在小鼠中建立下腹部器官和后肢的原点闭路灌注

摘要

描述小鼠下半身的原位灌注，包括膀胱、前列腺、性器官、骨骼、肌肉和足部皮肤的原位灌注。

摘要

前活体灌注是研究分离器官（如肝脏、肾脏）功能的重要生理工具。同时，由于小鼠器官体积小，骨、膀胱、皮肤、前列腺和生殖器官的外体灌注具有挑战性或不可行。在这里，我们首次报告小鼠的原位下半身灌注回路，包括上述组织，但绕过主要清除器官（肾脏、肝脏和脾脏）。该回路通过将腹主动脉和劣质静脉冠状动脉和静脉上方以及烧灼外周血管进行开气和建立。灌注通过一个内皮泵进行，其灌注流量保持长达2小时。原位染色与荧光叶管和霍赫斯特溶液证实，微血管已成功覆盖。此小鼠模型是研究病理过程以及药物传递机制、循环肿瘤细胞进入/从肿瘤的迁移/转移以及免疫系统与扩散器官和组织相互作用的非常有用的工具。

引言

分离器官灌注最初是为了研究器官生理学移植^{1,1，2，3，,3}并使人们了解器官的功能，不受其他身体系统的干扰。例如，孤立的肾脏和心脏灌注在理解血液动力学的原理和血管活性剂的作用方面非常有用，而肝脏灌注对于理解代谢功能，包括健康和患病组织^{,4、5、6、75}中的药物^{46,代谢非常重要}。此外，灌注研究对于了解用于移植的器官的生存能力和功能至关重要。在癌症研究中，由几组使用小鼠、大鼠和新鲜切除的人体组织^8，9描述分离的^{肿瘤灌注9}。在一些孤立的肿瘤灌注中，肿瘤被植入卵巢脂肪垫，以迫使从肠动脉10供应血管的^肿瘤生长。Jain小组利用结肠腺癌的分离灌注进行开拓性研究，以了解肿瘤血流动力学和转移^8,8，11，12，13。^11,12,13其他创新工程外体设置包括一个96孔板为基础的灌注装置，培养初级人类多发性骨髓瘤细胞¹⁴和模块化流室工程骨髓架构和功能^研究15。

除了生理学和病理学研究，器官灌注还被用来研究药物输送的原理。因此，一组人描述了孤立的大鼠肢体灌注，并研究了植入肉瘤¹⁶中脂质体积累的，而另一组则进行了解剖人体肾脏灌注，以研究^{纳米粒子17}的内皮靶向。Ternullo等人使用一种孤立的渗透人体皮肤皮瓣作为接近体内皮肤药物渗透模型^18。

尽管在大型器官和组织灌注方面取得了这些进展，但还没有关于小鼠原位灌注模型的报告:（a） 绕过肝脏、脾脏和肾脏等清除器官;（a） 旁路清除器官，如肝脏、脾脏和肾脏;（a） 旁路清除器官，如肝脏、脾脏和肾脏;（a） 旁路清除器官，如肝脏、脾脏和肾脏;（a） 旁白器官;（a） 血液移植器官;（a） 血液灌注模型。（（b） 包括骨盆器官、皮肤、肌肉、生殖器官（男性）、膀胱、前列腺和骨髓。由于这些器官体积小，供应血管，外体可灌注和建立灌注电路不可行。小鼠是癌症和免疫学研究以及药物输送中最重要的动物模型。对小小鼠器官进行功能移植的能力将允许有关药物交付给这些器官的有趣问题，包括植入骨盆的肿瘤（膀胱、前列腺、卵巢、骨髓），以及这些器官疾病的基本生理学和免疫学研究。为了解决这个缺陷，我们在小鼠身上开发了一种原位灌注回路，可以避免组织损伤，比孤立的器官灌注更适合功能研究。

研究方案

此处描述的所有方法都已获得科罗拉多大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. 预热灌注系统

1. 手术前准备灌注系统，为所有水套组件（香水储液罐、湿室和盖子）启动一个 37°C 循环水浴，如图 1A中的定制配置所示。确保油管清洁，必要时更换。要限制润混量，请使用湿润室内的气泡陷阱作为润酸盐储液罐（图1B-6）。

2. 血管导管

1. 使用同氟体兽麻醉机在 8-10 周大的 BALB/c 小鼠中诱导麻醉，异氟兰和氧气流速为 0.3 L/min。作为替代物，使用氯胺酮/锡拉辛或任何其他类型的内丙酮麻醉。用两种方法评估麻醉深度:手趾捏和角膜反射。
2. 用双蒸馏水用针织出 4 - 0 的丝绸缝合线。
3. 将麻醉小鼠放在发泡胶板上的上角位置，头部朝向外科医生，用胶带固定前肢和后肢。用异丙醇擦拭腹部，用剪刀将腹部切入中线，以"T"形切割腹部。通过电凝（烧灼）停止切口边缘周围的出血。
4. 将胃、杰朱努姆和结肠推到腹部右侧，露出腹部主动脉、静脉卡瓦，以及常见的腹腔和腹腔动脉和静脉。
5. 在解剖显微镜下，使用 4-0 丝线（图2 黄线）在男性的卵巢动脉/静脉中查找和缝合男性的卵巢动脉/静脉和女性的牙周动脉/静脉。
6. 在解剖显微镜下，在腹部主动脉和劣质静脉下循环两个4-0丝状缝合线（约1厘米以上，比伊利亚克动脉和静脉，1毫米分开， 图2），并在最接近伊利亚克血管的缝合线中打一个松散的结（图2，白色虚线）。或者，6-0丝线可用于这个结。
7. 在解剖显微镜下，水平对齐和拉伸低劣的维纳卡瓦和腹部主动脉与波特-艾吉耶。使用 24 G 翼屏蔽 I.V. 导管刺穿腹部主动脉，按下按钮以收回针芯，并将导管插入约 5 mm 到容器中。
   1. 重复相同的程序与劣质的维纳卡瓦，并绑结的两个缝合围绕导管血管。
      注:针头很容易刺穿血管;因此，保持容器拉伸和针平行与容器。一旦针头穿透约 1 mm 到容器中，立即收回针芯。腹部主动脉在低劣的维纳卡瓦下，由于被包裹在结缔组织中，更薄、更有弹性。因此，大母可以"坚持"导管，因此应在道卡之前导管，以减少导管滑出的可能性。
8. 使用即时胶水固定导管直立人脊柱，更换腹部器官，并在保持麻醉的同时结束手术。
   注:在灌注过程中，不能完全更换到腹腔的器官需要定期用灌注介质进行润湿。

3. 设置灌注系统

1. 将鼠标转移到水套湿润室中，在硅垫上预热至 37 °C，用 19 G 针将导管翅膀固定到垫上。
2. 用预预热灌注缓冲液（Ringer 的乳酸溶液辅以 5% BSA）填充动脉导管的端（入口），然后使用螺丝上的连接器将导管端与入口灌注管连接（图1B，红色箭头）。
   注:用止血钳握住接头，用胶带固定管子，以避免移动导管。
3. 将近源流速调整至0.6 mL/min，并保持灌注流出（图1B，蓝色箭头）开限5-10分钟，通过静脉导管洗出血液。出口导管中会有一些血块;在关闭灌注回路之前，用灌注缓冲液冲洗出血块。
4. 使用螺钉上的连接器将静脉导管的端与出口管连接以关闭电路（图1B）。此时，执行_CO2气体安乐死，并验证胸部穿刺或任何其他方法。
5. 用加热盖盖住湿润的腔室。定期检查香水的级别，如果需要，请添加更多。灌注可进行长达2小时。
   注:设置封闭式灌注系统需要5 mL的灌注。如果没有泄漏或水肿，香水的体积将减少小于 1 mL，并且不需要额外的缓冲液。为避免周围循环血栓引起的水肿，在灌注前10分钟可使用含有0.002%肝素的灌注缓冲液，但应改为不含肝素的缓冲液，以避免切口边缘的泄漏。
6. 如果需要，可随时在灌注储液罐或注射口中加入选择试剂（图1B-5）。例如，10 μL的10mg/mL Hoechst33342可加入香水，在灌注结束前2小时染色细胞核，或50μL的1mg/mL DyLight 649-49-letin在灌注结束前30分钟染色血管内皮细胞。
   注:如果试图用 Hoechst 溶液染色骨髓，小鼠需要在手术前 30 分钟预注射。
7. 用荧光试剂灌注后，用灌注缓冲液再洗10分钟，以尽量减少背景荧光。

4. 对移植器官的分析

1. 收集器官，包括睾丸、前列腺、膀胱、股骨、肌肉和皮肤（如脚）。切除一块约1毫米3的^{器官，在两} 个玻璃滑梯之间平展。
   1. 使用DAPI/Cy5激发和发射滤波器（激发激光器:DAPI，405nm）在倒置荧光共物显微镜下研究;Cy5，640 nm）。使用至少 200 倍放大镜，具有 0.45 的数值孔径。
   2. 或者，用4%甲醛溶液固定器官24小时，并进行赤氧林-eosin染色^19。
2. 要创建一个骨窗，以进行完整的骨髓观察，固定股骨或头骨的两端，用19G针头的横向边缘刮去皮质骨，以暴露胸膜;注意保持一层薄薄的残骨。将骨骼放在盖滑上，窗户朝向玻璃，并使用倒置荧光共体显微镜使用倒置荧光共体显微镜，如上所述。骨髓腔中的细胞和血管网络很容易观察到。

结果

我们建立了闭路灌注系统，通过腹主动脉和8-10周大小鼠的劣质静脉灌注系统，同时保持灌注缓冲液的体积小于10 mL。 图 3A 显示了使用包含 Hoechst 33342 和 DyLight 649-lectin 的 Ringer 溶液对组织进行吸收后共和图像。肌肉，骨髓，睾丸，膀胱，前列腺和脚部皮肤显示有效的核和血管染色。 图3B 显示3小时正常热灌注后器官的血氧素-eosin染色。

讨论

所述电路可用于探究各种研究问题，例如不同血清成分和组织屏障在药物输送或免疫和干细胞贩运中的作用。不同的药物输送系统（如脂质体和纳米粒子）可以添加到香水中，以了解生理和生化因素在输送中的作用。灌注的持续时间可能会有所不同，具体取决于所研究的组织、科学目标和灌注的组成。我们在这里介绍灌注的结果长达2小时使用的基本灌注介质，包括林格的溶液与乳酸和白素。必须...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light	Amscope	SKU: SM-3BZ-80S
Carbon dioxide, USP	Airgas healthcare	19087-5283
Confocal microscope	NIKON	ECLIPSE Ti2
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp	FIAB	F7244
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733692	Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733524	keep the chamber's temperature
Moist chamber with metal tube heat exchanger	Harvard Apparatus	732901	Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters	Fine Science Tools (FST)	125014
Oxygen compressed, USP	Airgas healthcare	C2649150AE06
Roller pump (part 4 in Figure 1)	Harvard Apparatus	730113	deliver perfusate to cannula in the moist chamber
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1)	Harvard Apparatus	732806	control the purfusion speed
Silicone pad	Harvard Apparatus
Silicone tubing set (arrows in Figure 1)	Harvard Apparatus (TYGON)	733456
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools (FST)	91100-12
Surgical Scissors	Fine Science Tools (FST)	14001-14
Table for moist chamber	Harvard Apparatus	734198
Thermocirculator (part 2 in Figure 1)	Harvard Apparatus	724927	circulating water bath for all water-jacketed components
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1)	Cole-Palmer	30600-02
Veterinary anesthesia machine	Highland	HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide needle	BD	305186	For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone
4-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427411
6-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427401
Filter (0.2 µm)	ThermoFisher	42225-CA	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Permanent marker	Staedtler	342-9
Syringe (10 mL)	Fisher Scientific	14-823-2E
Syringe (60 mL)	BD	309653	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Reagents
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5)	Sigma	314-13-6
10% buffered formalin	velleyvet	36692
BALB/c mice ( 8-10 weeks old )	Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution	EMRN Medical Supplies Inc.	JB2324
Bovine serum albumin	Thermo Fisher	11021-037
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue
DyLight-649-lectin	Vector Laboratories,Inc.	ZB1214
Ethanol (70% (vol/vol))	Pharmco	111000190
Hoechst33342	Life Technologies	H3570
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	66794-017-25
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023