Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

البروتوكول المقدم يصف طريقة لمجرة نوريت خارج و التقييم السمية العصبية من مركبات جزيء صغير.

Abstract

نيوريت مقايسة النمو وتقييم السمية العصبية هما دراستان رئيسيتان يمكن تنفيذها باستخدام الطريقة المعروضة هنا. يوفر هذا البروتوكول تحليلًا موثوقًا للمورفولوجيا العصبية مع قياسات كمية للتعديلات على طول نيوريت وتوطين البروتين المتشابك والوفرة عند العلاج بمركبات جزيء صغيرة. بالإضافة إلى تطبيق الطريقة المعروضة في دراسات النمو النوري، يمكن إجراء تقييم السمية العصبية لتقييم المركبات الكيميائية التجارية وتمييزها وترتيبها استنادًا إلى تأثيرها المحتمل على السمية العصبية التنموية.

على الرغم من أن خطوط الخلايا تستخدم في الوقت الحاضر على نطاق واسع في فحص مجمع في علم الأعصاب، فإنها غالبا ما تختلف وراثيا وphenotypically من أصل الأنسجة الخاصة بهم. الخلايا الأولية، من ناحية أخرى، الحفاظ على علامات هامة والوظائف التي لوحظت في الجسم الحي. ولذلك، نظرا لإمكانات الترجمة وأهمية الفسيولوجية التي يمكن أن تقدم هذه الخلايا neurite مقايسة النمو وتقييم السمية العصبية يمكن أن تستفيد إلى حد كبير من استخدام الخلايا البشرية السلف العصبي (hNPCs) كنموذج الخلية البشرية الأولية.

ويمكن استخدام الطريقة المعروضة هنا لفحص قدرة المركبات على الحث على النمو العصبي والعصبية من خلال الاستفادة من الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا العصبية العصبية البشرية، وهي نموذج خلية يمثل البيولوجيا البشرية بشكل وثيق".

Introduction

نمو نيوريت هو عملية أساسية لتشكيل شبكة الخلايا العصبية وتجديد الأعصاب1,2. بعد الإصابة، النورية خارج يلعب دورا رئيسيا في تجديد الجهاز العصبي. النثر النوري هو أيضا عنصر مهم من الإشارات خارج الخلية في تحفيز الأنشطة التجدد العصبي لتعزيز نتائج الاضطرابات العصبية والإصابات العصبية3,4,5,6.

من خلال الحفاظ على إمكانات التمايز في إنتاج الأنساب العصبية المختلفة ، يمكن أن توفر الخلايا السلف العصبية البشرية (HNPCs) نظامًا نموذجيًا لدراسات وظائف الجهاز العصبي المركزي (CNS) والتنمية7و8و9. توفر الإمكانات الانتقالية العالية والأهمية الفسيولوجية لـ HNPCs كنموذج خلية بشرية أولية ميزة كبيرة في فحوصات اكتشاف الأدوية المرتبطة بالنوبات. ومع ذلك، يمكن أن يكون صيانة وتحجيم نماذج الخلايا الأولية لمجايسات عالية الإنتاجية تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة10،11،12،13.

بالإضافة إلى تطبيق الطريقة المقدمة في دراسات النمو النوري ، تقييم السمية العصبية هو تطبيق آخر باستخدام الخلايا العصبية المشتقة من HNPC. هناك الآلاف من المركبات الكيميائية التجارية التي إما لم يتم فحصها أو مع احتمال السمية العصبية غير مفهومة. ولذلك، فإن تجارب الفحص الأكثر موثوقية وفعالية لتقييم المركبات وتمييزها وترتيبها بناء على إمكاناتها في الحصول على السمية العصبية التنموية هي في ارتفاع الطلب14. إن زيادة انتشار الاضطرابات العصبية وحدوثها إلى جانب وفرة المركبات غير المختبرة في البيئة تستلزم إجراء تجارب أكثر جدارة بالثقة وكفاءة لتحديد المركبات البيئية الخطرة التي قد تشكل السمية العصبية15.

يمكن استخدام الطريقة المعروضة هنا للفحص لقدرة المركبات على تحفيز النمو العصبي والعصبية من خلال الاستفادة من الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا العصبية العصبية العصبية البشرية ، وهي نموذج خلية يمثل علم الأحياء البشري بشكل وثيق.

Protocol

بيان الأخلاقيات: تم تلقي عينات من الجنين من مختبر أبحاث العيوب الخلقية في جامعة واشنطن في سياتل من خلال برنامج لتوزيع الأنسجة يدعمه المعهد الوطني للصحة (NIH). وحصل مختبر بحوث العيوب الخلقية على موافقة خطية مستنيرة مناسبة من الوالدين، وراقب مجلس الاستعراض المؤسسي لجامعة واشنطن شراء الأنسجة. تم تنفيذ جميع الأعمال بموافقة مكتب أبحاث الموضوعات البشرية في جامعة ميامي8.

1. العزلة وثقافة الخلايا السلف العصبية البشرية (hNPCs)

  1. ضع أنسجة الدماغ في طبق بيتري 100 مم وقم بإزالة السحايا بعناية باستخدام ملقط.
  2. نقل أنسجة الدماغ إلى أنبوب مخروطي 50 مل وغسلها مرتين مع 20 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق عكس بلطف الأنبوب.
  3. احتضان أنسجة المخ في أنبوب مخروطي جديد 50 مل عن طريق غمر الأنسجة في محلول تفكك الخلايا (انظر جدول المواد)وDNase I (10 U/mL) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  4. إضافة 5 مل من الخلايا العصبية المتوسطة ثقافة (انظر جدول المواد)إلى أنسجة الدماغ التي تحتوي على أنبوب وميكانيكيا فصل الخلايا العصبية عن طريق triturating 20 إلى 30 مرات من خلال 1000 μL تلميح الأنابيب لجعل تعليق خلية واحدة.
  5. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 70 ميكرومتر لإزالة مجموعات الخلايا.
  6. بذور تعليق خلية واحدة في قارورة تي 25 تنفيس المقدمة مع 5-10 مل من الخلايا العصبية المتوسطة ثقافة تستكمل مع مكونات مفصلة في الجدول 1.
    1. تعقيم محلول الهيبارين عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. الملحق B-27 دون فيتامين (أ) هو تكملة خالية من المصل لزراعة السلف العصبية والخلايا الجذعية, دون إثارة التمايز.
      ملاحظة: يتم عزل الخلايا السلف العصبية البشرية (hNPCs) من دماغ الجنين البشري الذي تم جمعه من الجنين المجهض. بعد 7-10 أيام في الثقافة، تشكل الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) مستعمرات الأعصاب العائمة، في حين تبقى أنواع الخلايا الأخرى في التعليق كخلايا مفردة أو تعلق على الجزء السفلي من القارورة. يمكن أن تكون مثقفة HNPCs المعزولة كـ neurospheres في التعليق لعدة أشهر8,16,17.
المبلغمكون
100 ميكرولترEGF (20 نانوغرام / مل)
100 ميكرولترFGF (10 نانوغرام /مل)
2 ملB-27، ناقص فيتامين (أ) (50X)
1 ملL-alanyl-L-الجلوتامين (100X) (انظر جدول المواد)
4 ميكرولترالهيبارين (2 ميكروغرام/مل)
96.8 ملخلية خلية عصبيّة ثقافة وسط (رأيت جدول المواد)

الجدول 1- الانبعاثات 1000 المكونات المطلوبة لصنع 100 مل من وسائل الإعلام الثقافة

2. تمرير HNPCs

  1. جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على المجالات العائمة، وsersphers الكبيرة والصغيرة، ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    ملاحظة: بسبب أسباب غير معروفة، يكون توقيت تقسيم الـ neurospheres متغيراً من 7 أيام إلى 30 يوماً. ومع ذلك، يجب عموماً تمرير اليابس عندما يصل قطرها إلى قطر أكبر من 700-900 ميكرومتر. هذا عندما يبدأ مركز الغلاف العصبي في التغميق ، والذي يعتبر علامة على ارتفاع معدل موت الخلايا18.
  2. تدور في neurospheres أسفل عن طريق الطرد المركزي في 300-400 س ز لمدة 3 دقائق.
  3. pirate بعناية عظمى ثم غمر المجالات في 500 μL من مذاب الخلية مفسخة مفكك (انظر جدول المواد).
    1. جعل aliquots من كاشف تفكك الخلية بإضافة 500 ميكرولتر لكل 1.5 مل microtubes وتخزينها في -20 درجة مئوية. لتجنب فقدان نشاط الإنزيم، اذيب كاشف تفكك الخلايا عن طريق التمسك بـ RT أو الدافئ لمدة 5 دقائق في حمام الماء/الخرز 37 درجة مئوية.
  4. اعتمادا على كثافة وحجم المجالات، احتضان المجالات المغمورة في 37 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة.
  5. إضافة 5-10 مل من وسائل الإعلام ثقافة ما قبل الدافئة إلى neurospheres التي تحتوي على 50 مل أنبوب مخروطية وطاردة مركزية في 300-400 x ز لمدة 5 دقائق لرواسب في neurospheres.
  6. استلهمي الماصات الفائقة والماصات بلطف صعودا وهبوطا، وذلك باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر، في 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة حتى جميع neurospheres في تعليق خلية واحدة.
    ملاحظة: سوف يصبح الانفصام مرئياً للعين المجردة. قبل الانفصال، تكون الـ neurospheres في شكل مجالات. بعد غمرها في كاشف الانفصام وعن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا، فإنها سوف تصبح خلايا واحدة.
    1. عد الخلايا وطبق الخلايا واحدة، 2 إلى 3 ملايين خلية في قارورة T-25 في 10 مل من وسائل الإعلام الثقافة.
  7. تغذية الخلايا كل 3 أيام عن طريق استبدال نصف وسائل الإعلام الثقافة.
    1. تسوية neurospheres عن طريق يميل قارورة بحيث يكون في الزاوية السفلى. عقد القارورة في الموقف لمدة 1-2 دقيقة حتى الرواسب neurospheres. ثم تُشعّر نصف الوسائط بلطف بإدراج الماصات المصلية في الوسائط فوق الأوساط العصبية المستقرة. يمكن تجميع الخلايا المنفصلة لتشكيل المجالات بعد 2 إلى 3 أيام في الثقافة19.

3- تجميد المراكز الوطنية الهايتية

  1. إعداد خلية تجميد المتوسطة عن طريق إضافة DMSO إلى الوسائط الثقافة إلى تركيز نهائي من 10٪ (v/v) أو استخدام توسط الحفظ التبريد المتاحة تجاريا لأنواع الخلايا الحساسة (انظر جدول المواد).
  2. فرز مجالات كبيرة عن طريق نقل وسائل الإعلام إلى أنبوب مخروطي 50 مل والسماح للكرة تسوية الجاذبية. ثم إزالة ونقل الاعصاب الكبيرة في أنبوب جديد 50 مل مخروطية ل passaging باستخدام 200 أو 1000 μl أنبوب تلميح.
    ملاحظة: تعتبر المغنطيس العصبي الذي يزيد قطره على 900 ميكرومتر كبير، وتعتبر تلك التي يقل قطرها عن 500 ميكرومتر صغيرة.
  3. تدور في المغنطيس العصبي المتبقية إلى أسفل عن طريق الطرد المركزي في 300-400 × ز لمدة 3 دقائق.
  4. إعادة تعليق ما يصل إلى 100 المجالات في 1 مل من كاشف التبريد والكوندز ونقلها إلى لتبريد.
  5. تخزين بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية في حاوية تجميد الخلية (انظر جدول المواد)ونقلها إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي لتخزين على المدى الطويل.
    ملاحظة: يفضل تجميد المغنطيس العصبي الصغير والمتوسط الحجم (أقل من 900 ميكرومتر في القطر) وتجنب تجميد الخلايا العصبية الكبيرة الحجم (التي يزيد قطرها عن 900 ميكرومتر) أو الخلايا المفردة. من أجل الحد من تلف الخلايا أثناء ذوبان العينة، والحفاظ على الخلايا كثيفة عن طريق بذر الخلايا العصبية المذابة في قارورة T25 صغيرة.

4- التمايز والمعاملة بين اللجان الوطنية الهايتية

ملاحظة: للحث على التمايز، يتم تصنيف الخلايا العصبية في خلايا مفردة، ويتم عدها ثم البذور على لوحات مغلفة لمدة 5 أيام. ثم يتم علاج الخلايا المتمايزة ل 24 ساعة مع مركبات الاختبار قبل المناعة والتقديس الكمي.

  1. طلاء
    1. أضف 200 ميكرولتر من بولي إل ليسين (PLL) لكل بئر من شرائح الحجرة الزجاجية ذات 4 آبار (140 ميكرولتر لكل بئر من شرائح الغرفة 8-جيدا).
    2. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. غسل 3x مع برنامج تلفزيوني.
    4. دعها تجف في RT (لمدة 30 دقيقة).
    5. أضف 150 ميكرولتر من اللامينين (50 ميكروغرام/مل) في بئر من شرائح الحجرة الزجاجية ذات 4 آبار (120 ميكرولتر لكل بئر من شرائح الغرفة ذات 8 بئر).
    6. احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    7. غسل 3x مع برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: يمكن تخزين شرائح الغرف المغلفة في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
  2. طلاء الخلايا
    1. عد وطبقة 80،000 الخلايا العصبية واحدة (neurospheres في تعليق خلية واحدة) في بئر من شرائح غرفة 4-جيدا (70،000 خلية في بئر من شريحة غرفة 8-جيدا).
    2. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام التمايز في بئر من 4-آبار شريحة الغرفة (250 μL وسائل الإعلام في بئر من شرائح غرفة 8-جيدا).
      1. لجعل وسائل الإعلام التمايز أولاً، إضافة المكونات التالية في الجدول 2 إلى وعاء عقيمة يمكن التخلص منها لجعل وسائل الإعلام المسببة العصبية (NIM).
      2. إضافة المكونات التالية في الجدول 3 إلى 48.5 مل من NIM المحرز في الخطوة السابقة لجعل وسائل الإعلام التمايز.
    3. احتضان لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية.
    4. بعد 5 أيام، علاج الخلايا لمدة 24 ساعة عن طريق استبدال نصف وسائل الإعلام في كل بئر مع وسائل الإعلام الطازجة مختلطة مع التركيز المطلوب من مركبات الاختبار، بما في ذلك الضوابط المناسبة.
المبلغمكون
49 ملDMEM/F-12
0.5 ملN2 الملحق (100X)
0.5 ملMEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (100X)
2 ميكرولترالهيبارين (2 ميكروغرام/مل) (Conc. الأسهم هو 50 ملغ /مل)

الجدول 2- المكونات المطلوبة لصنع 50 مل من الـ NIM

المبلغمكون
1 ملB-27 (50X)
500 ميكرولترمضاد حيوي مضاد للمضادات الحيوية (100X)
5 ميكرولترحمض الريتينويك (0.1 ميكرومتر)
50 ميكرولترGDNF (10 ميكروغرام / مل)
50 ميكرولترBDNF (10 ميكروغرام / مل)
5 ميكرولترحمض الاسكوربيك (0.2 ميكروغرام/مل) (Conc. Stock Conc. هو 2 ملغ/مل) ملاحظة: يوصى بأن تكون طازجة.
48.5 ملنيم

الجدول 3- الانبعاثات 100 من 10 المكونات المطلوبة لصنع 50 مل من وسائل الإعلام التمايز

5. الكيمياء المناعية (ICC)

ملاحظة: يتم إصلاح الخلايا مع الفورمالديهايد 4٪ . ثم يتم تنفيذ Permeabilization والحجب لتحسين الاختراق ومنع الربط غير محدد من الأجسام المضادة. ثم يتم احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها. في وقت لاحق، يتم احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية المسماة الفلورسنت. وأخيرا، بعد استخدام DAPI لطخة النواة، يتم تركيب شرائح الغرفة.

  1. تثبيت
    1. استلهم بلطف وسائل الإعلام في كل بئر.
    2. أضف 500 ميكرولتر من 4% فورمالديهايد لكل بئر من شرائح 4-بئر غرفة (250 ميكرولتر لكل بئر من شرائح غرفة 8-جيدا).
    3. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
    4. غسل بلطف 2x مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: بعد التثبيت، من خلال ترك 1 مل من برنامج تلفزيوني في كل بئر، يمكن تخزين الشرائح الثقافة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  2. عملية منع الخلايا وحظرها
    1. إضافة المكونات التالية في الجدول 4 إلى وعاء معقمة يمكن التخلص منها لجعل الجسم المضاد (AB) العازلة.
    2. اخلط المكونات التالية في الجدول 5 مع المخزن المؤقت Ab الذي تم إجراؤه في الخطوة السابقة لجعل حل permeabilization الخلية والحجب.
    3. أضف 500 ميكرولتر في بئر من شرائح الغرف ذات 4 بئر وينضب لمدة ساعة في RT.
      ملاحظة: يمكن تخزين مخزن AB المؤقت عند 4 درجة مئوية.
المبلغمكون
1.75 غرامNaCl (150 mM)
1.2 غرامقاعدة تريس بيس (50 mM)
2 غرامBSA 1%
3.6 غL-lysine (100 mM)
8 غازايد الصوديوم (4%)
200 ملالماء المقطر. ملاحظة: في البداية حل المكونات المطلوبة في 150 مل من الماء، ثم ضبطها إلى 200 مل.

الجدول 4 - 100 100 دولار المكونات المطلوبة لصنع 200 مل من العازلة الأجسام المضادة

المبلغمكون
600 ميكرولتر20% مصل الماعز
6 ميكرولتر0.2% تريتون-X100
2394 ميكرولترالعازلة المضادة. ملاحظة: في البداية قم بحل المكونات المطلوبة في 2 مل من المخزن المؤقت Ab، ثم قم بضبطها إلى 7.4 درجة PH. ثم إضافة المزيد من المخزن المؤقت لAb لضبط الحجم النهائي من 3 مل وتصفية تعقيم.

الجدول 5 - 100 100 دولار المكونات المطلوبة لصنع 3 مل من خلية permeabilization و حظر الحل

  1. تلطيخ
    1. غسل 2x مع 500 μL من برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة الجسم المضاد الرئيسي المخفف، مضاد β-tubulin الثالث (1:200)، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية (200 ميكرولتر لكل بئر من شرائح غرفة 4-جيدا). تمييع الجسم المضاد الأساسي في PBS.
    3. غسل 2X مع برنامج تلفزيوني.
    4. إضافة المخفف، في برنامج تلفزيوني، المسمى الفلورسنت الأجسام المضادة الثانوية، اليكسا فلور 488 (1:500)، واحتضان لمدة 2 ساعة في RT في مكان محمي من الضوء (250 ميكرولتر في بئر من شرائح غرفة 4-جيدا)
    5. غسل 2X مع برنامج تلفزيوني.
    6. إضافة المخفف، في برنامج تلفزيوني، DAPI (300 nM التركيز) واحتضان لمدة 5 دقائق في RT في مكان محمي من الضوء (300 ميكرولتر في بئر من الشرائح غرفة 4-جيدا).
    7. غسل 3x مع برنامج تلفزيوني.
    8. قم بتركيب شرائح الغرفة باستخدام الإرشادات التالية.
      1. تأخذ بعيدا الشريحة الغرفة عن طريق كسر علامات التبويب الانفصالية وإزالة طوقا وقاعدة.
      2. إضافة قطرة واحدة من حل تصاعد (انظر جدول المواد)في بئر من شرائح غرفة 4-جيدا. ثم استخدم شريحة غلاف لتغطية الشريحة بأكملها.
      3. باستخدام ملاقط وبزاوية، ضع جانبًا واحدًا من الغطاء في زلة على الشريحة أثناء الاتصال بالحافة الخارجية لإسقاط السائل.
      4. تلميح بعناية coverlip على حل تصاعد عند خفضه في مكانه. تجنب خلق فقاعات. خذ طرف ماصة واضغط عليه على زلة الغطاء. سوف فقاعات الانتقال إلى الجانب.
        ملاحظة: تشكيل فقاعة أمر لا مفر منه في بعض الأحيان. إذا حدث ذلك ، صورة من حولهم طالما أن هناك عدد قليل.
      5. اتبع توجيهات الشركة المصنعة لعلاج الوقت. تجنب استخدام حلول التركيب غير المُجَدّة بسبب صعوبة التعامل أثناء التصوير. وإلا فإن استخدام غطاء غطاء مناسب على الحواف مطلوب لمنع انزلاق الغطاء أثناء التصوير.
      6. لختم الغطاء، واستخدام طلاء الأظافر وجعل خط صغير على حافة زلة الغطاء. دع طلاء الأظافر يجف لمدة 2 دقيقة.

6. الحصول على الصورة، ونتاج نيوريت وتكميم كثافة الفلوريسنس

ملاحظة: بعد تلطيخ، استخدم مجهرًا مشتركًا مع هدف 20x وحجم صورة 1024 × 1024 بكسل للحصول على صور الخلايا المعالجة. التقاط صورة على الأقل من حقلين لكل تكرار بيولوجي لكل حالة. ثم استخدام فيجي برنامج تحليل الصور (ImageJ 1.51u) من أجل تحديد كمي من طول neurite. باختصار، قياس طول أطول نيوريت لكل خلية عصبية وبعد متوسط القيم لكل علاج، استخدم اختبار t للطالب للمجموعات المستقلة لمقارنة الوسائل بين المجموعات التجريبية ومجموعة التحكم.

ملاحظة: العديد من التجارية (Imaris، Volocity، أميرة) ومفتوحة المصدر (Imajej، CellProfiler، Vaa3D، BioImageXD، الجليدية، KNIME) برامج معالجة الصور متوفرة. من بين هذه البرامج ، أصبح ImageJ الأداة المفضلة لتحليل الصور البيولوجية20،21. بوابة ImageJ في https://imagej.net/Introduction هي مصدر مفيد للمعلومات التي توفر وصفاً شاملاً لوظائف ImageJ الأساسية والمدمجة بما في ذلك معالجة الصور والتكلس والتكليس والتكليس والتسجيل والتجزئة والتتبع والتصور.

  1. قياس نمو الخلايا العصبية مع برنامج تحليل الصور في فيجي
    1. كما هو موضح في الشكل 1، فتح الصورة إما عن طريق سحب وإسقاط على برامج فيجي أو عن طريق تحديد ملف | مفتوح.
    2. حدد تحليل | أدوات | مدير ROI، ثم انقر بزر الماوس الأيمن على رمز5 في شريط الأدوات مباشرة والتبديل إلى خط حر. اختياريا، انقر نقرا مزدوجا فوق نفس الرمز لتغيير عرض الخط إلى 10، ومن ثم تتبع أطول neurite، بدءا بالقرب من جسم الخلية وتمتد إلى غيض من neurite.
    3. اضغط على Ctrl + T & ثم F لإضافة القياس إلى مدير ROI وتسليط الضوء على الخلايا العصبية المقاسة. حدد جميع الأرقام في عائد الاستثمار، انقر على قياس، وحدد جميع الأطوال المحسوبة ، وانسخ / اللصق في جدول بيانات.
  2. قياس كثافة الفلوريسنس للخلايا المسماة مع برنامج تحليل الصور في فيجي
    1. كما هو موضح في الشكل 2، بعد فتح الصورة ، انقر على رمز4 في شريط الأدوات التحديدات اليدوي. رسم شكل الخلية.
    2. حدد تحليل | تعيين القياسات وتحديد للقيم التالية: مساحة, كثافة متكاملة, متوسط قيمة الرمادي | تحليل | قياس (مربع منبثق مع مجموعة من القيم يفتح).
    3. حدد منطقة بجوار الخلية كخلفية (الحجم غير مهم) ثم حدد تحليل | قياس. حدد كافة البيانات المقاسة ونسخ/لصق في جدول بيانات.
      ملاحظة: الكثافة المتكاملة (IntDen) هي الصنف المستخدم لتحديد الكثافة الفلورية. في هذه الدراسة يتم قياس كثافة الفلورسنت للجزيء الهدف لتحليل توزيعه في الخلية في البداية وتحديد كمية وفرة الجزيء المستهدف في إطار علاجات مختلفة. وبالتالي، سيتم قياس فعالية العلاجات ومقارنتها مع السيطرة.

7- تقييم السمية العصبية

ملاحظة: يتم تقييم السمية الخلوية لمركبات الاختبار في 384-ألواح بئر (انظر جدول المواد)باستخدام مقايسة خلية مضيئة قابلة للحياة (انظر جدول المواد). وتُعد هذه المراكز بنفس الطريقة، باستثناء التعديلات الطفيفة الوارد وصفها في قسم "تمايز ومعاملة الـ هـاءبـات الهـنـبـاتـيـة". في وقت لاحق، يتم قياس إشارة الإنارة التي تم إنشاؤها بواسطة قياس الخلية مضيئة باستخدام قارئ microplate. إشارة الإنارة يتناسب مع تركيز ATP الخلوية التي هي نفسها متناسبة بشكل مباشر مع عدد الخلايا القابلة للحياة الموجودة في كل بئر.

  1. طلاء
    1. إضافة 30 ميكرولتر من بولي-إل-ليسين (PLL) في بئر من 384-جيدا لوحة.
    2. احتضان لمدة 1 ساعة في RT.
    3. غسل 2X مع برنامج تلفزيوني.
    4. دعها تجف في RT (لمدة 30 دقيقة).
    5. إضافة 30 ميكرولتر من اللامينين (50 ميكروغرام/مل) في بئر من 384-جيدا.
    6. احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    7. غسل 2X مع برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: يمكن تخزين ألواح 384-جيدا المغلفة في 4 °C لمدة 1 شهر.
  2. طلاء الخلايا
    1. عد وطبقة 20،000 الخلايا العصبية واحدة لكل بئر من 384-جيدا لوحة في 25 ميكرولتر من وسائل الإعلام التمايز.
    2. احتضان لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية.
    3. بعد 5 أيام، علاج الخلايا لمدة 24 ساعة بواسطة مركبات اختبار أعدت في 6x التركيز النهائي المطلوب في 5 ميكرولتر حجم (لجعل الحجم النهائي من 30 ميكرولتر في بئر).
  3. الخلية قابلية البقاء المقايسة
    1. إضافة 30 μL من خلية مضيئة قابلية البقاء مُكَوّن في بئر من 384-جيدا لوحة.
      ملاحظة: إضافة وحدة تخزين من مُقدّم قابلية الخلية للإنارة إلى مساوية لحجم التخزين الموجود في كل بئر. ذوبان خلية مضيئة جدوى مُقايسة وتكسير لRT قبل استخدامها.
    2. يهز على لوحة شاكر لمدة 2 دقيقة (لخلط والحث على تحلل الخلية).
    3. تدور الخليط إلى أسفل عن طريق الطرد المركزي في 300-400 × ز لمدة 30 s.
    4. احتضان لوحة 384-جيدا لمدة 10 دقيقة في RT في مكان محمي من الضوء (لتثبيت إشارة الإنارة).
    5. سجل الإنارة مع قارئ microplate.
      ملاحظة: استخدام الضوابط المناسبة لقابلية الدامس بما في ذلك Velcade (بتركيز نهائي 10 μM) على النحو الإيجابي وHBSS التي تحتوي على DMSO (مع تركيز نهائي من 0.1٪ أو 0.2٪) كتحكم سالب.

النتائج

وقد تم استخدام البروتوكول المعروض في المخطوطة بنجاح في ورقتين نشرتامؤخراً 22,23. ويبين الشكل 3 استخدام الخلايا العصبية المشتقة من HNPCs في دراسة تأثير مثبطات HDAC كمركبات غير جينية على امتداد نيوريت كعلامة على نمو نيوريت والقدرة العصبية اللاحقة ل...

Discussion

هذا البروتوكول هو واحد من عدد قليل من الأوراق المنشورة التي تصف اختبار طول نيوريت عند العلاج بمركبات الاختبار. وعلاوة على ذلك، فإننا نصف كيفية استخدام hNPCs لتقييم الخصية خارج نيوريت واعصاب. من خلال الاستفادة من هذا مقايسة النمو النوري وتقييم السمية العصبية على الخلايا العصبية المشتقة من hNP...

Disclosures

ويشير جميع المؤلفين إلى عدم وجود تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من خلال منحة البحوث NIMAD (940714) التي منحت لـ MAF.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-well Glass Chamber SlidesSigmaPEZGS0816
Alexa Fluor 488InvitrogenA-11001
Alexa Fluor 594InvitrogenR37117
Antibiotic-AntimycoticGibco15240062
Anti-β-Tubulin IIIThermoMA1-118X
B27Thermo17504001
B27 - minus vitamin AThermo12587010
BDNFPeproTech450-02
BSASigmaA8531
CellTiter-GloPromegaG7572
CoolCellCorning432000Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer
CryoStor CS10StemCell Technologies7930Cryopreservation medium containing 10% DMSO
DAPIThermoD1306
DMEM/F12Gibco11320033
DMSOSigma34869-100ML
EGFGibcoPHG0311
FGFGibcoPHG6015
FormaldehydeThermoFB002
GDNFPeproTech450-10
GlutamaxGibco35050061L-alanyl-L-glutamine supplement
Goat SerumThermo50062Z
HeparinCalbiochem375095
LamininSigmaL2020-1MG
L-Ascorbic AcidSigmaA92902-25G
L-lysineSigmaL5501
MEM non-essential amino acidsGibco11140050
mFreSRStemCell Technologies5854Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
N2Gibco17502048
NaClSigma71376
Neurobasal MediumGibco21103049
Nunc 384-Well Polystyrene White MicroplatesThermo164610
PBSThermo10010-049
Poly-L-lysineSigmaP5899-5MG
ProLong Gold Antifade MountantThermoP10144
Retinoic AcidSigmaR2625
Sodium AzideSigmaS2002
StemPro AccutaseGibcoA1110501Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes
SynaptophysinThermoMA5-14532
Tris BaseSigma10708976001
Triton X-100SigmaX100-100ML

References

  1. Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
  2. Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
  3. Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
  4. Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
  5. Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
  6. Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
  7. Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
  8. Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
  9. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
  10. Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
  11. Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
  12. An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
  13. Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
  14. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
  15. Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
  16. Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer's disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer's Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
  17. Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
  18. Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
  19. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
  22. Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
  23. Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
  24. Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
  25. Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
  26. Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
  27. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
  28. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  29. Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
  30. Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
  31. Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

162

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved