Farelerde Alt Karın Organları nın ve Arka Ekstremitelerin Situ Kapalı Devre Perfüzyonunun Oluşturulması

Özet

Bir protokol mesane, prostat, cinsel organlar, kemik, kas ve ayak derisi de dahil olmak üzere fare alt vücut, yerinde perfüzyon için açıklanmıştır.

Özet

Ex vivo perfüzyon izole organların işlevini incelemek için önemli bir fizyolojik araçtır (örneğin karaciğer, böbrekler). Aynı zamanda, fare organlarının küçük boyutu nedeniyle, kemik ex vivo perfüzyon, mesane, cilt, prostat, ve üreme organları zor ya da mümkün değildir. Burada, ilk kez yukarıdaki dokuları içeren farelerde bir in situ alt vücut perfüzyon devresi rapor, ancak ana temizleme organları atlar (böbrek, karaciğer, ve dalak). Devre iliak arter ve ven üzerinde abdominal aort ve inferior vena kava cannulating ve periferik kan damarları cauterizing tarafından kurulur. Perfüzyon perfusate akışı ile peristaltik bir pompa ile yapılır 2 saate kadar. Floresan lektin ve Hoechst çözeltisi ile yerinde boyama mikrovaskülatür başarıyla perfüzyon olduğunu doğruladı. Bu fare modeli patolojik süreçlerin yanı sıra ilaç dağıtım mekanizmaları, tümör içine / tümör den dolaşımdaki tümör hücrelerinin göç / metastaz ve perfüzyon organ ve dokular ile bağışıklık sisteminin etkileşimleri incelemek için çok yararlı bir araç olabilir.

Giriş

İzole organ perfüzyonu ilk olarak^organfizyolojisi 1^,2,3olmak üzere geliştirilmiş ve diğer vücut sistemlerinden müdahale edilmeden organların fonksiyonlarının anlaşılmasını sağlamıştır. Örneğin, izole böbrek ve kalp perfüzyonu hemodinamik ve vazoaktif ajanların etkileri nin temel ilkelerini anlamada son derece yararlı oldu, karaciğer perfüzyonu metabolik fonksiyonu anlamak için önemli olduğu ise, sağlıklı ve hastalıklı doku ilaç metabolizması da dahil olmak üzere^4,5,6,7. Buna ek olarak, perfüzyon çalışmaları transplantasyon alabilme amaçlı organların canlılığını ve işlevini anlamada kritik öneme sahip oldu. Kanser Researchearch yılında, izole tümör perfüzyon fare kullanarak çeşitli gruplar tarafından tarif edilmiştir, sıçan, ve taze rezeke insan dokuları^8,9. Bazı izole tümör perfüzyon, tümör mezenter arter¹⁰kan damarları temin eden tümörün büyümesini zorlamak için yumurtalık yağ pedi implante edildi. Jain grubu tümör hemodinamik ve metastaz^anlamakiçin kolon adenokarsinomların izole perfüzyon kullanarak öncü çalışmalar yaptı 8^,11,12,13. Diğer yenilikçi mühendislik ex vivo kurulumları kültür birincil insan multipl miyelom hücreleri¹⁴ ve mühendislik kemik iliği mimarisi ve fonksiyon araştırma¹⁵için modüler bir akış odası için 96-iyi plaka tabanlı perfüzyon cihazı içerir.

Fizyoloji ve patoloji çalışmalarının yanı sıra, organ perfüzyonu ilaç dağıtımının temel ilkelerini incelemek için de kullanılmıştır. Böylece, bir grup izole sıçan ekstremite perfüzyonu açıklanan ve implante sarkomlarda lipozombirikimi okudu¹⁶, başka bir grup nano tanecikleri endotel hedefleme çalışması için insan böbrek perfüzyon diseksiyon yapıldı¹⁷. Ternullo ve ark. yakın-in-in vivo cilt ilaç penetrasyon modeli olarak izole perfüzyon insan deri flep kullanılır¹⁸.

Büyük organ ve dokuların perfüzyonbu gelişmelere rağmen, farelerde situ perfüzyon modellerinde hiçbir rapor olmuştur: a) karaciğer, dalak ve böbrekler gibi sızma temizleme organları; b) pelvik organlar, deri, kas, üreme organları (erkek), mesane, prostat ve kemik iliği içerir. Bu organların küçük boyutu ve temin vaskülatür nedeniyle, ex vivo kanülasyon ve perfüzyon devresi kurulması mümkün olmamıştır. Fare kanser ve immünoloji araştırmalarında en önemli hayvan modeli, ve ilaç teslim. Küçük fare organları perfuse yeteneği bu organlara ilaç teslimi ile ilgili ilginç sorular sağlayacak, pelvis implante tümörler de dahil olmak üzere (mesane, prostat, yumurtalık, kemik iliği), cevaplanması, yanı sıra temel fizyoloji ve bu organların hastalıkların immünoloji çalışmaları. Bu eksikliği gidermek için, farelerde doku yaralanmasını önleyebilecek ve izole organ perfüzyonuna göre fonksiyonel araştırmalar için çok daha uygun olan bir in situ perfüzyon devresi geliştirdik.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler Colorado Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Perfüzyon sistemini önceden ısıtın

1. Şekil 1A'daözelleştirilmiş bir konfigürasyonda gösterildiği gibi tüm su ceketli bileşenler (perfusate rezervuar, nemli hazne ve kapak) için 37 °C sirkülasyon su banyosu başlatarak ameliyattan önce perfüzyon sistemini hazırlayın. Tüpün temiz olduğundan emin olun ve gerekirse değiştirin. Perfusate hacmini sınırlamak için, perfusate rezervuarı olarak nemli bir hazne içinde bir kabarcık kapanı kullanın(Şekil 1B-6).

2. Vasküler kateterizasyon

1. 8-10 haftalık BALB/c faresinde %3-5 izofluran ve oksijen akış hızı 0,3 L/dk olan bir isofluran veteriner anestezi makinesi kullanarak anestezi yi tirin. Alternatif olarak ketamin/ksilazin veya başka bir intraperitoneal anestezi türünü kullanın. Anestezinin derinliğini 2 yöntemle değerlendirin: ayak ucutu ve kornea refleksi.
2. Önceden 4-0 ipek dikiş ile iğne ile çift distile suda.
3. Anestezili fareyi, başı cerraha bakacak şekilde strafor tahtasıüzerinde bir supine pozisyonda yerleştirin ve ön uvsi ve arka uzuvları bantla hareketsiz hale getirin. Isopropil alkol ile karın silin ve makas ile bir "T" şeklinde orta hat boyunca karın kesti. Elektrokoagülasyon (koterizasyon) ile kesi kenarına doğru kanamayı durdurun.
4. Karın aort ortaya çıkarmak için karın sağ tarafına mide, jejunum ve kolon itin, vena kava, ve yaygın iliak ve iliolombbar arterler ve damarlar.
5. Bir diseksiyon mikroskobu altında, bulmak ve erkek iliolombbar arter / ven, ve yumurtalık arter / ven ve kadın iliolombbar arter / ven kullanarak 4-0 ipek sütür(Şekil 2 sarı çizgiler).
6. Bir diseksiyon mikroskobu altında, abdominal aort ve inferior vena kava altında iki 4-0 ipek dikişdöngü (iliak arter ve ven üzerinde yaklaşık 1 cm, 1 mm arayla, Şekil 2), ve iliak damarlara en yakın dikiş gevşek bir düğüm yapmak(Şekil 2, beyaz noktalı çizgi). Alternatif olarak, bir 6-0 ipek dikiş bu düğüm için kullanılabilir.
7. Bir diseksiyon mikroskobu altında, yatay hizalamak ve porte-aiguille ile hem inferior vena kava ve abdominal aort germek. Karın aortuna saplamak için 24 G kanatlı i.V. kateter kullanın, iğne çekirdeğini geri çekmek için düğmeye basın ve kateteri damara yaklaşık 5 mm takın.
   1. Inferior vena kava ile aynı işlemi tekrarlayın ve kateterize damarların etrafında her iki sütür düğümkadar kravat.
      NOT: İğne kolayca kan damarı ile delinebilir; bu nedenle, damarları gerilmiş ve iğne damar ile paralel tutun. İğne yaklaşık 1 mm'lik damara girer girmez iğne çekirdeğini geri çekin. Abdominal aort inferior vena kava altında ve çok daha ince ve daha elastik nedeniyle bağ dokusu kaplı olması. Bu nedenle, aort kateter "tutun" ve böylece kateter kayma olasılığını azaltmak için vena kava önce kateterize edilmelidir.
8. Kateterleri erector spinae'ye hareketsiz hale getirmek için anlık tutkal uygulayın, karın organlarını değiştirin ve anesteziyi sürdürürken ameliyatı sonlayın.
   NOT: Karın boşluğuna tamamen değiştirilemeyen organların perfüzyon işlemi sırasında perfüzyon ortamı ile periyodik olarak nemlendirilmesi gerekir.

3. Perfüzyon sistemini kurmak

1. Fareyi silikon ped üzerinde 37 °C'ye ısıtılan su ceketli nemli hazneye aktarın ve kateter kanatlarını 19 G iğneyle pede yerleştirin.
2. Arteriyel kateterin ucunu (giriş) önceden ısınmış perfüzyon tamponuyla doldurun (Ringer'ın laktat çözeltisi %5 BSA ile desteklenir) ve ardından kateter ucunu vidalı konektör kullanarak giriş perfüzyon borusuyla bağlayın(Şekil 1B, kırmızı ok).
   NOT: Konektörü hemostatik forceps ile tutun ve kateterlerin hareket etmesini önlemek için tüpü bantla hareketsiz hale getirin.
3. Peristaltik akış hızını 0,6 mL/dk'ya ayarlayın ve perfüzyon çıkışını(Şekil 1B, mavi ok) 5-10 dakika açık uçlu tutun venöz kateterden kanı temizleyin. Çıkış kateterinde pıhtılar olacak; perfüzyon devresini kapatmadan önce pıhtıları perfusate tamponu ile dışarı atın.
4. Venöz kateterin ucunu vidalı konektör kullanarak çıkış borusu ile bağlayın ve devreyi kapatın(Şekil 1B). Bu noktada, CO₂ gaz ötenazi yapmak ve göğüs delinmesi veya başka bir yöntemle doğrulayın.
5. Isıtılmış kapak ile nemli haznesini kapatın. Perfusate düzeyini periyodik olarak kontrol edin ve gerekirse daha fazlasını ekleyin. Perfüzyon 2 saate kadar yapılabilir.
   NOT: Kapalı perfüzyon sistemini kurmak için 5 mL perfusat eki gerekecektir. Sızıntı veya ödem yoksa perfusat hacmi 1 mL'den az azalır ve ek tampon gerekmez. Periferik sirkülasyon trombüsünün neden olduğu ödemi önlemek için perfüzyonun ilk 10 dakikasında %0.002 heparin içeren perfüzyon tamponu kullanılabilir, ancak kesilerin kenarında sızıntıyı önlemek için heparin olmadan tampon olarak değiştirilmelidir.
6. Gerekirse, perfüzyon rezervuarına veya enjeksiyon portuna herhangi bir zamanda tercih edilen bir reaktif ekleyin(Şekil 1B-5). Örneğin, perfüzyon bitmeden önce hücre çekirdeğini 2 saat veya perfüzyon un bitiminden 30 dakika önce vasküler endotel hücrelerini lekelemek için 1 mg/mL DyLight 649-lektin 50 μL'lik 10 mg/mL Hoechst33342'nin 10 μL'si perfusata eklenebilir.
   NOT: Kemik iliği ile Hoechst solüsyonu lekelemeye çalışılırsa, farelere ameliyattan 30 dakika önce önceden enjekte edilmesi gerekir.
7. Floresan reaktifler ile perfüzyon sonra, arka plan floresan en aza indirmek için başka bir 10 dakika perfüzyon tampon ile yıkayın.

4. Perfüzyon organlarının analizi

1. Testis, prostat, mesane, uyluk kemiği, kas ve deri (örneğin, ayak) gibi organları toplayın. Yaklaşık 1 mm³ organ bir parça excise ve iki cam slaytlar arasında düzleştirin.
   1. DAPI/Cy5 uyarma ve emisyon filtrelerini kullanarak ters floresan konfokal mikroskop altında çalışma (uyarma lazerleri : DAPI, 405 nm; Cy5,640 nm). 0,45 sayısal diyafram açıklığı ile en az 200x büyütme hedefi kullanın.
   2. Alternatif olarak, 24 saat için% 4 formaldehit çözeltisi ile organları düzeltmek ve hematoksilin-eozin boyama^{gerçekleştirmek 19}.
2. Bozulmamış kemik iliği gözlemi için bir kemik penceresi oluşturmak için, femur veya tibia her iki ucunu immobilize ve periost ortaya çıkarmak için bir 19 G iğne lateral kenarı ile kortikal kemik kazımak; kalıntı kemik ince bir tabaka tutmaya özen. Yukarıda açıklandığı gibi DAPI ve Cy5 kanallarını kullanarak ters floresan konfokal mikroskopla cam ve görüntüye bakan pencere ile bir kapak fişinin üzerine kemik yerleştirin. Kemik iliği boşluğundaki hücreler ve vasküler ağ kolayca gözlemlenebilir.

Sonuçlar

Perfüzyon tamponunun hacmini 10 mL'den az tutarken abdominal aort ve 8-10 haftalık farelerin inferior vena kavasının kanülasyonu ile kapalı devre perfüzyon sistemi kurduk. Şekil 3A, Ringer'ın Hoechst 33342 ve DyLight 649-lektin içeren çözeltisi ile dokuları perfüzyonladıktan sonra konfokal görüntüler gösterir. Kas, kemik iliği, testis, mesane, prostat ve ayak derisi etkili nükleer ve vasküler boyama göstermektedir. Şekil 3B, normothermik ...

Tartışmalar

Açıklanan devre çeşitli araştırma sorularını araştırmak için kullanılabilir, örneğin ilaç dağıtımında farklı serum bileşenleri ve doku bariyerlerinin rolü, ya da bağışıklık ve kök hücre ticareti. Farklı ilaç dağıtım sistemleri (örneğin, lipozomlar ve nano tanecikleri) teslimatta fizyolojik ve biyokimyasal faktörlerin rolünü anlamak için perfusata eklenebilir. Perfüzyon süresi, incelenen doku, bilimsel hedefler ve perfusat bileşimine bağlı olarak değişebilir. Ringer'ın lakta...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light	Amscope	SKU: SM-3BZ-80S
Carbon dioxide, USP	Airgas healthcare	19087-5283
Confocal microscope	NIKON	ECLIPSE Ti2
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp	FIAB	F7244
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733692	Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733524	keep the chamber's temperature
Moist chamber with metal tube heat exchanger	Harvard Apparatus	732901	Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters	Fine Science Tools (FST)	125014
Oxygen compressed, USP	Airgas healthcare	C2649150AE06
Roller pump (part 4 in Figure 1)	Harvard Apparatus	730113	deliver perfusate to cannula in the moist chamber
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1)	Harvard Apparatus	732806	control the purfusion speed
Silicone pad	Harvard Apparatus
Silicone tubing set (arrows in Figure 1)	Harvard Apparatus (TYGON)	733456
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools (FST)	91100-12
Surgical Scissors	Fine Science Tools (FST)	14001-14
Table for moist chamber	Harvard Apparatus	734198
Thermocirculator (part 2 in Figure 1)	Harvard Apparatus	724927	circulating water bath for all water-jacketed components
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1)	Cole-Palmer	30600-02
Veterinary anesthesia machine	Highland	HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide needle	BD	305186	For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone
4-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427411
6-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427401
Filter (0.2 µm)	ThermoFisher	42225-CA	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Permanent marker	Staedtler	342-9
Syringe (10 mL)	Fisher Scientific	14-823-2E
Syringe (60 mL)	BD	309653	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Reagents
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5)	Sigma	314-13-6
10% buffered formalin	velleyvet	36692
BALB/c mice ( 8-10 weeks old )	Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution	EMRN Medical Supplies Inc.	JB2324
Bovine serum albumin	Thermo Fisher	11021-037
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue
DyLight-649-lectin	Vector Laboratories,Inc.	ZB1214
Ethanol (70% (vol/vol))	Pharmco	111000190
Hoechst33342	Life Technologies	H3570
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	66794-017-25
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023