Un test d’excroissance de neurite et évaluation de neurotoxicité avec des neurones neuronaux progéniteurs humains dérivés des cellules

Résumé

Le protocole présenté décrit une méthode pour un test d’excroissance de neurite et l’évaluation de neurotoxicité des composés de petites molécules.

Résumé

L’analyse d’excroissance de neurite et l’évaluation de neurotoxicité sont deux études principales qui peuvent être exécutées utilisant la méthode présentée ci-dessus. Ce protocole fournit une analyse fiable de la morphologie neuronale ainsi que des mesures quantitatives des modifications sur la longueur de la neurite et la localisation des protéines synaptiques et l’abondance lors du traitement avec de petits composés de molécules. En plus de l’application de la méthode présentée dans les études sur l’excroissance de la neurite, l’évaluation de la neurotoxicité peut être effectuée pour évaluer, distinguer et classer les composés chimiques commerciaux en fonction de leur effet potentiel de neurotoxicité développementale.

Même si les lignées cellulaires sont aujourd’hui largement utilisées dans les tests de dépistage composés en neurosciences, elles diffèrent souvent génétiquement et phénotypiquement de leur origine tissulaire. Les cellules primaires, d’autre part, maintiennent des marqueurs et des fonctions importants observés in vivo. Par conséquent, en raison du potentiel de traduction et de la pertinence physiologique que ces cellules pourraient offrir l’essai de néoration et l’évaluation de neurotoxicité peuvent considérablement bénéficier de l’utilisation des cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC) comme modèle cellulaire humain primaire.

La méthode présentée ici peut être utilisée pour dépister la capacité des composés à induire l’excroissance de la neurite et la neurotoxicité en profitant des neurones humains dérivés des cellules progéniteurs, un modèle cellulaire représentant étroitement la biologie humaine.

Introduction

La croissance de la neurite est un processus fondamental pour la formation du réseau neuronal et la régénération nerveuse^1,2. À la suite d’une blessure, l’excroissance de la neurite joue un rôle clé dans la régénération du système nerveux. L’excroissance de neurite est également un élément important de la signalisation extracellulaire en induisant des activités régénératrices neuronales pour améliorer les résultats pour les désordres neurodégénératifs et les dommages neuronaux^3,4,5,6.

En maintenant leur potentiel de différenciation dans la production de diverses lignées neuronales, les cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC) pourraient fournir un système modèle pour l’étude de la fonction et du développement du système nerveux central (SNC)^7,8,9. Le potentiel translationnel élevé et la pertinence physiologique des HNPC en tant que modèle primaire de cellules humaines offrent un avantage considérable dans les dépistages de découverte de drogue liés à l’excroissance de neurite. Toutefois, l’entretien et l’échelle des modèles de cellules primaires pour les tests à haut débit pourraient prendre beaucoup de temps et^10,11,12,13.

En plus de l’application de la méthode présentée dans les études sur l’excroissance de la neurite, l’évaluation de la neurotoxicité est une autre application utilisant les neurones dérivés du HNPC. Il y a des milliers de composés chimiques commerciaux qui ne sont pas examinés ou avec un potentiel de neurotoxicité mal compris. Par conséquent, des expériences de dépistage plus fiables et plus efficaces pour évaluer, distinguer et classer les composés en fonction de leur potentiel pour susciter une neurotoxicité développementale sont très demandées¹⁴. L’augmentation de la prévalence et de l’incidence des troubles neurologiques ainsi que l’abondance de composés non testés dans l’environnement nécessite le développement d’expériences plus fiables et efficaces pour identifier les composés environnementaux dangereux qui peuvent poser la neurotoxicité¹⁵.

La méthode présentée ici peut être utilisée pour dépister la capacité des composés à induire l’excroissance de la neurite et la neurotoxicité en profitant des neurones humains dérivés des cellules progéniteurs, un modèle cellulaire représentant étroitement la biologie humaine.

Protocole

Énoncé d’éthique : Des échantillons fœtaux ont été reçus du Laboratoire de recherche sur les malformations congénitales de l’Université de Washington à Seattle dans le cadre d’un programme de distribution de tissus soutenu par le National Institute of Health (NIH). Le Laboratoire de recherche sur les malformations congénitales a obtenu le consentement écrit approprié des parents et l’achat de tissus a été surveillé par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Washington. Tous les travaux ont été effectués avec l’approbation du Bureau de recherche sur les sujets humains de l’Université de Miami⁸.

1. Isolement et culture des cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC)

1. Placez le tissu cérébral dans une boîte de Pétri de 100 mm et retirez soigneusement les méninges à l’aide de forceps.
2. Transférer le tissu cérébral dans un tube conique de 50 mL et le laver deux fois avec 20 ml de PBS en inversant doucement le tube.
3. Incuber le tissu cérébral dans un nouveau tube conique de 50 mL en submergeant le tissu dans la solution de dissociation cellulaire (voir tableau des matériaux)et DNase I (10 U/mL) pendant 10 min à 37 °C.
4. Ajouter 5 ml de milieu de culture cellulaire neuronale (voir tableau des matériaux)au tissu cérébral contenant le tube et dissocier mécaniquement les neurosphères en triturant 20 à 30 fois par une pointe de pipet de 1000 μL pour faire une suspension à une seule cellule.
5. Filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 μm pour enlever les grappes cellulaires.
6. Seed la suspension unicellulaire dans une fiole T-25 ventilée fournie avec 5-10 mL de milieu de culture cellulaire neuronale complétée par des composants détaillés dans le tableau 1.
   1. Stériliser la solution d’héparine par filtration à travers un filtre de 0,2 μm. Le supplément B-27 sans vitamine A est un supplément sans sérum pour la culture des progéniteurs neuronaux et des cellules souches, sans induire la différenciation.
      NOTE : Les cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC) sont isolées du cerveau foetal humain recueilli du foetus avorté. Après 7 à 10 jours de culture, les cellules souches neurales (NSC) forment des colonies de neurosphère flottante, tandis que d’autres types de cellules restent en suspension sous forme de cellules simples ou s’attachent au fond de la fiole. Les hNPC isolés peuvent être cultivés comme neurosphères en suspension pendant plusieurs mois^8,16,17.

Montant	Composant
100 μL	EGF (20 ng/mL)
100 μL	FGF (10 ng/mL)
2 mL	B-27, moins vitamine A (50X)
1 mL	L-alanyl-L-glutamine (100X) (voir tableau des matériaux)
4 μL	Héparine (2 μg/mL)
96,8 mL	Milieu de culture cellulaire neuronale (voir tableau des matériaux)

Tableau 1. Composants nécessaires à la fabrication de 100 mL de supports culturels

2. Passer les hNPC

1. Recueillir les supports contenant les sphères flottantes, grandes et petites neurosphères, et les transférer dans un tube conique de 50 mL.
   REMARQUE : Pour des raisons inconnues, le moment de fractionnement des neurosphères varie de 7 jours à 30 jours. Cependant, généralement, les neurosphères doivent être adoptées lorsqu’elles atteignent un diamètre supérieur à 700-900 μm. C’est alors que le centre de la neurosphère commence à s’assombrir, ce qui est considéré comme un signe d’un taux élevé de mort cellulaire¹⁸.
2. Faites tourner les neurosphères vers le bas par centrifugation à 300-400 x g pendant 3 min.
3. Apirate soigneusement le supernatant, puis submerger les sphères dans 500 μL de réactif de dissociation des cellules décongelées (voir tableau des matériaux).
   1. Faire des aliquots de réactif de dissociation cellulaire en ajoutant 500 μL par microtubes de 1,5 mL et stocker à -20 °C. Pour éviter de perdre l’activité enzymatique, décongeler le réactif de dissociation cellulaire en maintenant à RT ou au chaud pendant 5 min dans un bain d’eau/perle de 37 °C.
4. Selon la densité et la taille des sphères, incuber les sphères submergées à 37 °C pendant 5-15 min.
5. Ajouter 5 à 10 ml de supports de culture préchauffés aux neurosphères contenant un tube conique de 50 ml et une centrifugeuse à 300-400 x g pendant 5 min pour sédimenter les neurosphères.
6. Remplacer le supernatant et doucement pipette de haut en bas, à l’aide d’une pipette de 1000 μL, dans 2 mL de milieux de culture jusqu’à ce que toutes les neurosphères soient dans une seule suspension cellulaire.
   REMARQUE : La dissociation deviendra visible à l’œil nu. Avant la dissociation, les neurosphères sont sous forme de sphères. Après avoir immergé dans le réactif de dissociation et en faisant des pipeting de haut en bas, ils deviendront des cellules simples.
   1. Compter les cellules et plaquer les cellules simples, 2 à 3 millions de cellules par flacon T-25 dans 10 ml de milieux de culture.
7. Nourrissez les cellules tous les 3 jours en remplaçant la moitié des supports de culture.
   1. Installez les neurosphères en penchant la fiole de sorte qu’elle soit sur son coin inférieur. Maintenez la fiole en position pendant environ 1-2 min jusqu’à ce que les neurosphères sédimentent. Puis aspirate doucement la moitié des médias en insérant la pipette sérologique dans les médias au-dessus des neurosphères installées. Les cellules dissociées peuvent s’agréger pour former des sphères après 2 à 3 jours dans la culture¹⁹.

3. Congélation des hNPC

1. Préparer le milieu de congélation cellulaire en ajoutant le DMSO au support de culture à une concentration finale de 10 % (v/v) ou utiliser un milieu de cryoconservation disponible dans le commerce pour les types de cellules sensibles(voir tableau des matériaux ).
2. Trier les grandes sphères en transférant les médias dans un tube conique de 50 mL et en laissant les sphères s’installer par gravité. Retirez et transférez ensuite les grandes neurosphères dans un nouveau tube conique de 50 mL pour le passage à l’aide d’une pointe de pipet de 200 ou 1000 μL.
   REMARQUE : Les neurosphères d’un diamètre supérieur à 900 μm sont considérées comme grandes et celles d’un diamètre inférieur à 500 μm sont considérées comme petites.
3. Faites tourner les neurosphères restantes vers le bas par centrifugation à 300-400 x g pendant 3 min. Retirez soigneusement le supernatant.
4. Resuspendez jusqu’à 100 sphères dans 1 mL de réactif cryoconservation et transférez-le sur un cryotube.
5. Conserver toute la nuit à -80 °C dans un contenant de congélation cellulaire (voir tableau des matériaux)et le déplacer vers l’azote liquide le lendemain pour un stockage à long terme.
   REMARQUE : Il est préférable de congeler des neurosphères de petite à moyenne taille (de moins de 900 μm de diamètre) et d’éviter de congeler des neurosphères de grande taille (de plus de 900 μm de diamètre) ou des cellules individuelles. Afin de réduire les dommages cellulaires pendant le dégel de l’échantillon, gardez les cellules denses en ensemenant les neurosphères décongelées dans une petite fiole T25.

4. Différenciation et traitement des PNH

REMARQUE : Pour induire la différenciation, les neurosphères sont désagrégées en cellules individuelles, comptées puis ensemencées sur des plaques enduites pendant 5 jours. Ensuite, les cellules différenciées sont traitées pendant 24 h avec des composés d’essai avant l’immunostaining et la quantification de fluorescence.

1. Revêtement
   1. Ajouter 200 μL de poly-L-lysine (PLL) par puits de lames de chambre en verre de 4 puits (140 μL par puits de lames de chambre de 8 puits).
   2. Incuber pendant 1 h à température ambiante (RT).
   3. Laver 3x avec PBS.
   4. Laissez sécher à RT (pendant environ 30 min).
   5. Ajouter 150 μL de laminine (50 μg/mL) par puits de lames de chambre en verre de 4 puits (120 μL par puits de lames de chambre de 8 puits).
   6. Incuber pendant 2 h à 37 °C.
   7. Laver 3x avec PBS.
      REMARQUE : Les lames de chambre enduites peuvent être conservées à 4 °C pendant 1 mois.
2. Placage des cellules
   1. Compter et plaquer 80 000 neurosphères à cellules uniques (neurosphères dans une suspension à cellule unique) par puits de lames de chambre de 4 puits (70 000 cellules par puits de lame de chambre de 8 puits).
   2. Ajouter 500 μL de milieu de différenciation par puits de lame de chambre de 4 puits (250 μL de milieu par puits de lames de chambre de 8 puits).
      1. Pour faire le média de différenciation d’abord, ajouter les composants suivants dans le tableau 2 à un stérile, récipient jetable pour faire le milieu induisant neural (NIM).
      2. Ajoutez les ingrédients suivants dans le tableau 3 à 48,5 mL de NIM fait dans l’étape précédente pour faire le support de différenciation.
   3. Incuber pendant 5 jours à 37 °C.
   4. Après 5 jours, traiter les cellules pendant 24 h en remplaçant la moitié des supports dans chaque puits par des supports frais mélangés à la concentration souhaitée de composés d’essai, y compris les contrôles appropriés.

Montant	Composant
49 mL	DMEM/F-12
0,5 mL	Supplément N2 (100X)
0,5 mL	Mem acides aminés non essentiels (100X)
2 μL	Héparine (2 μg/mL) (Stock Conc. est de 50 mg/mL)

Tableau 2. Composants requis pour la fabrication de 50 mL de NIM

Montant	Composant
1 mL	B-27 (50X)
500 μL	Antibiotique-Antimycotique (100X)
5 μL	Acide rétinoïque (0,1 μM)
50 μL	GDNF (10 μg/mL)
50 μL	BDNF (10 μg/mL)
5 μL	Acide ascorbique (0,2 μg/mL) (Stock Conc. est de 2 mg/mL) NOTE : Recommandé pour être fait frais.
48,5 mL	Nim

Tableau 3. Composants nécessaires à la fabrication de 50 mL de supports de différenciation

5. Immunocytochimie (ICC)

REMARQUE : Les cellules sont fixées avec 4 % de formaldéhyde. La perméabilisation et le blocage sont ensuite effectués pour améliorer la pénétration et prévenir la liaison non spécifique des anticorps. Les cellules sont ensuite incubées avec des anticorps primaires pendant la nuit. Par la suite, les cellules sont incubées avec des anticorps secondaires fluorescents. Enfin, après avoir utilisé DAPI pour tacher le noyau, des lames de chambre sont montées.

1. Fixation
   1. Aspirant doucement les médias dans chaque puits.
   2. Ajouter 500 μL de 4 % de formaldéhyde par puits de lames de chambre de 4 puits (250 μL par puits de lames de chambre de 8 puits).
   3. Incuber pendant 15 min à RT.
   4. Laver doucement 2x avec 500 μL de PBS.
      REMARQUE : Après fixation, en laissant 1 mL de PBS dans chaque puits, les diapositives de culture peuvent être stockées à 4 °C pendant jusqu’à 3 mois.
2. Perméabilisation et blocage cellulaire
   1. Ajoutez les composants suivants dans le tableau 4 à un contenant stérile et jetable pour faire le tampon anticorps (Ab).
   2. Mélanger les ingrédients suivants dans le tableau 5 avec la mémoire tampon Ab faite dans l’étape précédente pour faire la perméabilisation cellulaire et la solution de blocage.
   3. Ajouter 500 μL par puits de lames de chambre de 4 puits et incuber pendant 1 h à RT.
      REMARQUE : La mémoire tampon Ab peut être stockée à 4 °C.

Montant	Composant
1,75 g	NaCl (150 mM)
1,2 g	TrisBase (50 mM)
2 g	BSA 1%
3,6 g	L-lysine (100 mM)
8 g	Azide de sodium (4%)
200 mL	Eau distillée. REMARQUE : Dissoudre d’abord les composants requis dans 150 mL d’eau, puis ajuster à 200 mL.

Tableau 4. Composants nécessaires à la fabrication de 200 mL de tampon d’anticorps

Montant	Composant
600 μL	Sérum 20% chèvre
6 μL	0,2 % Triton-X100
2394 μL	Tampon d’anticorps. REMARQUE : Dissoudre d’abord les composants requis dans 2 mL de tampon Ab, puis ajuster au pH 7.4. Ajoutez ensuite plus de tampon Ab pour ajuster au volume final de 3 mL et filtrer la stérilisation.

Tableau 5. Composants nécessaires à la fabrication de 3 mL de solution de perméabilisation et de blocage des cellules

3. Coloration
   1. Laver 2x avec 500 μL de PBS.
   2. Ajouter l’anticorps primaire dilué, l’anti-β-tubuline III (1:200), et incuber toute la nuit à 4 °C (200 μL par puits de lames de chambre de 4 puits). Diluer l’anticorps primaire dans PBS.
   3. Laver 2x avec PBS.
   4. Ajouter l’anticorps secondaire dilué, en PBS, étiqueté fluorescent, Alexa Fluor 488 (1:500), et incuber pendant 2 h à RT dans un endroit protégé de la lumière (250 μL par puits de diapositives de chambre de 4 puits)
   5. Laver 2x avec PBS.
   6. Ajouter le dilué, en PBS, DAPI (concentration de 300 nM) et incuber pendant 5 min à RT dans un endroit protégé de la lumière (300 μL par puits de diapositives de chambre de 4 puits).
   7. Laver 3x avec PBS.
   8. Montez les diapositives de la chambre en utilisant les instructions suivantes.
      1. Démonter la glissière de chambre en brisant les onglets d’échappée et en enlevant le joint et la base.
      2. Ajoutez une goutte de la solution de montage (voir Tableau des matériaux)par puits de diapositives de chambre de 4 puits. Utilisez ensuite une diapositive de couverture pour couvrir toute la diapositive.
      3. À l’aide d’une pince à épiler et à un angle, placez un côté du couvercle contre la glissière tout en prenant contact avec le bord extérieur de la goutte liquide.
      4. Inclinez soigneusement le couvercle sur la solution de montage lorsque vous l’abaissez en place. Évitez la création de bulles. Prenez une pointe de pipette et appuyez-la sur le couvercle. Les bulles se déplaceront sur le côté.
         REMARQUE : La formation de bulles est parfois inévitable. Si elle se produit, l’image autour d’eux tant qu’il ya quelques-uns.
      5. Suivez les instructions du fabricant pour le temps de séchage. Évitez d’utiliser des solutions de montage noncurant en raison de la difficulté de manipulation pendant l’imagerie. Sinon, l’utilisation d’un joint de couvercle approprié sur les bords est nécessaire pour empêcher la couverture de glisser pendant l’imagerie.
      6. Pour sceller le couvercle, utilisez du vernis à ongles et faites une petite ligne sur le bord du couvercle. Laisser sécher le vernis à ongles pendant environ 2 min.

6. Acquisition d’images, excroissance de neurite et quantification de l’intensité de fluorescence

REMARQUE : Après la coloration, utilisez un microscope confocal avec un objectif de 20x et une taille d’image de 1024 x 1024 pixels pour acquérir les images des cellules traitées. Prenez l’image au moins à partir de deux champs par réplique biologique par condition. Utilisez ensuite le logiciel d’analyse d’images Fidji (ImageJ 1.51u) pour la quantification de la longueur de la neurite. En bref, mesurer la longueur de la plus longue neurite pour chaque neurone et après la moyenne des valeurs par traitement, utilisez le test t de l’élève pour les groupes indépendants pour comparer les moyens entre les groupes expérimentaux et le groupe témoin.

REMARQUE : Plusieurs programmes commerciaux (Imaris, Volocity, Amira) et open source (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) sont disponibles. Parmi ces programmes, ImageJ est devenu l’outil de choix pour l’analyse d’image biologique^20,21. Le portail ImageJ à https://imagej.net/Introduction est une source d’information utile fournissant une description détaillée des fonctions de base et intégrées d’ImageJ, y compris le traitement d’image, la colocalisation, la déconvolution, l’enregistrement, la segmentation, le suivi et la visualisation.

1. Mesure de l’excroissance neuronale avec un logiciel d’analyse d’images fidji
   1. Comme illustré dans la figure 1, ouvrir l’image soit en la faisant glisser et en la laissant tomber sur le logiciel Fidji ou en sélectionnant fichier | Ouvrir.
   2. Sélectionnez Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement, puis cliquez avec le bouton droit sur l’icône^{5 e} dans la barre d’outils droite et passez à la ligne à main levée. En option, double-cliquez sur la même icône pour changer la largeur de la ligne à 10, puis tracez la plus longue neurite, commençant près du corps cellulaire et s’étendant jusqu’à l’extrémité de la neurite.
   3. Appuyez sur Ctrl + T & puis F pour ajouter la mesure au gestionnaire de retour sur investissement et mettre en évidence le neurone mesuré. Sélectionnez tous les numéros du roi, cliquez sur Mesurer, sélectionnez toutes les longueurs calculées et copiez/collez dans une feuille de calcul.
2. Mesure de l’intensité de fluorescence des cellules étiquetées avec un logiciel d’analyse d’images fidji
   1. Comme illustré dans la figure 2, après l’ouverture de l’image, cliquez sur l’icône^{4 e} dans la barre d’outils sélections freehand. Dessinez la forme de la cellule.
   2. Sélectionnez Analyser | Définir les mesures et sélectionner pour les valeurs suivantes : Zone, Densité intégrée, Valeur grise moyenne | Analyser | Mesure (une zone contextuele avec une pile de valeurs s’ouvre).
   3. Sélectionnez une région en regard de la cellule en arrière-plan (la taille n’est pas importante), puis sélectionnez Analyser | Mesure. Sélectionnez toutes les données mesurées et copiez/collez dans une feuille de calcul.
      REMARQUE : La densité intégrée (IntDen) est l’élément utilisé pour déterminer les intensités fluorescentes. Dans cette étude, l’intensité fluorescente de la molécule cible est mesurée pour analyser d’abord sa distribution dans la cellule et par la suite quantifier l’abondance de la molécule cible sous divers traitements. Par conséquent, l’efficacité des traitements sera mesurée et comparée au contrôle.

7. Évaluation de la neurotoxicité

REMARQUE : La cytotoxicité des composés d’essai est évaluée dans des plaques de 384 puits (voir tableau des matériaux)à l’aide d’un test de viabilité des cellules luminescentes (voir tableau des matériaux). Les PNSP sont préparés selon la même méthode, à l’exception de légères modifications, décrites dans la section « Différenciation et traitement des PNSP ». Par la suite, un signal luminescent généré par l’essai de viabilité des cellules luminescentes est mesuré à l’aide d’un lecteur de microplaques. Le signal luminescent est proportionnel à la concentration d’ATP cellulaire qui elle-même est directement proportionnelle au nombre de cellules viables présentes dans chaque puits.

1. Revêtement
   1. Ajouter 30 μL de poly-L-lysine (PLL) par puits de plaque de 384 puits.
   2. Incuber pendant 1 h chez RT.
   3. Laver 2x avec PBS.
   4. Laissez sécher à RT (pendant environ 30 min).
   5. Ajouter 30 μL de laminine (50 μg/mL) par puits de plaque de 384 puits.
   6. Incuber pendant 2 h à 37 °C.
   7. Laver 2x avec PBS.
      REMARQUE : Les plaques enduites de 384 puits peuvent être conservées à 4 °C pendant 1 mois.
2. Placage des cellules
   1. Compter et plaquer 20 000 neurosphères à cellules uniques par puits de plaque de 384 puits dans 25 μL de milieux de différenciation.
   2. Incuber pendant 5 jours à 37 °C.
   3. Après 5 jours, traiter les cellules pendant 24 h par des composés d’essai préparés à 6x la concentration finale désirée en volume de 5 μL (pour faire le volume final de 30 μL par puits).
3. Test de viabilité cellulaire
   1. Ajouter 30 μL de réactif de viabilité des cellules luminescentes par puits de plaque de 384 puits.
      REMARQUE : Ajoutez un volume de réactif de test de viabilité cellulaire luminescente égal au volume présent dans chaque puits. Décongeler le réactif de viabilité des cellules luminescentes et équilibrer le rt avant l’utilisation.
   2. Agiter sur un shaker pendant 2 minutes (pour mélanger et induire la lyse cellulaire).
   3. Faire tourner le mélange vers le bas par centrifugation à 300-400 x g pour 30 s.
   4. Incuber la plaque de 384 puits pendant 10 min à RT dans un endroit protégé de la lumière (pour stabiliser le signal luminescent).
   5. Enregistrez la luminescence avec un lecteur de microplaques.
      REMARQUE : Utilisez des contrôles appropriés pour l’analyse de viabilité, y compris velcade (à une concentration finale de 10 μM) comme positif et HBSS contenant DMSO (avec une concentration finale de 0,1% ou 0,2%) comme contrôle négatif.

Résultats

Le protocole présenté dans le manuscrit a été utilisé avec succès dans deux articles récemment publiés^22,23. La figure 3 démontre l’utilisation de neurones dérivés des HNPC pour examiner l’effet des inhibiteurs du HDAC comme composés épigénétiques sur l’extension des neurites comme marqueur de l’excroissance des neurites et de la capacité neurogénique subséquente des composés de petites molécules.

Discussion

Ce protocole est l’un des rares articles publiés décrivant le test de longueur de neurite lors du traitement avec des composés d’essai. En outre, nous décrivons comment employer des hNPC pour un essai de neure de excroissance et évaluation de neurotoxicité. En utilisant cet essai d’excroissance de neure et l’évaluation de neurotoxicité sur les neurones dérivés des HNPC, le potentiel neurogénique d’une catégorie de composés épigénétiques à petites molécules, inhibiteurs du HDAC, dans l’induct...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well Glass Chamber Slides	Sigma	PEZGS0816
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001
Alexa Fluor 594	Invitrogen	R37117
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062
Anti-β-Tubulin III	Thermo	MA1-118X
B27	Thermo	17504001
B27 - minus vitamin A	Thermo	12587010
BDNF	PeproTech	450-02
BSA	Sigma	A8531
CellTiter-Glo	Promega	G7572
CoolCell	Corning	432000	Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930	Cryopreservation medium containing 10% DMSO
DAPI	Thermo	D1306
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	Sigma	34869-100ML
EGF	Gibco	PHG0311
FGF	Gibco	PHG6015
Formaldehyde	Thermo	FB002
GDNF	PeproTech	450-10
Glutamax	Gibco	35050061	L-alanyl-L-glutamine supplement
Goat Serum	Thermo	50062Z
Heparin	Calbiochem	375095
Laminin	Sigma	L2020-1MG
L-Ascorbic Acid	Sigma	A92902-25G
L-lysine	Sigma	L5501
MEM non-essential amino acids	Gibco	11140050
mFreSR	StemCell Technologies	5854	Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
N2	Gibco	17502048
NaCl	Sigma	71376
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates	Thermo	164610
PBS	Thermo	10010-049
Poly-L-lysine	Sigma	P5899-5MG
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo	P10144
Retinoic Acid	Sigma	R2625
Sodium Azide	Sigma	S2002
StemPro Accutase	Gibco	A1110501	Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes
Synaptophysin	Thermo	MA5-14532
Tris Base	Sigma	10708976001
Triton X-100	Sigma	X100-100ML