הקמת מעגל באתרו של איברי הבטן התחתונה וגפיים האחוריות בעכברים

Summary

פרוטוקול מתואר על הפרזיה באתרו של גוף העכבר התחתון, כולל שלפוחית השתן, הערמונית, איברי מין, עצם, שרירים ועור כף הרגל.

Abstract

לשעבר vivo זלוף הוא כלי פיזיולוגי חשוב כדי ללמוד את הפונקציה של איברים מבודדים (למשל, הכבד, הכליות). באותו זמן, בשל הגודל הקטן של איברי העכבר, לשעבר vivo זלוף של העצם, שלפוחית השתן, העור, הערמונית, ואיברי הרבייה הוא מאתגר או לא ריאלי. כאן, אנו מדווחים בפעם הראשונה בתוך מעגל באתרו התחתון הגוף בתוך עכברים הכולל את הרקמות הנ ל, אבל עוקף את איברי הסיווג הראשי (כליות, כבד, טחול). המעגל מבוסס על ידי canנולגאת אבי העורקים הבטני ואת הווריד הנחותים והוריד מעל עורק כסל וריד ומצרוב כלי דם היקפיים. פרזיה מבוצעת באמצעות משאבה פריסטטית עם זרימה מעשית הנשמרת עד 2 שעות. בשנת באתרו עם הפלורסנט לקטין ופתרון הואכסט אישר כי המיקרו-בלטורה בוצעה בהצלחה. מודל זה של העכבר יכול להיות כלי שימושי מאוד לחקר תהליכים פתולוגיים, כמו גם מנגנונים של משלוח התרופה, הגירה/גרורות של במחזור תאים סרטניים לתוך/מתוך הגידול, ואינטראקציות של מערכת החיסון עם איברים ורקמות מבשם.

Introduction

האיבר הבודד זלוף פותחה במקור כדי ללמוד פיזיולוגיה איברים עבור השתלת^1,2,3, ו הבנה מאופשר של פונקציות של האיברים ללא הפרעות ממערכות גוף אחרות. לדוגמה, כליה בודדה ופרפיוז הלב היה שימושי מאוד להבנת עקרונות בסיסיים של הומודינמיקה והשפעות של סוכני vasoactive, בעוד זלוף הכבד היה חשוב להבין את תפקוד חילוף החומרים, כולל מטבוליזם הסמים ברקמה בריאה וחולה^4,5,6,7. בנוסף, מחקרי פרזיה היו קריטיים בהבנת הכדאיות ותפקוד האיברים המיועדים להשתלה. ב מחקר הסרטן, מבודד זלוף הגידול תוארה על ידי מספר קבוצות באמצעות העכבר, עכברוש, ו מרקמות האדם טרי resected^8,9. ב מסוימים perfusion הגידול בודד, הגידול היה מושתל במשטח שומן השחלה כדי לכפות את התפתחותם של הגידול המספק כלי דם מעורק מצע המעי¹⁰. הקבוצה הג ביצעה לימודי חלוצי באמצעות זלוף מבודדים של המעי הגס אדנוקרצינומות כדי להבין הומודינמיקה הגידול גרורות^8,11,12,13. הגדרות אחרות vivo ex הנדסה לשעבר כוללים 96 התקן זלוף מבוסס על הצלחת לתרבות האדם הראשי מיאלומה נפוצה תאים¹⁴ ו תא זרימה מודולרי לאדריכלות מח עצם הנדסה ומחקר פונקציה¹⁵.

בנוסף לחקר הפיזיולוגיה והפתולוגיה, שימש העוגב לחקר העקרונות הבסיסיים של אספקת סמים. כך, קבוצה אחת תיאר בודד הגפיים האיבר מבודדים ולמד הצטברות של ליפוזומים בסרקומות¹⁶מושתל, בעוד קבוצה אחרת ביצע את זלוף הכליה האנושית כדי ללמוד את המיקוד האנדותל של חלקיקים¹⁷. טרנוללו ואח ' השתמשו בכנף עור אנושית מבודדת כvivo מדגם של מודל¹⁸.

למרות הפיתוחים הללו בפרזיה של איברים גדולים ורקמות, לא היו דיווחים על מודלים באתרו של היתוך בעכברים כי: a) לעקוף את אברי הסיווג כגון כבד, טחול וכליות; ב) כוללים איברי אגן, עור, שריר, איברי הרבייה (בזכר), שלפוחית השתן, מח העצם והערמונית. בשל הגודל הקטן של האברים הללו והזנת המערכת, הצינורית הvivo לשעבר והקמתה של מעגל פרפיוז לא היתה אפשרית. העכבר הוא מודל החיות החשוב ביותר בחקר הסרטן והאימונולוגיה, ומסירת סמים. היכולת של איברי עכבר קטנים לאפשר שאלות מעניינות לגבי מסירת סמים לאיברים אלה, כולל גידולים מושתלים באגן (שלפוחית השתן, ערמונית, שחלה, מח עצם), להיות נענה, כמו גם מחקרים של פיזיולוגיה בסיסית ואימונולוגיה של מחלות של איברים אלה. כדי לענות על מחסור זה, פיתחנו מעגל באתרו בתוך עכברים שעלולים למנוע פגיעה ברקמות, והוא הרבה יותר מתאים למחקר פונקציונלי מאשר פרזיה איברים מבודדים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת קולורדו ולהשתמש בוועדה (IACUC).

1. לחמם מראש את מערכת ההיתוך

1. הכינו את מערכת הפרפיוז לפני הניתוח על-ידי הפעלת מקלחת מים ב37 ° c עבור כל הרכיבים בעלי מכסה המים (מאגר לחות, תא לח וכסוי) כפי שמוצג בתצורה מותאמת אישית באיור 1A. ודא שאבובים נקי ולהחליף במידת הצורך. כדי להגביל את נפח השימוש, השתמש במלכודת בועה בתוך תא לח כמאגר המים (איור 1B-6).

2. צנתור כלי דם

1. לגרום הרדמה ב-8-10 בשבוע הישן BALB/c העכבר באמצעות מכונת הרדמה וטרינרית isofלאנה עם 3-5% isof, ושיעור זרימת החמצן ב 0.3 L/min. כחלופה, השתמש קטמין/xylazine או כל סוג אחר של הרדמה בתוך הצפק. להעריך את עומק ההרדמה על ידי 2 שיטות: לצבוט הבוהן רפלקס המצמוץ.
2. להרטיב המשי תפר 4-0 עם מחט במים כפולים מזוקקים.
3. מניחים את העכבר מורדם במיקום פרקדן על לוח קלקר עם הראש מול המנתח ומשתק את הגפיים האחוריות עם קלטת. לנגב את הבטן עם אלכוהול איזופרופילי ולחתוך את הבטן לאורך קו האמצע בצורת "T" עם מספריים. הפסיקו לדמם מסביב לקצה החתך על ידי האלקטרוקרישת (הקאוזציה).
4. לדחוף את הבטן, מעי ונקודתיים בצד ימין של הבטן כדי לחשוף את אבי העורקים הבטני, הבנה קאווה, ואת העורקים הנפוצים כסל ו iliol, וורידים.
5. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, למצוא ולאתר את העורק הליאולרומבה/וריד בזכר, השחלות עורק/וריד ועורק iliolרומבה/וריד בנקבה באמצעות 4-0 בתפרים משי (איור 2 קווים צהובים).
6. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לולאה 2 4-0 משי תפרים מתחת העורקים הבטן והוריד הראשי הנחותים (כ 1 ס מ מעל עורק כסל והווריד, 1 מ"מ בנפרד, איור 2), ולעשות קשר רופף בתפר הקרוב ביותר ספינות כסל (איור 2, לבנים מנוקד קו). לחילופין, תפר משי 6-0 יכול לשמש לקשר זה.
7. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, ליישר אופקית ולמתוח הן את העורק הנחותים ואת אבי העורקים הבטני עם פורט-אייגיללה. השתמש 24 G כנפיים מסוכך קטטר אינפוזיה לנקב את אב העורקים הבטן, ללחוץ על הכפתור כדי למשוך את ליבת המחט ולהכניס את הצנתר על 5 מ"מ לתוך כלי.
   1. חזור על אותו ההליך עם הורד המטה הנחות ולקשור קשרים של שני תפרים סביב כלי הצנתור.
      הערה: המחט יכולה לנקב בקלות דרך כלי הדם; לכן, שמרו על הכלים מתוחים ומחטים מקבילים לכלי. למשוך את ליבת המחט ברגע המחט חודר על 1 מ"מ לתוך כלי. העורקים הבטני הוא מתחת לבנה קאווה נחותים הרבה יותר רזה ואלסטי יותר בשל היותו עטוף רקמת חיבור. לכן, העורקים יכול "להחזיק" על הצנתר, ולכן צריך להיות צנתור לפני האובקאווה כדי להפחית את הסבירות של הקטטר לחמוק.
8. החלת דבק מיידי כדי לשתק את הקטטרים של האריקטור spinae, להחליף את איברי הבטן, ולסיים את הניתוח תוך שמירה על ההרדמה.
   הערה: איברים שאינם יכולים להיות מוחלפים לחלוטין בחלל הבטן יצטרכו להיות לחלח באופן תקופתי במדיום הפרפיוז במהלך תהליך הפרזיה.

3. הגדר את המערכת הפרפיוז

1. העבר את העכבר לחדר לחות המים כיסה מראש עד 37 ° c על משטח סיליקון והשתק את כנפי הקטטר אל הלוח עם 19 מחטים G.
2. למלא את הקצה של קטטר העורקים (כניסת) עם מאגר פרהפיוז מראש (תמיסת לקטט של צלצול בתוספת 5% bsa), ולאחר מכן לחבר את קצה הקטטר עם אבובים זלוף באמצעות מחבר בורג (איור 1b, חץ אדום).
   הערה: החזק את המחבר עם מלקחיים הומוסטטי והשתק את האבובים באמצעות הקלטת כדי להימנע מהזזת הקטטרים.
3. כוונן את קצב הזרימה הפריסטטי ל-0.6 mL/min ושמור על זרימה יוצאת (איור 1B, חץ כחול) פתוח הסתיים עבור 5-10 דקות כדי לשטוף את הדם דרך צנתר הורידים. יהיו כמה קרישי דם בצנתר השקע; לרוקן את הקרישי דם עם מאגר מבשם לפני סגירת מעגל זלוף.
4. לחבר את הקצה של קטטר ורידי עם אבובים שקע באמצעות מחבר בורג על מנת לסגור את המעגל (איור 1B). בשלב זה, לבצע₂ גז המתת חסד ולוודא על ידי ניקוב החזה או כל שיטה אחרת.
5. כסו את החדר הלח עם המכסה החומם. בדוק את רמת האופן מעת לעת והוסף יותר במידת הצורך. ניתן לבצע את perfusion עד 2 שעות.
   הערה: 5 מ ל של מבשם יהיה צורך להקים את מערכת הפרפיוז הסגורה. אם אין דליפה או בצקת, נפח הדרך יהיה ירידה בפחות מ-1 מ ל ומאגר נוסף לא יהיה צורך. כדי למנוע בצקת שנגרמה על ידי הטרובוס היקפי מחזורי, מאגר זלוף המכיל 0.002% הפארין ניתן להשתמש ב -10 דקות הראשונות של הפרזיה, אבל יש לשנות כדי לאגור ללא הפארין כדי למנוע את הדליפה בקצה החתכים.
6. במקרה הצורך, הוסיפו את האפשרות הכימית לתוך מאגר ההיתוך או ליציאת ההזרקה בכל עת (איור 1ב -5). לדוגמה, 10 μL של 10 מ"ג/mL Hoechst33342 ניתן להוסיף לתוך המיבשם להכתים את גרעיני התא 2 h לפני סוף perfusion, או 50 μL של 1 מ"ג/mL DyLight 649-lectin כדי להכתים את התאים של כלי הדם האנדותל מזערי לפני סוף perfusion.
   הערה: אם מנסים להכתים את מח העצם עם פתרון הואכסט, עכברים יצטרכו להיות מוזרק מראש 30 דקות לפני הניתוח.
7. לאחר זלוף עם ריאגנטים פלורסנט, לשטוף עם מאגר זלוף במשך 10 דקות נוספות כדי למזער את הזריחה הרקע.

4. ניתוח איברים

1. איסוף איברים כולל ביקורות, ערמונית, שלפוחית השתן, עצם הירך, שריר, ועור (למשל, רגליים). בלו חתיכת איבר על 1 מ"מ³ ומשטח בין שתי שקופיות זכוכית.
   1. מחקר מתחת למיקרוסקופ פלורסנט הפוך באמצעות DAPI/Cy5 עירור ומסנני פליטה (עירור לייזרים: DAPI, 405 ננומטר; Cy5, 640 ננומטר). השתמש לפחות במטרה להגדלה של 200x עם מיפתח מספרי 0.45.
   2. לחילופין, לתקן את האיברים עם 4% פורמלדהיד פתרון עבור 24 שעות ולבצע המטאוקסילין-אאוזין כתמים¹⁹.
2. כדי ליצור חלון עצם עבור התבוננות מח עצם שלמים, לשתק את שני הקצוות של עצם הירך או השוקה ולגרד את העצם קליפת המוח עם הקצה לרוחב של המחט G 19 כדי לחשוף את הקרום; לדאוג לשמור על שכבה דקה של עצם שיורית. עצם מניחים על מכסה כיסוי עם החלון מול זכוכית ותמונה עם מיקרוסקופ הפוכה קונפוקלית וקד באמצעות dapi ו Cy5 ערוצי כפי שמתואר לעיל. התאים והרשת כלי הדם בחלל מח העצם ניתן להבחין בקלות.

תוצאות

הגדרת מערכת היתוך מעגל סגור באמצעות צינורית של אבי העורקים הבטן ואת האובקאווה הנחותים של 8-10 שבוע עכברים הישן תוך שמירה על נפח של מאגר זלוף פחות מ 10 mL. איור 3A מראה תמונות מיקוד לאחר מבשם רקמות עם הפתרון של הכפיל המכיל Hoechst 33342 ו dylight 649-לקטין. שריר, מח עצם, ביקורות, שלפוחית השתן, ?...

Discussion

המעגל המתואר ניתן להשתמש כדי לחקור שאלות מחקר שונות, למשל את התפקיד של מרכיבי סרום שונים מחסומי רקמות באספקת סמים, או החיסונית והגזע הסחר בתאים. ניתן להוסיף מערכות שונות לאספקת סמים (למשל, ליפוזומים וחלקיקים) כדי להבין את התפקיד של גורמים פיזיולוגיים וביוכימיים במסירה. משך הפרזיה יכול להש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light	Amscope	SKU: SM-3BZ-80S
Carbon dioxide, USP	Airgas healthcare	19087-5283
Confocal microscope	NIKON	ECLIPSE Ti2
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp	FIAB	F7244
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733692	Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733524	keep the chamber's temperature
Moist chamber with metal tube heat exchanger	Harvard Apparatus	732901	Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters	Fine Science Tools (FST)	125014
Oxygen compressed, USP	Airgas healthcare	C2649150AE06
Roller pump (part 4 in Figure 1)	Harvard Apparatus	730113	deliver perfusate to cannula in the moist chamber
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1)	Harvard Apparatus	732806	control the purfusion speed
Silicone pad	Harvard Apparatus
Silicone tubing set (arrows in Figure 1)	Harvard Apparatus (TYGON)	733456
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools (FST)	91100-12
Surgical Scissors	Fine Science Tools (FST)	14001-14
Table for moist chamber	Harvard Apparatus	734198
Thermocirculator (part 2 in Figure 1)	Harvard Apparatus	724927	circulating water bath for all water-jacketed components
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1)	Cole-Palmer	30600-02
Veterinary anesthesia machine	Highland	HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide needle	BD	305186	For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone
4-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427411
6-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427401
Filter (0.2 µm)	ThermoFisher	42225-CA	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Permanent marker	Staedtler	342-9
Syringe (10 mL)	Fisher Scientific	14-823-2E
Syringe (60 mL)	BD	309653	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Reagents
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5)	Sigma	314-13-6
10% buffered formalin	velleyvet	36692
BALB/c mice ( 8-10 weeks old )	Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution	EMRN Medical Supplies Inc.	JB2324
Bovine serum albumin	Thermo Fisher	11021-037
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue
DyLight-649-lectin	Vector Laboratories,Inc.	ZB1214
Ethanol (70% (vol/vol))	Pharmco	111000190
Hoechst33342	Life Technologies	H3570
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	66794-017-25
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023