마우스에서 하복부 장기 및 뒷다리의 시투 폐쇄 회로 관류 에 설립

요약

프로토콜은 방광, 전립선, 성기관, 뼈, 근육 및 발 피부를 포함한 마우스 하반신의 시상 수혈에 대해 설명된다.

초록

Ex 생체 내 관류는 고립 된 장기 (예 : 간, 신장)의 기능을 연구하는 중요한 생리적 도구입니다. 동시에, 마우스 장기의 작은 크기로 인해 뼈, 방광, 피부, 전립선 및 생식 기관의 전 생체 풍부는 도전적이거나 불가능합니다. 여기서, 우리는 상기 조직을 포함하는 마우스에 있는 시투 하체 관류 회로에서 처음으로 보고합니다, 그러나 주요 정리 기관 (신장, 간 및 비장)를 우회합니다. 회로는 상복부 대동맥과 정맥 위에 복부 대동맥과 열등한 베나 카바를 캔터링하고 말초 혈관을 소작함으로써 확립된다. 관류는 최대 2시간 동안 유지되는 난투류 흐름을 가진 연동 펌프를 통해 수행됩니다. 형광 렉틴 과 Hoechst 용액으로 시투 염색에서 마이크로 혈관이 성공적으로 침투된 것을 확인했습니다. 이 마우스 모형은 병리학적인 프로세스뿐만 아니라 약물 전달의 기계장치, 종양에서 종양 세포를 순환하는 이동/전이, 그리고 관전된 기관 및 조직과의 면역 계통의 상호 작용을 연구하기 위한 아주 유용한 공구일 수 있습니다.

서문

고립 된 기관 관류는 원래 이식^에대한 장기 생리학을 연구하기 위해 개발되었다^1,2,,3,다른 신체 시스템에서 간섭없이 장기의 기능에 대한 이해를 가능하게. 예를 들어, 고립 된 신장과 심장 관류는 혈역학의 기본 원리와 혈관 활성제의 효과를 이해하는 데 대단히 유용했지만, 간 관류는 건강하고 병은 조직^{4,,5,,6,,7에서}약물 대사를 포함한 대사 기능을 이해하는 데 중요했다. 또한, 관류 연구는 이식을 위한 장기의 생존력과 기능을 이해하는 데 중요했습니다. 암 연구에서, 고립 된 종양 관류는 마우스, 쥐 및 갓 절제 된 인간 조직을 사용하여 여러 그룹에 의해 설명되었다^8,,9. 일부 고립된 종양 관류에서, 종양은 난소 지방 패드에 이식되어 간질^{동맥(10)으로부터}혈관을 공급하는 종양의 성장을 강요했다. Jain 그룹은 종양 혈역학 및 전이를 이해하기 위해 결장 아데노시스종의 고립 된 관류를⁸사용하여 선구적인 연구를 수행^{8,11,,12,,13.} 다른 혁신적인 엔지니어링 된 ex vivo 설정은 주요 인간 다발성 골수종 세포^(14)를 배양하는 96 웰 플레이트 기반 관류 장치와 골수 아키텍처 및 기능 연구를 엔지니어링하기위한 모듈식 유동^{챔버를 포함한다.}

생리학 및 병리학 연구 이외에, 기관 관류는 약 납품의 기본 원리를 공부하기 위하여 이용되었습니다. 따라서, 한 그룹은 이식된^{육종16에서}분리된 쥐 사지 관류를 설명하고 리포솜의 축적을 연구한 반면, 다른 그룹은^{나노입자(17)의}내피 표적을 연구하기 위해 해부된 인간 신장 관류를 수행하였다. Ternullo 외. 가까운 생체 내 피부 약물 침투 모델로 고립 된 인체 피부 플랩을 사용 하 여^18.

큰 장기와 조직의 관류에 있는 이 발전에도 불구하고, 마우스에 있는 situ perfusion 모형에 에 아무 보고도 없었습니다: a) 간, 비장 및 신장과 같은 통관 기관을 우회합니다; b) 골반 장기를 포함, 피부, 근육, 생식 기관 (남성), 방광, 전립선과 골수. 이러한 장기의 작은 크기와 공급 혈관으로 인해, 전 생체 캐닝 및 관류 회로의 설립은 실현 가능하지 않았습니다. 마우스는 암 과 면역학 연구, 및 약물 전달에서 가장 중요한 동물 모델입니다. 작은 마우스 기관을 인퍼퓨즈하는 능력은 골반 (방광, 전립선, 난소, 골수)에 이식 된 종양을 포함하여 이러한 장기에 대한 약물 전달에 관한 흥미로운 질문뿐만 아니라 이러한 장기의 질병의 기본 생리학 및 면역학에 대한 연구를 허용합니다. 이 결핍을 해결하기 위하여는, 우리는 잠재적으로 조직 상해를 피할 수 있고 고립된 기관 관류 보다는 기능적인 연구에 훨씬 더 적합한 마우스에 있는 시투 관혈 회로를 개발했습니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법은 콜로라도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 관류 시스템을 예열

1. 도 1A의맞춤형 구성에 도시된 바와 같이 모든 수자 성분(난투저수지, 습한 챔버 및 뚜껑)에 대해 37°C 순환 수조를 시작하여 수술 전에 관류 시스템을 준비한다. 튜브가 깨끗하고 필요한 경우 교체하십시오. 난투 부피를 제한하려면, 난투 저수지로 습한 챔버 내에서 버블 트랩을 사용(도 1B-6).

2. 혈관 카테터라이제이시

1. 이소플루란 수의 마취기를 사용하여 8-10주 된 BALB/c 마우스에서 마취를 유도하여 3-5%의 이소플루란 및 산소 유량0.3 L/min에서 방출을 유도한다. 대안으로, 케타민 /자일라진 또는 다른 유형의 관음증을 사용하십시오. 발가락 핀치와 각막 반사 : 2 가지 방법으로 마취의 깊이를 평가합니다.
2. 4-0 실크 봉합사를 바늘로 두 번 증류한 물에 미리 웨트합니다.
3. 마취 된 마우스를 스티로폼 보드에 척추 위치에 놓고 머리가 외과 의사를 마주하고 앞다리와 뒷다리를 테이프로 고정하십시오. 이소 프로필 알코올로 복부를 닦고 가위로 "T"모양의 중간선을 따라 복부를 잘라냅니다. 전기 응고 (소작)에 의해 절개 가장자리 주위에 출혈을 중지합니다.
4. 복부 대동맥, 베나 카바, 일반적인 일리악 및 일리오룸바 동맥과 정맥을 드러내기 위해 복부의 오른쪽으로 위, 제주넘 및 결장.
5. 해부 현미경하에서, 찾아서 4-0 실크 봉합사를 사용하여 여성의 난소 동맥/정맥 및 일리오룸바 동맥/정맥에서 일리오룸바 동맥/정맥을 찾아리게한다(그림 2 노란 선).
6. 해부 현미경하에서, 복부 대동맥 과 열등한 베나 카바 아래에 있는 2개의 4-0 실크 봉합사(일강 동맥 및 정맥 위 약 1cm, 1mm 간격, 도 2)를반복하고, 일악 혈관에 가장 가까운 봉합사에서 느슨한 매듭을 만듭니다(그림2,흰색 점선). 또는 이 매듭에 6-0 실크 봉합사를 사용할 수 있습니다.
7. 해부 현미경의 밑에, 수평으로 정렬하고 포르트 아이길레와 열등한 베나 카바와 복부 대동맥 둘 다 스트레칭합니다. 24G 날개 차폐 I.V. 카테터를 사용하여 복부 대어타에 구멍을 뚫고 버튼을 눌러 바늘 코어를 철회하고 카테터를 용기에 약 5mm 삽입하십시오.
   1. 열등한 베나 카바를 가지고 동일한 절차를 반복하고 카테터화된 용기 주변에 두 봉합사의 매듭을 묶는다.
      참고 : 바늘은 혈관을 통해 쉽게 구멍을 뚫을 수 있습니다. 따라서 혈관을 뻗어 있고 바늘을 용기와 평행하게 유지하십시오. 바늘이 혈관안으로 약 1mm 침투하자마자 바늘 코어를 철회합니다. 복부 대자는 열등한 정맥 카바 아래에 있으며 결합 조직에 둘러싸여 있기 때문에 훨씬 얇고 탄성이 있습니다. 따라서, 대르타는 카테터에 "붙들"수 있으며, 따라서 카테터가 미끄러질 가능성을 줄이기 위해 베나 카바 전에 카테터를 카테터화해야 한다.
8. 즉시 접착제를 적용하여 카테터를 발기 척추에 고정시키고 복부 장기를 교체하고 마취를 유지하면서 수술을 종료합니다.
   참고: 복강으로 완전히 대체될 수 없는 장기는 관류 과정에서 관류 배지로 주기적으로 적축되어야 합니다.

3. 관류 시스템 설정

1. 마우스를 실리콘 패드의 37°C로 예동된 워터 재킷 습한 챔버로 옮기고 19G 바늘로 카테터 날개를 패드로 고정시합니다.
2. 동맥 카테터의 끝(입구)을 예동 관류 버퍼(링거의 젖산 용액이 5% BSA로 보충됨)로 채운 다음, 나사 온커넥터(그림 1B,빨간 화살표)를 사용하여 카테터 끝을 입구 관류 튜브와 연결합니다.
   참고: 카테터를 움직이지 않도록 커넥터를 용혈성 집게로 잡고 테이프로 튜브를 고정합니다.
3. 연동 유량을 0.6 mL/min으로 조정하고 관류유출(도 1B,파란색 화살표)을 5-10분 동안 열어 정맥 카테터를 통해 혈액을 씻어낸다. 콘센트 카테터에 혈전이 있을 것입니다. 관류 회로를 닫기 전에 응두부 버퍼로 혈전을 플러시합니다.
4. 정맥 카테터의 끝을 나사 온 커넥터를 사용하여 콘센트 튜브와 연결하여회로(그림 1B)를닫습니다. 이 시점에서_CO2 가스 안락사를 수행하고 흉부 천자 또는 기타 방법으로 확인하십시오.
5. 촉촉한 챔버를 따뜻하게 한 뚜껑으로 덮습니다. 주기적으로 퍼퓸 수준을 확인하고 필요한 경우 더 추가합니다. 관류는 최대 2시간 동안 수행될 수 있습니다.
   참고: 폐쇄된 관류 시스템을 설정하려면 5mL의 난투가 필요합니다. 누출이나 부종이 없는 경우, 난투의 부피가 1mL 미만으로 감소하고 추가 버퍼가 필요하지 않습니다. 말초 순환 혈전에 의해 유도된 부종을 피하기 위해, 0.002%의 헤파린을 함유한 관류 완충액은 관류의 처음 10분 동안 사용될 수 있지만, 절개 가장자리에서 누출을 피하기 위해 헤파린 없이 버퍼로 변경되어야 한다.
6. 필요한 경우, 언제든지 관류 저장소 또는 주입 포트에 선택의 시약을 추가(그림 1B-5). 예를 들어, 10 mg/mL Hoechst33342의 10 μL은 관류가 끝나기 전에 세포 핵 2h를 얼룩지게 하기 위해 난투에 첨가될 수 있으며, 또는 50 μL의 1 mg/mL DyLight 649-렉틴을 첨가하여 혈관 내피 세포를 30분 전에 염색할 수 있다.
   참고: Hoechst 용액으로 골수를 더럽히기 위해 마우스를 수술 30분 전에 미리 주입해야 합니다.
7. 형광 시약이 풍부해진 후, 배경 형광을 최소화하기 위해 10 분 동안 관혈 버퍼로 씻어 내보도록하십시오.

4. 인연기관의 분석

1. 고환, 전립선, 방광, 대퇴골, 근육 및 피부 (예 : 발)를 포함한 장기를 수집합니다. 약 1mm^3의 오르간 조각을 소비하고 두 개의 유리 슬라이드 사이에 평평하게합니다.
   1. DAPI/Cy5 여기 및 방출 필터를 사용하여 반전형 형광 공초점 현미경하에서 연구 (흥분 레이저 : DAPI, 405 nm; Cy5,640 nm). 0.45 숫자 조리개와 함께 최소 200배 배율 목표를 사용합니다.
   2. 또는, 24시간 포름알데히드 용액4%로 장기를 수정하고 헤마톡시린-에신 염색^19를수행한다.
2. 그대로 골수 관찰을위한 뼈 창을 만들려면, 대퇴골 또는 경골의 양쪽 끝을 고정하고 19 G 바늘의 측면 가장자리로 피질 뼈를 긁어 내어 음경을 노출합니다. 잔류 뼈의 얇은 층을 유지하기 위해주의하십시오. 위에서 설명한 대로 DAPI 및 Cy5 채널을 사용하여 반전된 형광 공초점 현미경으로 유리와 이미지를 향한 창이 있는 덮개 슬립에 뼈를 놓습니다. 골수 구멍의 세포 및 혈관 망을 쉽게 관찰할 수 있다.

결과

우리는 10mL 미만의 관류 완충제의 양을 유지하면서 8-10 주 된 마우스의 복부 대자와 열등한 정맥 카바의 캔레이션을 통해 폐쇄 회로 관류 시스템을 설정합니다. 그림 3A는 Hoechst 33342 및 DyLight 649-lectin을 포함하는 링거의 솔루션으로 조직을 인응한 후 공초점 이미지를 보여줍니다. 근육, 골수, 고환, 방광, 전립선 및 발 피부는 효율적인 핵 및 혈관 염색을 보여줍니다.

토론

설명된 회로는 각종 연구 질문, 예를 들어 약물 전달에 있는 상이한 혈청 성분 및 조직 장벽의 역할, 또는 면역 및 줄기 세포 밀매를 탐구하기 위하여 이용될 수 있다. 상이한 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜 및 나노입자)은 전달에서 생리학적 및 생화학적 인자의 역할을 이해하기 위해 서두자에 첨가될 수 있다. 관류의 지속 기간은 연구 된 조직, 과학적 목표 및 perfusate의 구성에 따라 다를 수 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light	Amscope	SKU: SM-3BZ-80S
Carbon dioxide, USP	Airgas healthcare	19087-5283
Confocal microscope	NIKON	ECLIPSE Ti2
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp	FIAB	F7244
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733692	Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733524	keep the chamber's temperature
Moist chamber with metal tube heat exchanger	Harvard Apparatus	732901	Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters	Fine Science Tools (FST)	125014
Oxygen compressed, USP	Airgas healthcare	C2649150AE06
Roller pump (part 4 in Figure 1)	Harvard Apparatus	730113	deliver perfusate to cannula in the moist chamber
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1)	Harvard Apparatus	732806	control the purfusion speed
Silicone pad	Harvard Apparatus
Silicone tubing set (arrows in Figure 1)	Harvard Apparatus (TYGON)	733456
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools (FST)	91100-12
Surgical Scissors	Fine Science Tools (FST)	14001-14
Table for moist chamber	Harvard Apparatus	734198
Thermocirculator (part 2 in Figure 1)	Harvard Apparatus	724927	circulating water bath for all water-jacketed components
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1)	Cole-Palmer	30600-02
Veterinary anesthesia machine	Highland	HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide needle	BD	305186	For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone
4-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427411
6-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427401
Filter (0.2 µm)	ThermoFisher	42225-CA	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Permanent marker	Staedtler	342-9
Syringe (10 mL)	Fisher Scientific	14-823-2E
Syringe (60 mL)	BD	309653	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Reagents
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5)	Sigma	314-13-6
10% buffered formalin	velleyvet	36692
BALB/c mice ( 8-10 weeks old )	Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution	EMRN Medical Supplies Inc.	JB2324
Bovine serum albumin	Thermo Fisher	11021-037
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue
DyLight-649-lectin	Vector Laboratories,Inc.	ZB1214
Ethanol (70% (vol/vol))	Pharmco	111000190
Hoechst33342	Life Technologies	H3570
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	66794-017-25
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023