تم تطوير إفراز الأعضاء المعزول في الأصل لدراسة فسيولوجيا الأعضاء^1،2،3، ومكّن من فهم وظائف الأعضاء دون تدخل من أنظمة الجسم الأخرى. على سبيل المثال ، كان قلب الكلى والقلب المعزول مفيدًا للغاية في فهم المبادئ الأساسية للديناميكا الدموية وآثار العوامل النشطة ، في حين أن ضخ الكبد كان مهمًا لفهم وظيفة التمثيل الغذائي ، بما في ذلك استقلاب الدواء في الأنسجة الصحية^{والمريضة 4،5،6،7}. وبالإضافة إلى ذلك، كانت دراسات التسريب حاسمة في فهم جدوى ووظيفة الأعضاء المعدة للزراعة. في أبحاث السرطان، وقد وصفت القذف الورم معزولة من قبل عدة مجموعات باستخدام الفأرة, الفئران, والأنسجة البشرية الطازجة^8,9. في بعض البويضات الورم المعزولة ، تم زرع الورم في وسادة الدهون المبيضة لفرض نمو الورم الذي يزود الأوعية الدموية من الشريان الميكرونري¹⁰. قامت مجموعة جاين بإجراء دراسات رائدة باستخدام الضخ المعزول من سرطان القولون لفهم ديناميات الدم والتشائل^{الورم 8,11,12,13}. وتشمل غيرها من الاجهزة الهندسة الهندسية السابقة vivo 96-well لوحة المستندة إلى جهاز القذف لثقافة الإنسان الأساسي خلايا المايلوما المتعددة¹⁴ وغرفة تدفق وحدات لهندسة نخاع العظام الهندسة والبحوث وظيفة¹⁵.

بالإضافة إلى علم وظائف الأعضاء والدراسات علم الأمراض، وقد استخدمت فيرف الجهاز لدراسة المبادئ الأساسية لتسليم المخدرات. وهكذا، وصفت إحدى المجموعات نزف أطراف الفئران المعزولة ودرست تراكم الليبوسومات في الساركوما المزروعة¹⁶، في حين قامت مجموعة أخرى بتشريح ضخ الكلى البشري لدراسة الاستهداف البطانية للجسيمات النانوية¹⁷. Ternullo وآخرون تستخدم معزولة رفرف الجلد البشري الم perfused باعتبارها قريبة في الجسم الحي الجلد المخدرات الإختراق نموذج^18.

وعلى الرغم من هذه التطورات في تخبط الأعضاء والأنسجة الكبيرة، لم تكن هناك تقارير عن نماذج التسريب في الموقع في الفئران التي: أ) تجاوز أعضاء إزالة مثل الكبد والطحال والكلى; ب) تشمل أعضاء الحوض والجلد والعضلات والأعضاء التناسلية (في الذكور) والمثانة والبروستاتا ونخاع العظام. نظرا لصغر حجم هذه الأجهزة وتوريد الأوعية الدموية، السابقين فيتبل vivo وإنشاء دائرة القذف لم يكن ممكنا. الماوس هو النموذج الحيواني الأكثر أهمية في أبحاث السرطان وعلم المناعة، وتسليم الأدوية. القدرة على اغراء أجهزة الماوس الصغيرة من شأنه أن يسمح أسئلة مثيرة للاهتمام بشأن تسليم المخدرات لهذه الأجهزة، بما في ذلك للأورام المزروعة في الحوض (المثانة، البروستاتا، المبيض، نخاع العظام)، إلى أن تتم الإجابة، فضلا عن دراسات علم وظائف الأعضاء الأساسية والمناعة من أمراض هذه الأجهزة. لمعالجة هذا النقص، طورنا دائرة التسريب في الموقع في الفئران التي يمكن أن تجنب إصابة الأنسجة، وأكثر ملاءمة للبحوث الوظيفية من الضخ العضو المعزول.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الأساليب المذكورة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية في جامعة كولورادو (IACUC).

1. قبل-- تسخين نظام الضخ

1. إعداد نظام التسريب قبل الجراحة عن طريق بدء 37 درجة مئوية تعميم حمام المياه لجميع مكونات الماء سترة (خزان perfusate، غرفة رطبة، وغطاء) كما هو مبين في تكوين مخصص في الشكل 1A. تأكد من أن الأنابيب نظيفة واستبدال إذا لزم الأمر. للحد من حجم perfusate، استخدم فخ فقاعة داخل غرفة رطبة كما خزان perfusate(الشكل 1B-6).

2. القسطرة الوعائية

1. حث التخدير في 8-10 ماوس بالب / ج من العمر الأسبوع باستخدام جهاز التخدير البيطري isoflurane مع 3-5٪ isoflurane ومعدل تدفق الأكسجين في 0.3 L / دقيقة. كبديل، استخدم الكيتامين/الزيلازين أو أي نوع آخر من التخدير داخل الصفاق. تقييم عمق التخدير بواسطة طرق 2: إصبع القدم قرصة ومنعكس القرنية.
2. بريت خياطة حريرية 4-0 مع إبرة في الماء المقطر المزدوج.
3. وضع الماوس تخدير في موقف سوبين على لوحة الستايروفوم مع رئيس تواجه الجراح وشل الحركة forelimbs والأطراف الخلفية مع الشريط. امسح البطن بالكحول الايزوبروبيل وقطع البطن على طول خط الوسط في شكل "T" مع مقص. وقف النزيف حول حافة الشق عن طريق التخثر الكهربائي (الكي).
4. دفع المعدة, jejunum والقولون إلى الجانب الأيمن من البطن للكشف عن الشريان الأورطي البطن, فينا كافا, وشائعة الشرايين iliac و iliolumbar الأوردة.
5. تحت مجهر تشريح، والعثور على ligate الشريان iliolumbar / الوريد في الذكور، والشريان المبيض / الوريد والشريان iliolumbar / الوريد في الأنثى باستخدام 4-0 خياطة الحرير(الشكل 2 خطوط صفراء).
6. تحت مجهر تشريح، حلقة اثنين 4-0 خياطة الحرير تحت الشريان الأورطي البطني وسفين الكافا السفلي (حوالي 1 سم فوق الشريان الحرقفي والوريد، 1 مم وبصرف النظر، الشكل 2)، وجعل عقدة فضفاضة في خياطة الأقرب إلى الأوعية الحرقفية(الشكل 2،خط منقط أبيض). بدلا من ذلك، يمكن استخدام خياطة الحرير 6-0 لهذه العقدة.
7. تحت مجهر تشريح، أفقيا محاذاة وتمتد كل من الكافا الوريدي السفلي والأبهرية البطنية مع بورتي-aiguille. استخدم قسطرة I.V. مجنحة 24 G لثقب الشريان الأورطي البطني، اضغط على الزر لسحب قلب الإبرة وإدخال القسطرة حوالي 5 مم في الوعاء.
   1. كرر نفس الإجراء مع الوريد السفلي cava وربط عقدة من كل من الغرز حول الأوعية القسطرة.
      ملاحظة: يمكن أن تثقب الإبرة بسهولة من خلال الأوعية الدموية؛ لذلك، والحفاظ على السفن امتدت وإبرة موازية مع السفينة. سحب جوهر إبرة بمجرد أن تخترق الإبرة حوالي 1 ملم في الوعاء. الشريان الأورطي البطن تحت الكافا الوريدي السفلي وأرق بكثير وأكثر مرونة بسبب كونها مغلفة في النسيج الضام. لذلك، يمكن أن الشريان الأورطي "عقد على" إلى القسطرة، وبالتالي ينبغي أن تكون قسطرة قبل الكافا فينا للحد من احتمال انزلاق القسطرة.
8. تطبيق الغراء الفورية لشل القسطرة إلى سبينا المنتصب، واستبدال أعضاء البطن، وإنهاء الجراحة مع الحفاظ على التخدير.
   ملاحظة: سوف تحتاج الأجهزة التي لا يمكن استبدالها تماما في تجويف البطن إلى أن تكون رطبة دوريا مع متوسطة التسريب أثناء عملية التسريب.

3. إعداد نظام الضخ

1. نقل الماوس إلى غرفة رطبة بالماء سترة مسبقا إلى 37 درجة مئوية على وسادة السيليكون وشل أجنحة القسطرة إلى لوحة مع 19 G الإبر.
2. ملء نهاية القسطرة الشرياني (مدخل) مع المخزن المؤقت perfusion مسبقة الالدفء (حل لاكتات رينجر تكملها 5٪ BSA)، ومن ثم ربط نهاية القسطرة مع أنابيب مدخل perfusion باستخدام موصل المسمار على (الشكل 1B، السهم الأحمر).
   ملاحظة: اضغط على الموصل مع ملقط hemostatic وشل أنابيب مع الشريط لتجنب نقل القسطرة.
3. ضبط معدل التدفق ال peristaltic إلى 0.6 مل / دقيقة والحفاظ على تدفق الضخ(الشكل 1B، السهم الأزرق) مفتوحة لمدة 5-10 دقيقة لغسل الدم من خلال القسطرة الوريدية. سيكون هناك بعض الجلطات في القسطرة منفذ; طرد الجلطات مع المخزن المؤقت perfusate قبل إغلاق الدائرة perfusion.
4. قم بتوصيل نهاية القسطرة الوريدية مع أنابيب المنفذ باستخدام موصل المسمار على إغلاق الدائرة (الشكل 1B). عند هذه النقطة، تنفيذ CO₂ القتل الرحيم الغاز والتحقق عن طريق ثقب الصدر أو أي طريقة أخرى.
5. غطي الغرفة الرطبة بالغطاء الدافئ. تحقق من مستوى perfusate بشكل دوري وإضافة المزيد إذا لزم الأمر. يمكن إجراء الانفعال لمدة تصل إلى ساعتين.
   ملاحظة: سوف تكون هناك حاجة إلى 5 مل من perfusate لإعداد نظام الضخ المغلقة. إذا لم يكن هناك تسرب أو وذمة ، سينخفض حجم perfusate بأقل من 1 مل ولن تكون هناك حاجة إلى مخزن مؤقت إضافي. لتجنب الوذمة الناجمة عن ثركمبوس تعميم المحيطية، يمكن استخدام عازلة التسريب التي تحتوي على 0.002٪ الهيبارين في أول 10 دقائق من التسريب، ولكن ينبغي تغييرها إلى العازلة دون الهيبارين لتجنب تسرب في حافة الشقوق.
6. إذا لزم الأمر، إضافة كاشف من خيار في خزان الضخ أو إلى منفذ الحقن في أي وقت(الشكل 1B-5). على سبيل المثال، 10 ميكرولتر من 10 ملغ/مل Hoechst33342 يمكن أن تضاف إلى perfusate وصمة عار نواة الخلية 2 ساعة قبل نهاية القذف، أو 50 ميكرولتر من 1 ملغ/مل DyLight 649-lectin لطخة الخلايا البطانية الوعائية 30 دقيقة قبل نهاية perfusion.
   ملاحظة: إذا كانت محاولة وصمة عار نخاع العظم مع حل Hoechst، الفئران سوف تحتاج إلى قبل حقن 30 دقيقة قبل الجراحة.
7. بعد التسريب مع الكواشف الفلورية، وغسل بها مع عازلة التسريب لمدة 10 دقائق أخرى لتقليل الفلورانس الخلفية.

4- تحليل الأعضاء المُطعّمة

1. جمع الأعضاء بما في ذلك الخصية والبروستاتا والمثانة وعظم الفخذ والعضلات والجلد (على سبيل المثال، قدم). استخراج قطعة من الجهاز حوالي 1 ملم³ وتتسطح بين اثنين من الشرائح الزجاجية.
   1. دراسة تحت المجهر الفلوري المقلوب confocal باستخدام DAPI / Cy5 الإثارة والمرشحات الانبعاثات (ليزر الإثارة : DAPI، 405 نانومتر؛ Cy5,640 نانومتر). استخدم على الأقل 200x هدف التكبير مع فتحة رقمية 0.45.
   2. بدلا من ذلك، إصلاح الأجهزة مع 4٪ حل الفورمالديهايد ل 24 ح وأداء الهماوكسيلين-إيوسين تلطيخ¹⁹.
2. لإنشاء نافذة العظام لمراقبة نخاع العظام سليمة, شل كلا طرفي عظم الفخذ أو الساق وكشط بعيدا العظام القشرية مع الحافة الجانبي من إبرة 19 G لفضح الزخرف; الحرص على الحفاظ على طبقة رقيقة من العظام المتبقية. ضع العظم على زلة غطاء مع النافذة التي تواجه الزجاج والصورة مع مجهر الفلوروسي المقلوب باستخدام قنوات DAPI و Cy5 كما هو موضح أعلاه. يمكن بسهولة ملاحظة الخلايا وشبكة الأوعية الدموية في تجويف نخاع العظام.

النتائج

وضعنا نظام قذف الدائرة المغلقة من خلال التكبيل من الشريان الأورطي البطني و الوريد السفلي كافا من الفئران 8-10 الأسبوع القديم مع الحفاظ على حجم التخزين المؤقت perfusion أقل من 10 مل. يظهر الشكل 3A الصور confocal بعد قذف الأنسجة مع حل رينجر التي تحتوي على Hoechst 33342 وDyLight 649-lectin. العضلات, نخاع...

Discussion

ويمكن استخدام الدائرة الموصوفة للتحقيق في مختلف المسائل البحثية، على سبيل المثال دور مكونات المصل المختلفة وحواجز الأنسجة في تسليم المخدرات، أو الاتجار بالخلايا الجذعية والمناعة. يمكن إضافة أنظمة مختلفة لتوصيل الأدوية (مثل الدهون والجسيمات النانوية) إلى الغشاء من أجل فهم دور العوامل ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light	Amscope	SKU: SM-3BZ-80S
Carbon dioxide, USP	Airgas healthcare	19087-5283
Confocal microscope	NIKON	ECLIPSE Ti2
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp	FIAB	F7244
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733692	Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733524	keep the chamber's temperature
Moist chamber with metal tube heat exchanger	Harvard Apparatus	732901	Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters	Fine Science Tools (FST)	125014
Oxygen compressed, USP	Airgas healthcare	C2649150AE06
Roller pump (part 4 in Figure 1)	Harvard Apparatus	730113	deliver perfusate to cannula in the moist chamber
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1)	Harvard Apparatus	732806	control the purfusion speed
Silicone pad	Harvard Apparatus
Silicone tubing set (arrows in Figure 1)	Harvard Apparatus (TYGON)	733456
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools (FST)	91100-12
Surgical Scissors	Fine Science Tools (FST)	14001-14
Table for moist chamber	Harvard Apparatus	734198
Thermocirculator (part 2 in Figure 1)	Harvard Apparatus	724927	circulating water bath for all water-jacketed components
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1)	Cole-Palmer	30600-02
Veterinary anesthesia machine	Highland	HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide needle	BD	305186	For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone
4-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427411
6-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427401
Filter (0.2 µm)	ThermoFisher	42225-CA	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Permanent marker	Staedtler	342-9
Syringe (10 mL)	Fisher Scientific	14-823-2E
Syringe (60 mL)	BD	309653	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Reagents
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5)	Sigma	314-13-6
10% buffered formalin	velleyvet	36692
BALB/c mice ( 8-10 weeks old )	Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution	EMRN Medical Supplies Inc.	JB2324
Bovine serum albumin	Thermo Fisher	11021-037
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue
DyLight-649-lectin	Vector Laboratories,Inc.	ZB1214
Ethanol (70% (vol/vol))	Pharmco	111000190
Hoechst33342	Life Technologies	H3570
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	66794-017-25
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023