Establecimiento de la perfusión de circuito cerrado en situ de órganos abdominales inferiores y extremidades traseras en ratones

Resumen

Se describe un protocolo para la perfusión in situ de la parte inferior del cuerpo del ratón, incluyendo la vejiga, la próstata, los órganos sexuales, los huesos, los músculos y la piel del pie.

Resumen

La perfusión ex vivo es una herramienta fisiológica importante para estudiar la función de los órganos aislados (por ejemplo, hígado, riñones). Al mismo tiempo, debido al pequeño tamaño de los órganos de ratón, la perfusión ex vivo de hueso, vejiga, piel, próstata y órganos reproductivos es desafiante o no factible. Aquí, informamos por primera vez un circuito de perfusión del cuerpo inferior in situ en ratones que incluye los tejidos anteriores, pero pasa por alto los principales órganos de aclaramiento (riñón, hígado y bazo). El circuito se establece cannulando la aorta abdominal y la vena cava inferior por encima de la arteria ilíaca y la vena y cauterizando los vasos sanguíneos periféricos. La perfusión se realiza a través de una bomba peristáltica con flujo de perfusión mantenido hasta 2 h. La tinción in situ con lectina fluorescente y solución de Hoechst confirmó que la microvasculatura se perfundió con éxito. Este modelo de ratón puede ser una herramienta muy útil para el estudio de procesos patológicos, así como mecanismos de administración de fármacos, migración/metástasis de células tumorales circulantes hacia/desde el tumor, e interacciones del sistema inmunitario con órganos y tejidos perfundidos.

Introducción

La perfusión de órganos aislados fue desarrollada originalmente para estudiar la fisiología de órganos para el trasplante^1,2,3, y permitió la comprensión de las funciones de los órganos sin interferencia de otros sistemas del cuerpo. Por ejemplo, la perfusión aislada de riñón y corazón fue inmensamente útil para comprender los principios básicos de la hemodinámica y los efectos de los agentes vasoactivos, mientras que la perfusión hepática era importante para entender la función metabólica, incluido el metabolismo de fármacos en tejidos sanos y enfermos^4,,5,,6,,7. Además, los estudios de perfusión fueron fundamentales para comprender la viabilidad y la función de los órganos destinados al trasplante. En Cancer Researchearch, la perfusión tumoral aislada ha sido descrita por varios grupos que utilizan ratón, rata y tejidos humanos recién resecados^8,,9. En alguna perfusión tumoral aislada, el tumor se implantó en la almohadilla de grasa del ovario para forzar el crecimiento del tumor que suministra los vasos sanguíneos de la arteria mesenteria¹⁰. El grupo Jain realizó estudios pioneros utilizando perfusión aislada de adenocarcinomas de colon para entender la hemodinámica tumoral y metástasis^8,11,12,13. Otras configuraciones innovadoras de ingeniería ex vivo incluyen un dispositivo de perfusión basado en placas de 96 pozos para cultivar las células de mieloma múltiple humanas primarias¹⁴ y una cámara de flujo modular para la ingeniería de arquitectura de médula ósea y la investigación de funciones^15.

Además de los estudios de fisiología y patología, la perfusión de órganos se ha utilizado para estudiar los principios básicos de la administración de fármacos. Así, un grupo describió la perfusión aislada de las extremidades de las ratas y estudió la acumulación de liposomas en sarcomas implantados^16,mientras que otro grupo realizó perfusión renal humana diseccionada para estudiar la focalización endotelial de nanopartículas¹⁷. Ternullo et al. utilizaron un colgajo de piel humana perfundido aislado como un modelo de penetración de fármacos de piel cercano a in vivo¹⁸.

A pesar de estos avances en la perfusión de grandes órganos y tejidos, no ha habido informes sobre modelos de perfusión in situ en ratones que: a) bypassen órganos aclaradores como hígado, bazo y riñones; b) incluir órganos pélvicos, piel, músculo, órganos reproductivos (en hombres), vejiga, próstata y médula ósea. Debido al pequeño tamaño de estos órganos y a la vasculatura suministradora, la cannulación ex vivo y el establecimiento de un circuito de perfusión no han sido factibles. El ratón es el modelo animal más importante en la investigación del cáncer y la inmunología, y la administración de medicamentos. La capacidad de perfunden pequeños órganos de ratón permitiría responder preguntas interesantes sobre la administración de fármacos a estos órganos, incluidos los tumores implantados en la pelvis (vejiga, próstata, ovario, médula ósea), así como estudios de fisiología básica e inmunología de enfermedades de estos órganos. Para abordar esta deficiencia, desarrollamos un circuito de perfusión in situ en ratones que potencialmente puede evitar lesiones tisulares y es mucho más adecuado para la investigación funcional que la perfusión de órganos aislados.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Colorado.

1. Precaliente el sistema de perfusión

1. Preparar el sistema de perfusión antes de la cirugía iniciando un baño de agua circulante de 37oC para todos los componentes con camisa de agua (reservorio perfundido, cámara húmeda y tapa) como se muestra en una configuración personalizada en la Figura 1A. Asegúrese de que el tubo esté limpio y sustitúyalo si es necesario. Para limitar el volumen de perfuto, utilice una trampa de burbujas dentro de una cámara húmeda como el depósito de perfusión (Figura 1B-6).

2. Cateterismo vascular

1. Inducir anestesia en un ratón BALB/c de 8-10 semanas de edad utilizando una máquina de anestesia veterinaria isoflurano con 3-5% de isoflurano y caudal de oxígeno a 0,3 L/min. Como alternativa, utilice ketamina/xilazina o cualquier otro tipo de anestesia intraperitoneal. Evaluar la profundidad de la anestesia mediante 2 métodos: toe-pinch y reflejo corneal.
2. Prewet una sutura de seda 4-0 con aguja en agua doble destilada.
3. Coloque el ratón anestesiado en una posición supina sobre una placa de espuma de poliestireno con la cabeza mirando al cirujano e inmovilice las extremidades delanteras y traseras con cinta adhesiva. Limpie el abdomen con alcohol isopropílico y corte el abdomen a lo largo de la línea media en forma de "T" con tijeras. Deje de sangrar alrededor del borde de la incisión por electrocoagulación (cauterización).
4. Empuje el estómago, el yema y el colon hacia el lado derecho del abdomen para revelar la aorta abdominal, la vena cava y las arterias y venas iliacas e iliolumbar comunes.
5. Bajo un microscopio de disección, busque y liga la arteria/vena de iliolumbar en el macho, y la arteria/vena ovárica y la arteria/vena de iliolumbar en la hembra utilizando suturas de seda 4-0(Figura 2 líneas amarillas).
6. Bajo un microscopio de disección, en bucle dos suturas de seda 4-0 debajo de la aorta abdominal y vena cava inferior (aproximadamente 1 cm por encima de la arteria ilíaca y la vena, 1 mm de separación, Figura 2), y hacer un nudo suelto en la sutura más cercana a los vasos ilíacos (Figura 2, línea punteada blanca). Alternativamente, una sutura de seda 6-0 se puede utilizar para este nudo.
7. Bajo un microscopio de disección, alinee y estire horizontalmente tanto la vena cava inferior como la aorta abdominal con porte-aiguille. Utilice un catéter intravenoso blindado de 24 G para perforar la aorta abdominal, presione el botón para retraer el núcleo de la aguja e inserte el catéter unos 5 mm en el recipiente.
   1. Repita el mismo procedimiento con la vena cava inferior y ate nudos de ambas suturas alrededor de los vasos cateterizados.
      NOTA: La aguja puede perforar fácilmente a través del vaso sanguíneo; por lo tanto, mantener los vasos estirados y la aguja paralela con el recipiente. Retirar el núcleo de la aguja tan pronto como la aguja penetre aproximadamente 1 mm en el recipiente. La aorta abdominal está debajo de la vena cava inferior y mucho más delgada y elástica debido a estar envuelta en el tejido conectivo. Por lo tanto, la aorta puede "aferrarse" al catéter, y por lo tanto debe ser cateterizada antes de la vena cava para reducir la probabilidad de que el catéter se salga.
8. Aplicar pegamento instantáneo para inmovilizar los catéteres a la espina erédica, reemplazar los órganos abdominales y terminar la cirugía mientras se mantiene la anestesia.
   NOTA: Los órganos que no se pueden reemplazar por completo en la cavidad abdominal deberán humedecer periódicamente con un medio de perfusión durante el proceso de perfusión.

3. Configure el sistema de perfusión

1. Transfiera el ratón a la cámara húmeda con camisa de agua precalentada a 37 oC en una almohadilla de silicio e inmovilice las alas del catéter a la almohadilla con agujas de 19 G.
2. Llene el extremo del catéter arterial (entrada) con el tampón de perfusión precalentado (solución de lactato de Ringer complementada con 5% de BSA), y luego conecte el extremo del catéter con el tubo de perfusión de entrada utilizando un conector atornillado(Figura 1B,flecha roja).
   NOTA: Sujete el conector con fórceps hemostáticos e inmovilice el tubo con cinta adhesiva para evitar mover los catéteres.
3. Ajuste el caudal peristáltico a 0,6 ml/min y mantenga la salida de perfusión(Figura 1B,flecha azul) abierta durante 5-10 min para lavar la sangre a través del catéter venoso. Habrá algunos coágulos en el catéter de salida; eliminar los coágulos con tampón perfuma antes de cerrar el circuito de perfusión.
4. Conecte el extremo del catéter venoso con el tubo de salida utilizando un conector atornillado para cerrar el circuito (Figura 1B). En este punto, realizar la eutanasia de gas_CO2 y verificar por punción torácica o cualquier otro método.
5. Cubra la cámara húmeda con la tapa caliente. Compruebe el nivel de perfusión periódicamente y agregue más si es necesario. La perfusión se puede realizar durante un máximo de 2 horas.
   NOTA: Se necesitarán 5 ml de perfusate para configurar el sistema de perfusión cerrado. Si no hay fugas o edema, el volumen de perfusato disminuirá en menos de 1 ml y no se necesitará un tampón adicional. Para evitar el edema inducido por el trombo circulante periférico, el tampón de perfusión que contiene 0,002% de heparina se puede utilizar en los primeros 10 minutos de perfusión, pero debe cambiarse a tampón sin heparina para evitar la fuga en el borde de las incisiones.
6. Si es necesario, añada un reactivo de elección en el depósito de perfusión o en el puerto de inyección en cualquier momento(Figura 1B-5). Por ejemplo, se pueden añadir 10 ml de Hoechst33342 de 10 mg/ml de Hoechst33342 en el perfuso para manchar los núcleos celulares 2 h antes del final de la perfusión, o 50 ml de 1 mg/mllight 649-lectina para manchar las células enhelials vasculares 30 min antes del final de la perfusión.
   NOTA: Si intenta manchar la médula ósea con la solución de Hoechst, los ratones necesitarán ser pre-inyectados 30 minutos antes de la cirugía.
7. Después de la perfusión con reactivos fluorescentes, lave con tampón de perfusión durante otros 10 minutos para minimizar la fluorescencia de fondo.

4. Análisis de órganos perfundidos

1. Recoger órganos como testículos, próstata, vejiga, fémur, músculo y piel (por ejemplo, pies). Ex impuestos un pedazo de órgano de aproximadamente 1 mm³ y aplanar entre dos diapositivas de vidrio.
   1. Estudio bajo microscopio confocal fluorescente invertido utilizando filtros de excitación y emisión DAPI/Cy5 (láseres de excitación: DAPI, 405 nm; Cy5,640 nm). Utilice al menos un objetivo de ampliación de 200x con una apertura numérica de 0,45.
   2. Alternativamente, fijar los órganos con 4% de solución de formaldehído para 24 h y realizar la tinción de hematoxilina-eosina¹⁹.
2. Para crear una ventana ósea para la observación intacta de la médula ósea, inmovilice ambos extremos del fémur o la tibia y raspe el hueso cortical con el borde lateral de una aguja de 19 G para exponer el periosteum; tener cuidado de mantener una fina capa de hueso residual. Coloque el hueso en un resbalón de cubierta con la ventana orientada al vidrio y la imagen con microscopio confocal fluorescente invertido utilizando los canales DAPI y Cy5 como se describió anteriormente. Las células y la red vascular en la cavidad de la médula ósea se pueden observar fácilmente.

Resultados

Configuramos un sistema de perfusión de circuito cerrado a través de la cánula de la aorta abdominal y la vena cava inferior de ratones de 8-10 semanas de edad manteniendo el volumen de tampón de perfusión inferior a 10 ml. La Figura 3A muestra imágenes confocales después de perfumar tejidos con la solución de Ringer que contiene Hoechst 33342 y DyLight 649-lectina. El músculo, la médula ósea, los testículos, la vejiga, la próstata y la piel del pie muestran una tinción nuclear...

Discusión

El circuito descrito se puede utilizar para sondear varias preguntas de investigación, por ejemplo, el papel de diferentes componentes séricos y barreras tisulares en la administración de fármacos, o el tráfico inmune y de células madre. Se pueden añadir diferentes sistemas de administración de medicamentos (por ejemplo, liposomas y nanopartículas) al perfuso para comprender el papel de los factores fisiológicos y bioquímicos en el parto. La duración de la perfusión puede variar, dependiendo del tejido estud...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light	Amscope	SKU: SM-3BZ-80S
Carbon dioxide, USP	Airgas healthcare	19087-5283
Confocal microscope	NIKON	ECLIPSE Ti2
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp	FIAB	F7244
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733692	Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733524	keep the chamber's temperature
Moist chamber with metal tube heat exchanger	Harvard Apparatus	732901	Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters	Fine Science Tools (FST)	125014
Oxygen compressed, USP	Airgas healthcare	C2649150AE06
Roller pump (part 4 in Figure 1)	Harvard Apparatus	730113	deliver perfusate to cannula in the moist chamber
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1)	Harvard Apparatus	732806	control the purfusion speed
Silicone pad	Harvard Apparatus
Silicone tubing set (arrows in Figure 1)	Harvard Apparatus (TYGON)	733456
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools (FST)	91100-12
Surgical Scissors	Fine Science Tools (FST)	14001-14
Table for moist chamber	Harvard Apparatus	734198
Thermocirculator (part 2 in Figure 1)	Harvard Apparatus	724927	circulating water bath for all water-jacketed components
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1)	Cole-Palmer	30600-02
Veterinary anesthesia machine	Highland	HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide needle	BD	305186	For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone
4-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427411
6-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427401
Filter (0.2 µm)	ThermoFisher	42225-CA	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Permanent marker	Staedtler	342-9
Syringe (10 mL)	Fisher Scientific	14-823-2E
Syringe (60 mL)	BD	309653	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Reagents
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5)	Sigma	314-13-6
10% buffered formalin	velleyvet	36692
BALB/c mice ( 8-10 weeks old )	Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution	EMRN Medical Supplies Inc.	JB2324
Bovine serum albumin	Thermo Fisher	11021-037
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue
DyLight-649-lectin	Vector Laboratories,Inc.	ZB1214
Ethanol (70% (vol/vol))	Pharmco	111000190
Hoechst33342	Life Technologies	H3570
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	66794-017-25
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023