Etablierung von In Situ Closed Circuit Perfusion von unteren Bauchorganen und Hinterbeinen bei Mäusen

Zusammenfassung

Ein Protokoll wird für die In-situ-Perfusion des Unterkörpers der Maus beschrieben, einschließlich der Blase, der Prostata, der Geschlechtsorgane, des Knochens, des Muskels und der Fußhaut.

Zusammenfassung

Ex-vivo-Perfusion ist ein wichtiges physiologisches Werkzeug, um die Funktion isolierter Organe (z. B. Leber, Nieren) zu untersuchen. Gleichzeitig ist die Ex-vivo-Perfusion von Knochen, Blase, Haut, Prostata und Fortpflanzungsorganen aufgrund der geringen Größe der Mausorgane eine Herausforderung oder nicht machbar. Hier berichten wir zum ersten Mal von einem In-situ-Unterkörper-Perfusionskreislauf bei Mäusen, der die oben genannten Gewebe umfasst, aber die wichtigsten Clearance-Organe (Niere, Leber und Milz) umgeht. Der Kreislauf wird durch Konserven der Abdominalaorta und der unteren Vena cava über der Iliasarterie und Vene und kauterisierenden peripheren Blutgefäßen hergestellt. Die Perfusion erfolgt über eine peristaltische Pumpe mit Perfusatenstrom, der bis zu 2 h gehalten wird. Die In-situ-Färbung mit fluoreszierendem Lektin und der Hoechst-Lösung bestätigte, dass die Mikrovaskulatur erfolgreich durchdrungen wurde. Dieses Mausmodell kann ein sehr nützliches Werkzeug für die Untersuchung pathologischer Prozesse sowie Mechanismen der Medikamentenabgabe, Migration/Metastasierung zirkulierender Tumorzellen in/aus dem Tumor und Wechselwirkungen des Immunsystems mit durchsetzten Organen und Geweben sein.

Einleitung

Isolierte Organperfusion wurde ursprünglich entwickelt, um Organphysiologie für Transplantation^1,2,3zu studieren und ermöglichte das Verständnis der Funktionen der Organe ohne Störungen durch andere Körpersysteme. Zum Beispiel, isolierte Nieren- und Herzperfusion war immens nützlich für das Verständnis der Grundprinzipien der Hämodynamik und Der Wirkung von vasoaktiven Wirkstoffen, während Leberperfusion war wichtig, um die metabolische Funktion zu verstehen, einschließlich Desarzneimittelstoffwechsel in gesundem und krankem Gewebe^4,5,6,7. Darüber hinaus waren Perfusionsstudien entscheidend für das Verständnis der Lebensfähigkeit und Funktion von Organen, die für die Transplantation bestimmt sind. In Cancer Researchearch wurde die isolierte Tumorperfusion von mehreren Gruppen mit Maus, Ratte und frisch resektierten menschlichen Geweben^{beschrieben 8,9}. Bei einer isolierten Tumorperfusion wurde der Tumor in das Eierstockfettpad implantiert, um das Wachstum von Tumoren zu erzwingen, die Blutgefäße aus der mesentery arterienden¹⁰versorgen. Die Jain-Gruppe führte bahnbrechende Studien mit isolierter Perfusion von Darmadenokarzinomen durch, um Tumorhämodynamik und Metastasen^8,11,12,13zu verstehen. Weitere innovative Ex-vivo-Setups sind ein 96-Well-Platten-basiertes Perfusionsgerät zur Kultur der primären menschlichen Multiple-Myelom-Zellen¹⁴ und eine modulare Durchflusskammer für die technische Knochenmarkarchitektur und Funktionsforschung¹⁵.

Neben Physiologie- und Pathologiestudien wurde die Organperfusion verwendet, um die Grundprinzipien der Medikamentenabgabe zu untersuchen. So beschrieb eine Gruppe die isolierte Rattengliederperfusion und untersuchte die Anhäufung von Liposomen bei implantierten Sarkomen¹⁶, während eine andere Gruppe eine sezierte menschliche Nierenperfusion durchführte, um die endotheliale Ausrichtung von Nanopartikeln zu untersuchen¹⁷. Ternullo et al. verwendeten eine isolierte perfundierte menschliche Hautklappe als nah in vivo^{HautarzneimittelPenetrationsmodell 18}.

Trotz dieser Fortschritte bei der Durchblutung großer Organe und Gewebe, gab es keine Berichte über In-situ-Perfusionsmodelle bei Mäusen, die: a) Bypass-Clearance-Organe wie Leber, Milz und Nieren; b) Beckenorgane, Haut, Muskel, Fortpflanzungsorgane (männlich), Blase, Prostata und Knochenmark. Aufgrund der geringen Größe dieser Organe und der zuliefernden Vaskulatur war eine Ex-vivo-Kanülierung und der Aufbau eines Perfusionskreislaufs nicht möglich. Die Maus ist das wichtigste Tiermodell in der Krebs- und Immunologieforschung und der Medikamentenabgabe. Die Fähigkeit, kleine Mausorgane zu durchdringen, würde es ermöglichen, interessante Fragen bezüglich der Medikamentenabgabe an diese Organe zu beantworten, einschließlich zu Tumoren, die in das Becken implantiert wurden (Blase, Prostata, Eierstock, Knochenmark), sowie Studien über grundlegende Physiologie und Immunologie von Erkrankungen dieser Organe. Um diesen Mangel zu beheben, haben wir bei Mäusen einen In-situ-Perfusionskreislauf entwickelt, der möglicherweise Gewebeverletzungen vermeiden kann und sich viel besser für die funktionelle Forschung eignet als isolierte Organperfusion.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Colorado genehmigt.

1. Vorheizen des Perfusionssystems

1. Bereiten Sie das Perfusionssystem vor der Operation vor, indem Sie ein 37 °C zirkulierendes Wasserbad für alle wasserummantelten Komponenten (Perfusatenreservoir, feuchte Kammer und Deckel) starten, wie in einer benutzerdefinierten Konfiguration in Abbildung 1Adargestellt. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch sauber ist und ersetzen Sie ihn bei Bedarf. Um das Perfusatenvolumen zu begrenzen, verwenden Sie eine Blasenfalle in einer feuchten Kammer als Perfusatenreservoir (Abbildung 1B-6).

2. Gefäßkatheterisierung

1. Induzieren Sie anästhesie in einer 8-10 Wochen alten BALB/c-Maus mit einer Isofluran-Veterinäranästhesiemaschine mit 3-5% Isofluran und Sauerstoffdurchfluss rate bei 0,3 l/min. Als Alternative verwenden Sie Ketamin/Xylazin oder jede andere Art der intraperitonealen Anästhesie. Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie mit 2 Methoden: Zehen-Pinch und Hornhautreflex.
2. Eine 4-0 Seidennaht mit Nadel in doppelt destilliertem Wasser vorbefeuchten.
3. Legen Sie die anästhesierte Maus in eine Supine-Position auf einem Styropor-Brett mit dem Kopf zum Chirurgen und immobilisieren Forelimbs und Hinterbeine mit Klebeband. Wischen Sie den Bauch mit Isopropylalkohol ab und schneiden Sie den Bauch entlang der Mittellinie mit einer Schere in eine "T"-Form. Stoppen Sie das Bluten um den Rand des Schnittes durch Elektrokoagulation (kauterisierend).
4. Drücken Sie den Magen, Jejunum und Dickdarm auf die rechte Seite des Bauches, um die Bauchaorta, Vena cava, und gemeinsame Ilias und Iliolumbar Arterien und Venen zu offenbaren.
5. Unter einem Dissektionsmikroskop finden und ligagen Sie die Iliolumbar-Arterie/Vene im Männchen, und Eierstockarterie/Vene und die Iliolumbar-Arterie/Vene beim Weibchen mit 4-0 Seidennähten(Abbildung 2 gelbe Linien).
6. Unter einem Seziermikroskop zwei 4-0 Seidennähte unter der Bauchaorta und der unteren Vena cava (ca. 1 cm über Iliasarterie und Vene, 1 mm auseinander, Abbildung 2) schleifen und einen lockeren Knoten in der Naht machen, die den Iliasgefäßen am nächsten ist (Abbildung 2, weiß gepunktete Linie). Alternativ kann für diesen Knoten eine 6-0 Seidennaht verwendet werden.
7. Unter einem Seziermikroskop, horizontal ausrichten und dehnen sowohl die untere Vena cava und die Bauchaorta mit Porte-Aiguille. Verwenden Sie einen 24 G geflügelten geschirmten I.V. Katheter, um die Bauchaorta zu durchstechen, drücken Sie die Taste, um den Nadelkern zurückzuziehen und setzen Sie den Katheter etwa 5 mm in das Gefäß ein.
   1. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren mit dem unteren Vena cava und binden Sie Knoten beider Nähte um die katheterisierten Gefäße.
      HINWEIS: Die Nadel kann leicht durch das Blutgefäß punktieren; halten Sie daher die Gefäße gestreckt und Nadel parallel zum Gefäß. Ziehen Sie den Nadelkern zurück, sobald die Nadel etwa 1 mm in das Gefäß eindringt. Die Bauchaorta ist unter der unteren Vena cava und viel dünner und elastischer, da sie in Bindegewebe eingehüllt ist. Daher kann die Aorta am Katheter "festhalten" und sollte daher vor der Vena cava katheterisiert werden, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass der Katheter ausrutscht.
8. Tragen Sie Sofortkleber auf, um die Katheter auf die Erector Spinae zu immobilisieren, ersetzen Sie die Bauchorgane, und beenden Sie die Operation unter Beibehaltung der Anästhesie.
   HINWEIS: Organe, die nicht vollständig in die Bauchhöhle ersetzt werden können, müssen während des Perfusionsprozesses regelmäßig mit Perfusionsmedium befeuchtet werden.

3. Einrichten des Perfusionssystems

1. Übertragen Sie die Maus in die wasserummantelte Feuchtkammer, die auf einem Siliziumpad auf 37 °C vorgewärmt ist, und schimbaren Sie die Katheterflügel mit 19 G Nadeln auf das Pad.
2. Füllen Sie das Ende des arteriellen Katheters (Einlass) mit einem vorgewärmten Perfusionspuffer (Ringers Laktatlösung ergänzt durch 5% BSA), und verbinden Sie dann das Katheterende mit dem Einlassperfusionsschlauch über einen Schraubverbinder(Abbildung 1B, roter Pfeil).
   HINWEIS: Halten Sie den Stecker mit hämostatischen Zangen und immobilisieren Sie die Schläuche mit Klebeband, um eine Verschiebung der Katheter zu vermeiden.
3. Stellen Sie den peristaltischen Durchfluss auf 0,6 ml/min ein und halten Sie den Perfusionsabfluss(Abbildung 1B, blauer Pfeil) für 5-10 min offen, um das Blut durch den Venenkatheter auszuwaschen. Es wird einige Gerinnsel im Auslasskatheter geben; Spülen Sie die Gerinnsel mit Perfusatenpuffer, bevor Sie den Perfusionskreislauf schließen.
4. Schließen Sie das Ende des Venenkatheters mit dem Auslassschlauch über einen Schraubanschluss an, um die Schaltung zu schließen (Abbildung 1B). Führen Sie an₂ dieser Stelle CO2-Gas-Euthanasie durch und überprüfen Sie durch Brustpunktion oder eine andere Methode.
5. Bedecken Sie die feuchte Kammer mit dem erwärmten Deckel. Überprüfen Sie regelmäßig den Perfusate-Pegel, und fügen Sie bei Bedarf weitere hinzu. Die Perfusion kann bis zu 2 Stunden lang durchgeführt werden.
   HINWEIS: 5 ml Perfusat werden benötigt, um das geschlossene Perfusionssystem einzurichten. Wenn es keine Leckaden oder Ödeme gibt, verringert sich das Volumen von Perfusate um weniger als 1 ml und ein zusätzlicher Puffer wird nicht benötigt. Um Ödeme zu vermeiden, die durch peripheren zirkulierenden Thrombus induziert werden, kann der Perfusionspuffer, der 0,002% Heparin enthält, in den ersten 10 Minuten der Perfusion verwendet werden, sollte jedoch in Puffer ohne Heparin geändert werden, um das Auslaufen am Rand der Einschnitte zu vermeiden.
6. Falls erforderlich, fügen Sie jederzeit ein Reagenz der Wahl in das Perfusionsreservoir oder den Injektionsanschluss ein (Abbildung 1B-5). Zum Beispiel können 10 l von 10 mg/ml Hoechst33342 in die Perfusate aufgenommen werden, um die Zellkerne 2 h vor dem Ende der Perfusion zu färben, oder 50 l von 1 mg/ml DyLight 649-lectin, um die vaskulären Endothelzellen 30 min vor dem Ende der Perfusion zu färben.
   HINWEIS: Wenn Sie versuchen, Knochenmark mit Hoechst-Lösung zu färben, müssen Mäuse 30 Minuten vor der Operation vorinjiziert werden.
7. Nach perfusion mit fluoreszierenden Reagenzien weitere 10 Minuten mit Perfusionspuffer auswaschen, um die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren.

4. Analyse von durchgeflossenen Organen

1. Sammeln Sie Organe wie Hoden, Prostata, Blase, Oberschenkelknochen, Muskel und Haut (z. B. Füße). Ein Stück Orgel ca. 1 mm³ verbrauchen und zwischen zwei Glasrutschen abflachen.
   1. Studie unter invertiertem fluoreszierendem Konfokalmikroskop mit DAPI/Cy5-Anregungs- und Emissionsfiltern (Anregungslaser : DAPI, 405 nm; Cy5.640 nm). Verwenden Sie mindestens 200x Vergrößerungsobjektiv mit einer 0,45 numerischen Blende.
   2. Alternativ können Sie die Organe mit 4% Formaldehydlösung für 24 h fixieren und Hämatoxylin-Eosin-Färbung¹⁹durchführen.
2. Um ein Knochenfenster für intakte Knochenmarkbeobachtung zu erstellen, immobilisieren Sie beide Enden des Oberschenkelknochens oder Tibia und kratzen Sie den kortikalen Knochen mit der seitlichen Kante einer 19 G Nadel weg, um das Periost freizulegen; achten Sie darauf, eine dünne Schicht Restknochen zu halten. Legen Sie den Knochen auf einen Deckelzettel mit dem Fenster zum Glas und das Bild mit invertiertem fluoreszierendem konfokaren Mikroskop mit DAPI- und Cy5-Kanälen, wie oben beschrieben. Die Zellen und das Gefäßnetz in der Knochenmarkhöhle können leicht beobachtet werden.

Ergebnisse

Wir richten ein geschlossenes Leitungsperfusionssystem durch Konkavulation der Bauchaorta und der unteren Vena cava von 8-10 Wochen alten Mäusen ein, während das Volumen des Perfusionspuffers weniger als 10 ml bleibt. Abbildung 3A zeigt konfokale Bilder nach dem Durchdringenden von Geweben mit Ringer-Lösung, die Hoechst 33342 und DyLight 649-lectin enthält. Muskel-, Knochenmark-, Hoden-, Blasen-, Prostata- und Fußhaut zeigen eine effiziente Kern- und Gefäßfärbung.

Diskussion

Der beschriebene Kreislauf kann verwendet werden, um verschiedene Forschungsfragen zu untersuchen, zum Beispiel die Rolle verschiedener Serumkomponenten und Gewebebarrieren bei der Medikamentenabgabe oder Immun- und Stammzellhandel. Verschiedene Arzneimittelabgabesysteme (z.B. Liposomen und Nanopartikel) können dem Perfusate hinzugefügt werden, um die Rolle physiologischer und biochemischer Faktoren bei der Abgabe zu verstehen. Die Dauer der Perfusion kann variieren, abhängig von dem untersuchten Gewebe, wissenschaftl...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light	Amscope	SKU: SM-3BZ-80S
Carbon dioxide, USP	Airgas healthcare	19087-5283
Confocal microscope	NIKON	ECLIPSE Ti2
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp	FIAB	F7244
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733692	Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733524	keep the chamber's temperature
Moist chamber with metal tube heat exchanger	Harvard Apparatus	732901	Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters	Fine Science Tools (FST)	125014
Oxygen compressed, USP	Airgas healthcare	C2649150AE06
Roller pump (part 4 in Figure 1)	Harvard Apparatus	730113	deliver perfusate to cannula in the moist chamber
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1)	Harvard Apparatus	732806	control the purfusion speed
Silicone pad	Harvard Apparatus
Silicone tubing set (arrows in Figure 1)	Harvard Apparatus (TYGON)	733456
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools (FST)	91100-12
Surgical Scissors	Fine Science Tools (FST)	14001-14
Table for moist chamber	Harvard Apparatus	734198
Thermocirculator (part 2 in Figure 1)	Harvard Apparatus	724927	circulating water bath for all water-jacketed components
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1)	Cole-Palmer	30600-02
Veterinary anesthesia machine	Highland	HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide needle	BD	305186	For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone
4-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427411
6-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427401
Filter (0.2 µm)	ThermoFisher	42225-CA	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Permanent marker	Staedtler	342-9
Syringe (10 mL)	Fisher Scientific	14-823-2E
Syringe (60 mL)	BD	309653	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Reagents
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5)	Sigma	314-13-6
10% buffered formalin	velleyvet	36692
BALB/c mice ( 8-10 weeks old )	Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution	EMRN Medical Supplies Inc.	JB2324
Bovine serum albumin	Thermo Fisher	11021-037
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue
DyLight-649-lectin	Vector Laboratories,Inc.	ZB1214
Ethanol (70% (vol/vol))	Pharmco	111000190
Hoechst33342	Life Technologies	H3570
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	66794-017-25
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023