Création in situ de la perfusion en circuit fermé des organes abdominaux inférieurs et des membres postérieurs chez les souris

Résumé

Un protocole est décrit pour la perfusion in situ du bas du corps de la souris, y compris la vessie, la prostate, les organes sexuels, les os, les muscles et la peau du pied.

Résumé

La perfusion ex vivo est un outil physiologique important pour étudier la fonction des organes isolés (p. ex. foie, reins). Dans le même temps, en raison de la petite taille des organes de souris, la perfusion ex vivo des organes d’os, de vessie, de peau, de prostate, et de reproduction est difficile ou non faisable. Ici, nous rapportons pour la première fois un circuit in situ de perfusion inférieure du corps chez les souris qui inclut les tissus ci-dessus, mais contourne les organes principaux de dégagement (rein, foie, et rate). Le circuit est établi en canniler l’aorte abdominale et le vena cava inférieur au-dessus de l’artère et de la veine iliaques et en cautérisant les vaisseaux sanguins périphériques. La perfusion est effectuée par l’intermédiaire d’une pompe péristaltique avec débit perfusate maintenu jusqu’à 2 h. La coloration in situ avec la lectine fluorescente et la solution de Hoechst a confirmé que la microvasculature a été perfusée avec succès. Ce modèle de souris peut être un outil très utile pour étudier les processus pathologiques ainsi que les mécanismes de l’administration de médicaments, la migration / métastases des cellules tumorales circulantes dans / de la tumeur, et les interactions du système immunitaire avec des organes et des tissus perfusés.

Introduction

La perfusion d’organe isolé a été développée à l’origine pour étudier la physiologie d’organe pour la transplantation^1,2,3, et a permis la compréhension des fonctions des organes sans interférence d’autres systèmes de corps. Par exemple, la perfusion rénale et cardiaque isolée était extrêmement utile pour comprendre les principes de base de l’hémodynamique et les effets des agents vasoactifs, tandis que la perfusion hépatique était importante pour comprendre la fonction métabolique, y compris le métabolisme des médicaments dans les tissus sains et malades^4,5,6,7. En outre, les études de perfusion étaient critiques dans la compréhension de la viabilité et de la fonction des organes destinés à la transplantation. Dans cancer Researchearch, perfusion tumorale isolée a été décrite par plusieurs groupes utilisant la souris, le rat, et les tissus humains fraîchement réséqués^8,9. Dans une perfusion de tumeur isolée, la tumeur a été implantée dans le tampon de graisse d’ovaire pour forcer la croissance de la tumeur fournissant des vaisseaux sanguins de l’artère mésentery¹⁰. Le groupe Jain a effectué des études pionnières utilisant la perfusion isolée des adénocarcinomes du côlon pour comprendre l’hémodynamique tumorale et la métastase^8,11,12,13. D’autres configurations ex vivo innovantes comprennent un dispositif de perfusion à base de plaques de 96 puits pour la culture des cellules primaires du myélome multiple humain¹⁴ et une chambre modulaire de flux pour l’architecture de la moelle osseuse d’ingénierie et la recherche de fonction¹⁵.

En plus des études de physiologie et de pathologie, la perfusion d’organes a été utilisée pour étudier les principes de base de l’administration de médicaments. Ainsi, un groupe a décrit la perfusion isolée de membre de rat et a étudié l’accumulation des liposomes dans les sarcomes implantés¹⁶, tandis qu’un autre groupe a exécuté la perfusion de rein humain disséquée pour étudier le ciblage endothélial des nanoparticules¹⁷. Ternello et coll. ont utilisé un rabat de peau humain perfusé isolé comme modèle de pénétration de drogue de peau proche-à-in vivo^18.

Malgré ces progrès dans la perfusion de grands organes et tissus, il n’y a eu aucun rapport sur les modèles in situ de perfusion chez les souris qui : a) contournent les organes de dégagement tels que le foie, la rate et les reins ; b) comprennent les organes pelviens, la peau, les muscles, les organes reproducteurs (chez les hommes), la vessie, la prostate et la moelle osseuse. En raison de la petite taille de ces organes et de la vascularisation de fourniture, la cannulation ex vivo et l’établissement d’un circuit de perfusion n’a pas été possible. La souris est le modèle animal le plus important dans la recherche sur le cancer et l’immunologie, et la livraison de médicaments. La capacité de perfuse de petits organes de souris permettrait de répondre à des questions intéressantes concernant l’administration de médicaments à ces organes, y compris aux tumeurs implantées dans le bassin (vessie, prostate, ovaire, moelle osseuse), ainsi qu’à des études de physiologie et d’immunologie de base des maladies de ces organes. Pour remédier à cette carence, nous avons développé un circuit de perfusion in situ chez les souris qui peuvent potentiellement éviter les lésions tissulaires et qui est beaucoup mieux adapté à la recherche fonctionnelle que la perfusion d’organes isolé.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Colorado.

1. Préchauffer le système de perfusion

1. Préparer le système de perfusion avant la chirurgie en commençant un bain d’eau circulant à 37 °C pour tous les composants à veste d’eau (réservoir perfusé, chambre humide et couvercle) comme le montre une configuration personnalisée de la figure 1A. Assurez-vous que le tube est propre et remplacez-le si nécessaire. Pour limiter le volume perfusé, utilisez un piège à bulles dans une chambre humide comme réservoir perfusé (figure 1B-6).

2. Cathétérisme vasculaire

1. Induire l’anesthésie dans une souris BALB/c de 8-10 semaines utilisant une machine d’anesthésie vétérinaire isoflurane avec 3-5% d’isoflurane et de débit d’oxygène à 0.3 L/min. Comme alternative, utilisez la kétamine/xylazine ou tout autre type d’anesthésie intrapéritonéale. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par 2 méthodes : pincement d’orteil et réflexe cornéen.
2. Préwet une suture de soie 4-0 avec aiguille dans de l’eau distillée double.
3. Placez la souris anesthésiée en position supinée sur une planche en polystyrène avec la tête face au chirurgien et immobilisez les membres antérieurs et les membres postérieurs avec du ruban adhésif. Essuyez l’abdomen avec de l’alcool isopropyle et coupez l’abdomen le long de la ligne médiane en forme de « T » avec des ciseaux. Arrêter de saigner autour du bord de l’incision par électrocoagulation (cautérisation).
4. Poussez l’estomac, le jejunum et le côlon sur le côté droit de l’abdomen pour révéler l’aorte abdominale, le vena cava, et les artères et veines iliaques et ilioumbar communes.
5. Sous un microscope de dissection, trouver et lier l’artère/veine ilioumbar dans le mâle, et l’artère/veine ovarienne et l’artère/veine ilioumbar dans la femelle utilisant des sutures de soie 4-0(figure 2 lignes jaunes).
6. Sous un microscope à dissection, bouclez deux sutures de soie 4-0 sous l’aorte abdominale et vena cava inférieure (environ 1 cm au-dessus de l’artère et de la veine iliaques, 1 mm de distance, figure 2),et faites un nœud lâche dans la suture la plus proche des vaisseaux iliaques(figure 2, ligne pointillée blanche). Alternativement, une suture de soie 6-0 peut être utilisée pour ce noeud.
7. Sous un microscope de dissection, aligner horizontalement et étirer à la fois la vena cava inférieure et l’aorte abdominale avec porte-aiguille. Utilisez un cathéter I.V. ailé ailé de 24 G pour perforer l’aorte abdominale, appuyez sur le bouton pour rétracter le noyau de l’aiguille et insérez le cathéter d’environ 5 mm dans le vaisseau.
   1. Répétez la même procédure avec la vena cava inférieure et attachez des noeuds des deux sutures autour des vaisseaux cathétérisés.
      REMARQUE : L’aiguille peut facilement percer le vaisseau sanguin; par conséquent, garder les navires tendus et l’aiguille parallèle avec le navire. Rétractez le noyau de l’aiguille dès que l’aiguille pénètre environ 1 mm dans le navire. L’aorte abdominale est sous le vena cava inférieur et beaucoup plus mince et plus élastique en raison d’être enfermé dans le tissu conjonctif. Par conséquent, l’aorte peut « tenez » au cathéter, et devraient donc être cathéterisés avant le cava vena pour réduire la probabilité que le cathéter glisse.
8. Appliquer de la colle instantanée pour immobiliser les cathéters sur les spinaes de l’érecteur, remplacer les organes abdominaux et mettre fin à la chirurgie tout en maintenant l’anesthésie.
   REMARQUE : Les organes qui ne peuvent pas être complètement remplacés dans la cavité abdominale devront être périodiquement humidifiés avec le milieu de perfusion pendant le processus de perfusion.

3. Mettre en place le système de perfusion

1. Transférer la souris dans la chambre humide à veste d’eau préassée à 37 °C sur un tampon de silicium et immobiliser les ailes du cathéter sur le tampon avec des aiguilles de 19 G.
2. Remplissez l’extrémité du cathéter artériel (entrée) d’un tampon de perfusion préaurée (solution de lactate de Ringer complétée à 5 % de BSA), puis connectez l’extrémité du cathéter avec le tube de perfusion d’entrée à l’aide d’un connecteur à vis(figure 1B, flèche rouge).
   REMARQUE : Maintenez le connecteur avec des forceps hémostatiques et immobilisez le tube avec du ruban adhésif pour éviter de déplacer les cathéters.
3. Ajuster le débit péristaltique à 0,6 mL/min et maintenir la sortie de perfusion(figure 1B, flèche bleue) ouverte pendant 5 à 10 min pour laver le sang par le cathéter veineux. Il y aura quelques caillots dans le cathéter de sortie; éliminer les caillots à l’une de la mémoire tampon avant de fermer le circuit de perfusion.
4. Connectez l’extrémité du cathéter veineux avec le tube de sortie à l’aide d’un connecteur à vis pour fermer le circuit (figure 1B). À ce stade, effectuer l’euthanasie au gaz CO₂ et vérifier par perforation thoracique ou toute autre méthode.
5. Couvrir la chambre humide avec le couvercle réchauffé. Vérifiez le niveau de perfusate périodiquement et ajoutez-en davantage si nécessaire. La perfusion peut être effectuée jusqu’à 2 heures.
   REMARQUE : 5 mL de perfusate seront nécessaires pour mettre en place le système de perfusion fermée. S’il n’y a pas de fuite ou d’œdème, le volume de perfusate diminuera de moins de 1 mL et une mémoire tampon supplémentaire ne sera pas nécessaire. Pour éviter l’œdème induit par le thrombus circulant périphérique, le tampon de perfusion contenant 0,002% d’héparine peut être utilisé dans les 10 premières minutes de perfusion, mais doit être changé en tampon sans héparine pour éviter la fuite au bord des incisions.
6. Si nécessaire, ajoutez un réactif de choix dans le réservoir de perfusion ou au port d’injection à tout moment (figure 1B-5). Par exemple, 10 μL de 10 mg/mL Hoechst33342 peuvent être ajoutés dans le perfusate pour tacher les noyaux cellulaires 2 h avant la fin de la perfusion, ou 50 μL de 1 mg/mL DyLight 649-lectine pour tacher les cellules endothéliales vasculaires 30 min avant la fin de la perfusion.
   REMARQUE : Si vous essayez de tacher la moelle osseuse avec la solution Hoechst, les souris devront être pré-injectées 30 minutes avant la chirurgie.
7. Après perfusion avec des réactifs fluorescents, laver avec tampon de perfusion pendant encore 10 minutes pour minimiser la fluorescence de fond.

4. Analyse des organes perfusés

1. Prélever des organes, y compris les testicules, la prostate, la vessie, le fémur, les muscles et la peau (p. ex., les pieds). Exciser un morceau d’organe d’environ 1 mm³ et aplatir entre deux lames de verre.
   1. Étude réalisée au microscope confocal fluorescent inversé à l’aide de filtres d’excitation et d’émission DAPI/Cy5 (lasers d’excitation : DAPI, 405 nm; Cy5,640 nm). Utilisez au moins 200x objectif de grossissement avec une ouverture numérique de 0,45.
   2. Alternativement, fixer les organes avec 4% solution de formaldéhyde pour 24 h et effectuer l’hématoxyline-éosine coloration¹⁹.
2. Pour créer une fenêtre osseuse pour l’observation intacte de la moelle osseuse, immobiliser les deux extrémités du fémur ou du tibia et gratter l’os cortical avec le bord latéral d’une aiguille de 19 G pour exposer le périoste; prendre soin de garder une fine couche d’os résiduel. Placez l’os sur un glissement de couverture avec la fenêtre faisant face au verre et à l’image avec le microscope confocal fluorescent inversé utilisant les canaux DAPI et Cy5 comme décrit ci-dessus. Les cellules et le réseau vasculaire dans la cavité de moelle osseuse peuvent être facilement observés.

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Résultats

Nous avons mis en place un système de perfusion en circuit fermé par cannulation de l’aorte abdominale et le vena cava inférieur de 8-10 semaines souris tout en gardant le volume de tampon de perfusion inférieure à 10 mL. La figure 3A montre des images confocales après avoir perfusé les tissus avec la solution de Ringer contenant Hoechst 33342 et DyLight 649-lectine. Les muscles, la moelle osseuse, les testicules, la vessie, la prostate et la peau du pied montrent une coloration nuc...

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Discussion

Le circuit décrit peut être utilisé pour sonder diverses questions de recherche, par exemple le rôle de différents composants sériques et barrières tissulaires dans l’administration de médicaments, ou le trafic de cellules immunitaires et souches. Différents systèmes d’administration de médicaments (p. ex., liposomes et nanoparticules) peuvent être ajoutés au perfusate afin de comprendre le rôle des facteurs physiologiques et biochimiques dans l’administration. La durée de la perfusion peut varier, s...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light	Amscope	SKU: SM-3BZ-80S
Carbon dioxide, USP	Airgas healthcare	19087-5283
Confocal microscope	NIKON	ECLIPSE Ti2
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp	FIAB	F7244
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733692	Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733524	keep the chamber's temperature
Moist chamber with metal tube heat exchanger	Harvard Apparatus	732901	Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters	Fine Science Tools (FST)	125014
Oxygen compressed, USP	Airgas healthcare	C2649150AE06
Roller pump (part 4 in Figure 1)	Harvard Apparatus	730113	deliver perfusate to cannula in the moist chamber
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1)	Harvard Apparatus	732806	control the purfusion speed
Silicone pad	Harvard Apparatus
Silicone tubing set (arrows in Figure 1)	Harvard Apparatus (TYGON)	733456
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools (FST)	91100-12
Surgical Scissors	Fine Science Tools (FST)	14001-14
Table for moist chamber	Harvard Apparatus	734198
Thermocirculator (part 2 in Figure 1)	Harvard Apparatus	724927	circulating water bath for all water-jacketed components
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1)	Cole-Palmer	30600-02
Veterinary anesthesia machine	Highland	HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide needle	BD	305186	For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone
4-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427411
6-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427401
Filter (0.2 µm)	ThermoFisher	42225-CA	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Permanent marker	Staedtler	342-9
Syringe (10 mL)	Fisher Scientific	14-823-2E
Syringe (60 mL)	BD	309653	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Reagents
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5)	Sigma	314-13-6
10% buffered formalin	velleyvet	36692
BALB/c mice ( 8-10 weeks old )	Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution	EMRN Medical Supplies Inc.	JB2324
Bovine serum albumin	Thermo Fisher	11021-037
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue
DyLight-649-lectin	Vector Laboratories,Inc.	ZB1214
Ethanol (70% (vol/vol))	Pharmco	111000190
Hoechst33342	Life Technologies	H3570
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	66794-017-25
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023