マウスにおける下腹部および後肢の脳閉回路灌流における確立

要約

プロトコルは、膀胱、前立腺、性器、骨、筋肉および足の皮膚を含むマウス下半身の上皮灌流に記載されている。

要約

エクスビボ灌流は、孤立した器官(例えば肝臓、腎臓)の機能を研究するための重要な生理学的ツールである。同時に、マウス器官のサイズが小さいため、骨、膀胱、皮膚、前立腺、生殖器官のエクスビボ灌流は困難であるか、または実現不可能である。ここでは、上記組織を含むマウスの下半身灌流回路を初めて報告するが、主なクリアランス器官(腎臓、肝臓、脾臓)をバイパスする。この回路は、腸骨動脈および静脈の上の腹部大動脈および下大静脈をカニューララットし、末梢血管を焼灼することによって確立される。灌流は、パーフューズン流を最大2時間維持した蠕動ポンプを介して行われる。蛍光レクチンおよびHoechst溶液によるその際の染色では、マイクロバスキュアチュアが正常に浸透していることを確認した。このマウスモデルは、病理学的プロセス、および薬物送達のメカニズム、腫瘍への循環腫瘍細胞の移動/転移、および浸透した器官および組織との免疫系の相互作用を研究するのに非常に有用なツールとなり得る。

概要

孤立した臓器灌流は、もともと移植のための臓器生理学を研究するために開発された^{11、2、3、2,3}そして他の身体システムからの干渉なしに器官の機能の理解を可能にした。例えば、単離した腎臓および心臓灌流は、血行力学の基本原理および血管活性剤の効果を理解するのに非常に有用であったが、肝臓灌流は、健康および疾患組織^{44、5、6、75,6,7}における薬物代謝を含む代謝機能を理解する上で重要であった。さらに、移植を目的とした臓器の生存率と機能を理解する上で、灌流研究は重要であった。癌研究では、単離された腫瘍灌流は、マウス、ラット、および新たに切除されたヒト組織^88、99を用いていくつかのグループによって説明されている。いくつかの単離された腫瘍灌流では、腫瘍を卵巣脂肪パッドに移植し、腸間動脈¹⁰から血管を供給する腫瘍の成長を強制する。Jainグループは、結腸腺癌の単離灌流を用いて、腫瘍血球力学および転移^{88、11、12、13}を理解するための先駆的な研究^11,12を行^った。他の革新的な工学的なex vivoのセットアップは、主要なヒト多発性骨髄腫細胞¹⁴を培養する96ウェルプレートベースの灌流装置および骨髄アーキテクチャおよび機能研究¹⁵を工学用のモジュラー流動室を含む。

生理学と病理研究に加えて、臓器灌流は薬物送達の基本原理を研究するために使用されてきた。したがって、1つの群は、単離されたラット四肢灌流を説明し、移植肉腫¹⁶におけるリポソームの蓄積を研究し、別の群は解剖されたヒト腎臓灌流を行い、ナノ粒子¹⁷の内皮標的化を研究した。Ternulloら. 単離された浸透ヒト皮膚フラップを近い生体内皮膚薬物浸透モデル¹⁸として使用した。

大きな臓器や組織の灌流におけるこれらの進歩にもかかわらず、マウスのsitu灌流モデルでは、a)肝臓、脾臓、腎臓などのクリアランス器官をバイパスするという報告はありません。b)骨盤臓器、皮膚、筋肉、生殖器官(男性)、膀胱、前立腺および骨髄が含まれる。これらの器官のサイズが小さく、脈管構造を供給するため、エキソビボカヌラ化および灌流回路の確立は実現不可能であった。マウスは、がんや免疫学の研究、および薬物送達において最も重要な動物モデルです。小さなマウス器官を穿フューズする能力は、骨盤に移植された腫瘍(膀胱、前立腺、卵巣、骨髄)を含むこれらの器官への薬物送達に関する興味深い質問を答えることを可能にし、これらの器官の疾患の基礎生理学および免疫学の研究を可能にする。この欠乏に対処するために、我々は、潜在的に組織損傷を回避することができ、単離された臓器灌流よりも機能的研究にはるかに適しているマウスのsitu灌流回路を開発した。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、コロラド大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 灌流システムを予熱する

1. 図1Aのカスタマイズされた構成に示すように、すべての水ジャケット部品(パーフューズ貯留槽、湿潤チャンバー、および蓋)に対して37°C循環水浴を開始することにより、手術前に灌流システムを準備する。チューブが清潔であることを確認し、必要に応じて交換してください。パーフューズ量を制限するには、湿潤チャンバ内の気泡トラップをパーフューズト貯留層として使用する(図1B-6)。

2. 血管カテーテル法

1. イゾフルランの獣医麻酔装置を使用して8-10週齢のBALB/cマウスで麻酔を誘発し、3~5%のイゾフルランと酸素流量を0.3 L/minで行います。代わりに、ケタミン/キシラジンまたは腹腔内麻酔の他のタイプを使用してください。2つの方法で麻酔の深さを評価する:つま先ピンチと角膜反射。
2. 4-0シルク縫合糸を針で二重蒸留水にプレウェットします。
3. 麻酔マウスを外科医に向けた発泡スチロールボード上の上の上の上の上の上に置き、前肢と後肢をテープで固定します。イソプロピルアルコールで腹部を拭き、中線に沿って腹部をハサミで「T」の形で切ります。電気凝固(焼灼)によって切開の縁の周りの出血を止める。
4. 腹部の右側に胃、よく、そして大腸、結腸を押して腹部大動脈、大静脈、そして一般的な腸骨およびイリオルバール動脈および静脈を明らかにする。
5. 解剖顕微鏡の下で、4-0シルク縫合糸を使用して、男性のイリオルバール動脈/静脈、および卵巣動脈/静脈および女性のイリオルバール動脈/静脈を見つけてリゲートする(図2 黄色の線)。
6. 解剖顕微鏡の下で、腹部大動脈と下の大静脈の下に2つの4-0シルク縫合糸をループし(腸骨動脈と静脈の上に約1cm、1mm離れて図 2)、腸骨血管に最も近い縫合糸で緩い結び目を作ります(図2、白い点線)。あるいは、この結び目には6-0シルク縫合糸を使用できます。
7. 解剖顕微鏡の下で、下の大静脈と腹部大動脈の両方をポルト・エギーユで水平に整列させ、伸ばします。24 Gの翼を持つシールドI.V.カテーテルを使用して腹部大動脈を穿刺し、ボタンを押して針のコアを引っ込み、約5mmのカテーテルを容器に挿入します。
   1. 下の大静脈で同じ手順を繰り返し、カテーテル化された血管の周りに両方の縫合糸の結び目を結びます。
      注:針は血管を通して簡単に穿刺することができます。したがって、血管を伸ばし、針を血管と平行に保ちます。針が約1mmを血管に貫通するとすぐに針の芯を引き込みます。腹部大動脈は、下の大静脈の下にあり、結合組織に包まれるため、はるかに薄く、より弾力性があります。したがって、大オルタはカテーテルに「つかまり」、したがって、カテーテルが抜け出す可能性を減らすために、静脈の前にカテーテル化する必要があります。
8. 即座に接着剤を塗布して、カテーテルを勃起脊髄に固定し、腹部の器官を交換し、麻酔を維持しながら手術を終了します。
   注:腹腔に完全に交換することができない臓器は、灌流プロセス中に灌流媒体で定期的に湿らせなうます。

3. 灌流システムのセットアップ

1. シリコンパッド上の37°Cにプリウォームされた水ジャケット湿ったチャンバーにマウスを移し、カテーテルの翼を19Gの針でパッドに固定します。
2. 動脈カテーテルの端(入口)に、前温灌流バッファー(リンガーの乳酸溶液に5%BSAを補う)を充填し、スクリューオンコネクタを使用してカテーテル端を入口灌流チューブと接続します(図1B、赤矢印)。
   注:コネクタに止血鉗子を持ち、カテーテルを動かさないようにテープでチューブを固定します。
3. 蠕動流量を0.6 mL/minに調整し、灌流流出(図1B、青矢印)を5〜10分間放入して静脈カテーテルを通して血液を洗い流します。出口のカテーテルにはいくつかの血栓がある。灌流回路を閉じる前に、パーフューズドバッファーで血栓を洗い流してください。
4. ねじコネクタを使用して、静脈カテーテルの端部をコンセントのチューブに接続して回路を閉じます(図1B)。この時点で_、CO2ガス安楽死を行い、胸部穿刺またはその他の方法で検証する。
5. 湿った部屋を温めた蓋で覆います。定期的に透過性のレベルを確認し、必要に応じてさらに追加します。灌流は、最大2時間行うことができる。
   注:閉じた灌流システムを設定するには、5 mLのパーフューズが必要です。漏れや浮腫がない場合、パーフューズの体積は1mL未満減少し、追加のバッファは必要ありません。末梢循環血栓によって誘発される浮腫を避けるために、0.002%ヘパリンを含む灌流バッファーは、灌流の最初の10分間に使用することができるが、切開部の端部での漏れを避けるためにヘパリンなしで緩衝液に変更すべきである。
6. 必要に応じて、任意の時点で灌流リザーバーまたは注入口に選択した試薬を追加します(図1B-5)。例えば、10 mg/mL Hoechst33342の10 μLをパーフューズに加えて、灌流終了の2時間前に細胞核を染色することができ、または1 mg/mL DyLight 649-レクチンの50 μLを透過の終わりの30分前に血管内皮細胞を染色する。
   注:Hoechst溶液で骨髄を染色しようとする場合、マウスは手術の30分前に事前注射する必要があります。
7. 蛍光試薬を灌流した後、さらに10分間、灌流バッファーで洗い流し、バックグラウンド蛍光を最小限に抑えます。

4. 浸透器官の解析

1. 精巣、前立腺、膀胱、大腿骨、筋肉、皮膚(例えば、足)を含む器官を収集する。約^1mm3 のオルガンを物品切りし、2枚のガラススライドの間で平らにします。
   1. DAPI/Cy5励起および発光フィルターを用いた反転蛍光共焦点顕微鏡(励起レーザー:DAPI、405 nm;Cy5,640 nm)。0.45の数値絞りを使用して、少なくとも200倍の倍率の目的を使用してください。
   2. あるいは、24時間4%ホルムアルデヒド溶液で器官を固定し、ヘマトキシリン-エオシン染色¹⁹を行う。
2. 無傷の骨髄観察のための骨窓を作成するには、大腿骨または脛骨の両端を固定し、骨膜を露出させるために19G針の横端で皮質骨を削り取る。残留骨の薄い層を保つように注意してください。上述したようにDAPIおよびCy5チャネルを用いた反転蛍光共焦点顕微鏡でガラスと画像に面した窓とのカバースリップに骨を置きます。骨髄腔内の細胞および血管ネットワークは容易に観察することができる。

結果

10mL未満の灌流緩衝液の体積を保ちながら、8~10週齢マウスの腹部大動脈と下の大静脈のカヌレーションを通じて閉回路灌流システムを設置しました。 図3A は、Hoechst 33342およびDyLight 649-レクチンを含むリンガーの溶液で組織を浸透した後の共焦点画像を示す。筋肉、骨髄、精巣、膀胱、前立腺、足の皮膚は、効率的な核および血管染色を示す。 図3B...

ディスカッション

記載された回路は、様々な研究問題、例えば薬物送達における異なる血清成分および組織障壁の役割、または免疫および幹細胞の密売を調査するために使用することができる。異なる薬物送達システム(例えば、リポソームおよびナノ粒子)は、送達における生理学的および生化学的要因の役割を理解するためにパーフューザートに添加することができる。灌流の持続時間は、研究された組織?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light	Amscope	SKU: SM-3BZ-80S
Carbon dioxide, USP	Airgas healthcare	19087-5283
Confocal microscope	NIKON	ECLIPSE Ti2
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp	FIAB	F7244
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733692	Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733524	keep the chamber's temperature
Moist chamber with metal tube heat exchanger	Harvard Apparatus	732901	Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters	Fine Science Tools (FST)	125014
Oxygen compressed, USP	Airgas healthcare	C2649150AE06
Roller pump (part 4 in Figure 1)	Harvard Apparatus	730113	deliver perfusate to cannula in the moist chamber
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1)	Harvard Apparatus	732806	control the purfusion speed
Silicone pad	Harvard Apparatus
Silicone tubing set (arrows in Figure 1)	Harvard Apparatus (TYGON)	733456
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools (FST)	91100-12
Surgical Scissors	Fine Science Tools (FST)	14001-14
Table for moist chamber	Harvard Apparatus	734198
Thermocirculator (part 2 in Figure 1)	Harvard Apparatus	724927	circulating water bath for all water-jacketed components
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1)	Cole-Palmer	30600-02
Veterinary anesthesia machine	Highland	HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide needle	BD	305186	For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone
4-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427411
6-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427401
Filter (0.2 µm)	ThermoFisher	42225-CA	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Permanent marker	Staedtler	342-9
Syringe (10 mL)	Fisher Scientific	14-823-2E
Syringe (60 mL)	BD	309653	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Reagents
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5)	Sigma	314-13-6
10% buffered formalin	velleyvet	36692
BALB/c mice ( 8-10 weeks old )	Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution	EMRN Medical Supplies Inc.	JB2324
Bovine serum albumin	Thermo Fisher	11021-037
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue
DyLight-649-lectin	Vector Laboratories,Inc.	ZB1214
Ethanol (70% (vol/vol))	Pharmco	111000190
Hoechst33342	Life Technologies	H3570
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	66794-017-25
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023