Um ensaio de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade com neurônios derivados de células progenitoras neugenitoras humanas

Resumo

O protocolo apresentado descreve um método para um ensaio de crescimento de neurite e avaliação neurotoxicidade de compostos de moléculas pequenas.

Resumo

O ensaio de crescimento de neurita e a avaliação da neurotoxicidade são dois estudos importantes que podem ser realizados utilizando o método aqui apresentado. Este protocolo fornece uma análise confiável da morfologia neuronal juntamente com medições quantitativas de modificações no comprimento do neurite e localização de proteína sináptica e abundância após o tratamento com pequenos compostos de moléculas. Além da aplicação do método apresentado em estudos de crescimento de neurite, a avaliação da neurotoxicidade pode ser realizada para avaliar, distinguir e classificar compostos químicos comerciais com base em seu potencial efeito neurotoxicidade no desenvolvimento.

Embora as linhas celulares sejam hoje amplamente utilizadas em ensaios de triagem composta em neurociência, elas geralmente diferem geneticamente e fenotipicamente de sua origem tecidual. As células primárias, por outro lado, mantêm marcadores e funções importantes observados in vivo. Portanto, devido ao potencial de tradução e relevância fisiológica que essas células poderiam oferecer ensaio de crescimento neurite e avaliação da neurotoxicidade pode beneficiar consideravelmente do uso de células progenitoras neurais humanas (hNPCs) como o modelo primário de células humanas.

O método aqui apresentado pode ser utilizado para testar a capacidade dos compostos de induzir o crescimento e neurotoxicidade neurita, aproveitando-se dos neurônios derivados de células progenitoras neurais, um modelo celular que representa de perto a biologia humana."

Introdução

O crescimento da neurita é um processo fundamental para a formação da rede neuronal e da regeneração nervosa^1,2. Após uma lesão, o crescimento de neurite desempenha um papel fundamental na regeneração do sistema nervoso. O crescimento da neurita também é um elemento importante da sinalização extracelular na indução de atividades regenerativas neuronais para melhorar os desfechos para distúrbios neurodegenerativos e lesões neuronais^3,,4,,5,6.

Mantendo seu potencial de diferenciação na produção de várias linhagens neurais, as células progenitoras neurais humanas (hNPCs) poderiam fornecer um sistema modelo para estudos da função e desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC)^7,,8,,9. Alto potencial translacional e relevância fisiológica dos hNPCs como modelo primário de células humanas oferecem uma vantagem considerável nos exames de descoberta de drogas relacionados ao crescimento de neurite. No entanto, a manutenção e o dimensionamento dos modelos de células primárias para ensaios de alto rendimento podem ser demorados e intensivos em mão-de-obra^10,11,,12,13.

Além da aplicação do método apresentado em estudos de crescimento de neurite, a avaliação da neurotoxicidade é outra aplicação utilizando os neurônios derivados do hNPC. Existem milhares de compostos químicos comerciais que não são examinados ou com potencial de neurotoxicidade mal compreendido. Portanto, experimentos de triagem mais confiáveis e eficazes para avaliar, distinguir e classificar compostos com base em seu potencial para obter neurotoxicidade do desenvolvimento está em alta demanda¹⁴. O aumento da prevalência e incidência de distúrbios neurológicos, juntamente com a abundância de compostos não testados no ambiente, requer o desenvolvimento de experimentos mais confiáveis e eficientes para identificar compostos ambientais perigosos que possam representar neurotoxicidade¹⁵.

O método aqui apresentado pode ser utilizado para testar a capacidade dos compostos de induzir o crescimento e neurotoxicidade neurita, aproveitando-se dos neurônios derivados de células progenitoras neurais humanas, um modelo celular que representa de perto a biologia humana.

Protocolo

Declaração ética: Os espécimes fetais foram recebidos do Laboratório de Pesquisa de Defeitos de Nascimento da Universidade de Washington, em Seattle, por meio de um programa de distribuição de tecidos apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH). O Laboratório de Pesquisa de Defeitos de Nascimento obteve o consentimento informado por escrito adequado dos pais e a aquisição de tecidos foi monitorada pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Washington. Todo o trabalho foi realizado com aprovação do Escritório de Pesquisa de Sujeitos Humanos da Universidade de Miami⁸.

1. Isolamento e cultura de células progenitoras neurais humanas (hNPCs)

1. Coloque o tecido cerebral em uma placa de Petri de 100 mm e remova cuidadosamente as meninges usando fórceps.
2. Transfira o tecido cerebral para um tubo cônico de 50 mL e lave-o duas vezes com 20 mL de PBS invertendo suavemente o tubo.
3. Incubar o tecido cerebral em um novo tubo cônico de 50 mL submergindo o tecido na solução de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) e DNase I (10 U/mL) por 10 min a 37 °C.
4. Adicione 5 mL de meio de cultura celular neuronal (ver Tabela de Materiais) ao tecido cerebral contendo tubo e dissociar mecanicamente as neurosferas triturando 20 a 30 vezes através de uma ponta de tubulação de 1000 μL para fazer uma suspensão unicelular.
5. Filtre a suspensão da célula através de um coador de células de 70 μm para remover aglomerados celulares.
6. Semente a suspensão unicelular em um frasco T-25 ventilado fornecido com 5-10 mL de cultura celular neuronal complementada com componentes detalhados na Tabela 1.
   1. Esterilize a solução de heparina através de um filtro de 0,2 μm. O suplemento B-27 sem Vitamina A é um suplemento livre de soro para o cultivo de progenitores neurais e células-tronco, sem induzir diferenciação.
      NOTA: As células progenitoras neurais humanas (hNPCs) são isoladas do cérebro fetal humano coletado do feto abortado. Após 7-10 dias na cultura, as células-tronco neurais (NSCs) formam colônias neuroferas flutuantes livres, enquanto outros tipos de células permanecem em suspensão como células únicas ou anexadas ao fundo do frasco. Os hNPCs isolados podem ser cultivados como neurosferas em suspensão por vários^{meses 8,,16,17}.

Quantidade	Componente
100 μL	EGF (20 ng/mL)
100 μL	FGF (10 ng/mL)
2 mL	B-27, Menos vitamina A (50X)
1 mL	L-alanyl-L-glutamina (100X) (ver tabela de materiais)
4 μL	Heparina (2 μg/mL)
96,8 mL	Meio de cultura celular neuronal (ver tabela de materiais)

Mesa 1. Componentes necessários para fazer 100 mL de mídia cultural

2. Passaging the hNPCs

1. Colete os meios que contêm as esferas flutuantes, neuroesferas grandes e pequenas, e transfira-as para um tubo cônico de 50 mL.
   NOTA: Devido a razões desconhecidas, o tempo para a divisão das neurosferas é variável de 7 dias até 30 dias. No entanto, geralmente, as neurosferas precisam ser passagemdas quando atingem um diâmetro superior a 700-900 μm. É quando o centro da neurosfera começa a escurecer, o que é considerado como um sinal de alta taxa de morte celular¹⁸.
2. Gire as neurosferas por centrifugação a 300-400 x g por 3 min.
3. Aspire cuidadosamente o supernasciante e, em seguida, submergir as esferas em 500 μL de reagente de dissociação celular descongelada (ver Tabela de Materiais).
   1. Faça alíquotas de reagente de dissociação celular adicionando 500 μL por microtubos de 1,5 mL e armazene a -20 °C. Para evitar perder a atividade enzimática, descongele o reagente de dissociação celular segurando no RT ou quente por 5 minutos em um banho de água/contas de 37 °C.
4. Dependendo da densidade e tamanho das esferas, incubar as esferas submersas a 37 °C por 5-15 min.
5. Adicione 5-10 mL de mídia de cultura pré-aquecida às neuroesferas contendo tubo cônico de 50 mL e centrífuga a 300-400 x g por 5 min para sedimentar as neurosferas.
6. Aspire a supernasce e delicadamente pipeta para cima e para baixo, usando uma pipeta de 1000 μL, em 2 mL de mídia cultural até que todas as neurosferas estejam em uma única suspensão celular.
   NOTA: A dissociação se tornará visível a olho nu. Antes da dissociação, as neurosferas são na forma de esferas. Depois de submergir em reagente de dissociação e por pipetar para cima e para baixo, eles se tornarão células únicas.
   1. Conte as células e as chapas das células únicas, 2 a 3 milhões de células por frasco T-25 em 10 mL de mídia cultural.
7. Alimente as células a cada 3 dias substituindo metade da mídia cultural.
   1. Resolver neuroesferas inclinando o frasco para que ele esteja em seu canto inferior. Segure o frasco na posição por cerca de 1-2 min até que as neurosferas sedimentem. Em seguida, aspire metade da mídia suavemente inserindo a pipeta sorológica na mídia acima das neuroesferas estabelecidas. Células dissociadas podem se agregar para formar esferas após 2 a 3 dias na cultura¹⁹.

3. Congelamento dos hNPCs

1. Prepare o meio de congelamento celular adicionando DMSO aos meios de cultura a uma concentração final de 10% (v/v) ou use meio de criopreservação disponível comercialmente para tipos de células sensíveis (ver Tabela de Materiais).
2. Classifique grandes esferas transferindo a mídia para um tubo cônico de 50 mL e deixando as esferas se estabelecerem pela gravidade. Em seguida, remova e transfira as grandes neuroesferas em um novo tubo cônico de 50 mL para a passagem usando uma ponta de tubulação de 200 ou 1000 μL.
   NOTA: Neuroesferas com diâmetro superior a 900 μm são consideradas grandes e as com diâmetro menor que 500 μm são consideradas pequenas.
3. Gire as neuroferas restantes por centrifugação a 300-400 x g por 3 min. Remova cuidadosamente o supernasce.
4. Resuspend até 100 esferas em 1 mL de reagente criopreservação e transferi-lo para um criotube.
5. Armazene durante a noite a -80 °C em um recipiente de congelamento celular (ver Tabela de Materiais) e mova-o para nitrogênio líquido no dia seguinte para armazenamento a longo prazo.
   NOTA: É preferível congelar neuroferas de pequeno a médio porte (com menos de 900 μm de diâmetro) e evitar o congelamento de neuroesferas de grande porte (maiores que 900 μm de diâmetro) ou células únicas. A fim de reduzir os danos celulares durante o descongelamento da amostra, mantenha as células densas semeando as neuroesferas descongeladas em um pequeno frasco T25.

4. Diferenciação e tratamento de hNPCs

NOTA: Para induzir a diferenciação, as neurosferas são desagregadas em células únicas, contadas e semeadas em placas revestidas por 5 dias. Em seguida, as células diferenciadas são tratadas por 24 h com compostos de teste antes da imunossão e quantificação da fluorescência.

1. Revestimento
   1. Adicione 200 μL de poli-L-lysine (PLL) por poço de lâminas de câmara de vidro de 4 poços (140 μL por poço de lâminas de câmara de 8 poços).
   2. Incubar por 1h à temperatura ambiente (RT).
   3. Lave 3x com PBS.
   4. Deixe secar no RT (por cerca de 30 min).
   5. Adicione 150 μL de laminina (50 μg/mL) por poço de lâminas de câmara de vidro de 4 poços (120 μL por poço de lâminas de câmara de 8 poços).
   6. Incubar por 2 h a 37 °C.
   7. Lave 3x com PBS.
      NOTA: Os slides da câmara revestida podem ser armazenados a 4 °C durante 1 mês.
2. Emplacando as células
   1. Contagem e placa 80.000 neuroesferas de células únicas (neuroesferas em uma única suspensão celular) por poço de lâminas de câmara de 4 poços (70.000 células por poço de 8 poços de deslizamento de câmara).
   2. Adicione 500 μL de mídia de diferenciação por poço de slide de câmara de 4 poços (250 μL de mídia por poço de slides de câmara de 8 poços).
      1. Para tornar a mídia de diferenciação primeiro, adicione os seguintes componentes na Tabela 2 a um recipiente estéril e descartável para fazer a mídia de indução neural (NIM).
      2. Adicione os seguintes ingredientes na Tabela 3 a 48,5 mL de NIM feito na etapa anterior para fazer a mídia de diferenciação.
   3. Incubar por 5 dias a 37 °C.
   4. Após 5 dias, trate as células por 24 h, substituindo metade da mídia em cada poço por mídia fresca misturada com a concentração desejada de compostos de teste, incluindo controles apropriados.

Quantidade	Componente
49 mL	DMEM/F-12
0,5 mL	Suplemento N2 (100X)
0,5 mL	Aminoácidos não essenciais MEM (100X)
2 μL	Heparina (2 μg/mL) (Stock Conc. is 50 mg/mL)

Tabela 2. Componentes necessários para fazer 50 mL de NIM

Quantidade	Componente
1 mL	B-27 (50X)
500 μL	Antibiótico-antimíctico (100X)
5 μL	Ácido retinóico (0,1 μM)
50 μL	GDNF (10 μg/mL)
50 μL	BDNF (10 μg/mL)
5 μL	Ácido ascórbico (0,2 μg/mL) (Stock Conc. is 2 mg/mL) NOTA: Recomendado para ser fresco.
48,5 mL	Nim

Mesa 3. Componentes necessários para fazer 50 mL de mídia de diferenciação

5. Imunocytoquímica (ICC)

NOTA: As células são fixadas com 4% de formaldeído. A permeabilização e o bloqueio são então realizados para melhorar a penetração e prevenir a ligação inespecífica de anticorpos. As células são então incubadas com anticorpos primários durante a noite. Posteriormente, as células são incubadas com anticorpos secundários fluorescentes rotulados. Finalmente, depois de usar o DAPI para manchar o núcleo, os slides da câmara são montados.

1. Fixação
   1. Aspire suavemente a mídia em cada poço.
   2. Adicione 500 μL de 4% de formaldeído por poço de lâminas de câmara de 4 poços (250 μL por poço de lâminas de câmara de 8 poços).
   3. Incubar por 15 min na RT.
   4. Lave suavemente 2x com 500 μL de PBS.
      NOTA: Após a fixação, deixando 1 mL de PBS em cada poço, os slides de cultura podem ser armazenados a 4 °C por até 3 meses.
2. Permeabilização e bloqueio celular
   1. Adicione os seguintes componentes na Tabela 4 a um recipiente estéril e descartável para fazer o tampão de anticorpos (Ab).
   2. Misture os seguintes ingredientes na Tabela 5 com o tampão Ab feito na etapa anterior para fazer a solução de permeabilização e bloqueio da célula.
   3. Adicione 500 μL por poço de lâminas de câmara de 4 poços e incubar por 1h no RT.
      NOTA: O tampão ab pode ser armazenado a 4 °C.

Quantidade	Componente
1,75 g	NaCl (150 mM)
1,2 g	TrisBase (50 mM)
2 g	BSA 1%
3,6 g	L-lysine (100 mM)
8 g	Azida de Sódio (4%)
200 mL	Água destilada. NOTA: Inicialmente dissolva os componentes necessários em 150 mL de água e, em seguida, ajuste para 200 mL.

Mesa 4. Componentes necessários para fazer 200 mL de tampão de anticorpos

Quantidade	Componente
600 μL	Soro de cabra de 20%
6 μL	0,2% Triton-X100
2394 μL	Tampão de anticorpos. NOTA: Inicialmente dissolva os componentes necessários em 2 mL de tampão Ab e, em seguida, ajuste para pH 7.4. Em seguida, adicione mais tampão Ab para ajustar ao volume final de 3 mL e o filtro esterilizar.

Mesa 5. Componentes necessários para fazer 3 mL de solução de permeabilização e bloqueio de células

3. Mancha
   1. Lave 2x com 500 μL de PBS.
   2. Adicione o anticorpo primário diluído, anti-β-tubulin III (1:200) e incubar durante a noite a 4 °C (200 μL por poço de lâminas de câmara de 4 poços). Diluir o anticorpo primário na PBS.
   3. Lave 2x com PBS.
   4. Adicione o diluído, em PBS, anticorpo secundário fluorescentemente rotulado, Alexa Fluor 488 (1:500), e incubar por 2h no RT em um lugar protegido de luz (250 μL por poço de lâminas de câmara de 4 poços)
   5. Lave 2x com PBS.
   6. Adicione o diluído, em PBS, DAPI (concentração de 300 nM) e incubar por 5 min em RT em um lugar protegido de luz (300 μL por poço de lâminas de câmara de 4 poços).
   7. Lave 3x com PBS.
   8. Monte os slides da câmara usando as seguintes instruções.
      1. Desmonte o slide da câmara quebrando as abas de fuga e removendo a junta e a base.
      2. Adicione uma gota da solução de montagem (ver Tabela de Materiais) por poço de slides de câmara de 4 poços. Em seguida, use um slide de cobertura para cobrir todo o slide.
      3. Usando uma pinça e em um ângulo, coloque um lado da tampa escorregando contra o slide enquanto faz contato com a borda externa da gota líquida.
      4. Coloque cuidadosamente a tampa na solução de montagem ao colocá-la no lugar. Evite a criação de bolhas. Pegue uma ponta de pipeta e pressione-a no deslizamento da tampa. As bolhas se movem para o lado.
         NOTA: A formação de bolhas é inevitável às vezes. Se ocorrer, imagem ao seu redor, desde que haja alguns.
      5. Siga as instruções do fabricante para o tempo de cura. Evite usar soluções de montagem sem estação devido à dificuldade de manuseio durante a imagem. Caso contrário, o uso de um selante de deslizamento de cobertura apropriado nas bordas é necessário para evitar que a mancha de cobertura deslize durante a imagem.
      6. Para selar a mancha, use esmalte e faça uma pequena linha na borda do deslizamento da tampa. Deixe o esmalte secar por cerca de 2 minutos.

6. Aquisição de imagem, crescimento de neurite e quantificação da intensidade da fluorescência

NOTA: Após a coloração, use um microscópio confocal com um objetivo de 20x e um tamanho de imagem de 1024 x 1024 pixels para adquirir as imagens das células tratadas. Tirar a imagem pelo menos de dois campos por réplica biológica por condição. Em seguida, use o software de análise de imagem Fiji (ImageJ 1.51u) para quantificação do comprimento do neurite. Brevemente, meça o comprimento do neurite mais longo para cada neurônio e, após a média dos valores por tratamento, use o teste t do aluno para grupos independentes para comparar os meios entre grupos experimentais e grupo controle.

NOTA: Vários programas comerciais (Imaris, Volocity, Amira) e open source (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) estão disponíveis. Entre esses programas, o ImageJ tornou-se a ferramenta de escolha para análise biológica de imagens^20,21. O portal ImageJ em https://imagej.net/Introduction é uma fonte útil de informações que fornecem uma descrição completa das funções básicas e incorporadas do ImageJ, incluindo processamento de imagem, colocalização, desconvolução, registro, segmentação, rastreamento e visualização.

1. Medindo o crescimento neuronal com o software de análise de imagem fiji
   1. Como ilustrado na Figura 1,abra a imagem arrastando-a e soltando-a no software Fiji ou selecionando File | Aberto.
   2. Selecionar analisar | Ferramentas | Gerenciador de ROIe, em seguida, clique com o botão direito do mouse no ícone 5^na barra de ferramentas Reta e mude para linha à mão livre. Opcionalmente, clique duas vezes no mesmo ícone para alterar a largura da linha para 10 e, em seguida, traçar o neurite mais longo, começando perto do corpo celular e estendendo-se até a ponta do neurite.
   3. Pressione Ctrl + T & depois F para adicionar a medição ao Gerenciador de ROI e destacar o neurônio medido. Selecione todos os números no ROI,clique em Medir,selecione todos os comprimentos calculados e copie/cole em uma planilha.
2. Medindo a intensidade da fluorescência de células rotuladas com o software de análise de imagem fiji
   1. Conforme ilustrado na Figura 2, após abrir a imagem, clique no ícone 4^na barra de ferramentas seleções à mão livre. Desenhe a forma da célula.
   2. Selecionar analisar | Definir medidas e selecionar para os seguintes valores: Área, Densidade Integrada, Valor cinza médio | Analisar | Medida (uma caixa pop-up com uma pilha de valores abertos).
   3. Selecione uma região ao lado da célula como plano de fundo (tamanho não é importante) e, em seguida, selecione Analisar | Medida. Selecione todos os dados medidos e copie/cole em uma planilha.
      NOTA: Densidade Integrada (IntDen) é o item utilizado para determinar as intensidades fluorescentes. Neste estudo, a intensidade fluorescente da molécula-alvo é medida para analisar inicialmente sua distribuição na célula e, posteriormente, quantificar a abundância da molécula-alvo sob vários tratamentos. Consequentemente, a eficácia dos tratamentos será medida e comparada com o controle.

7. Avaliação da neurotoxicidade

NOTA: A citotoxicidade dos compostos de ensaio é avaliada em placas de 384 poços (ver Tabela de Materiais) utilizando um ensaio de viabilidade celular luminescente (ver Tabela de Materiais). Os hNPCs são preparados seguindo o mesmo método, exceto pequenas modificações, descritas na seção "Diferenciação e Tratamento de hNPCs". Posteriormente, um sinal luminescente gerado pelo ensaio de viabilidade celular luminescente é medido utilizando um leitor de microplaca. O sinal luminescente é proporcional à concentração de ATP celular que em si é diretamente proporcional ao número de células viáveis presentes em cada poço.

1. Revestimento
   1. Adicione 30 μL de poli-L-lysine (PLL) por poço de placa de 384 poços.
   2. Incubar por 1 h na RT.
   3. Lave 2x com PBS.
   4. Deixe secar no RT (por cerca de 30 min).
   5. Adicione 30 μL de laminina (50 μg/mL) por poço de placa de 384 poços.
   6. Incubar por 2 h a 37 °C.
   7. Lave 2x com PBS.
      NOTA: As placas revestidas de 384 poços podem ser armazenadas a 4 °C durante 1 mês.
2. Emplacando as células
   1. Contagem e placa 20.000 neurosferas de células únicas por poço de placa de 384 poços em 25 μL de mídia de diferenciação.
   2. Incubar por 5 dias a 37 °C.
   3. Após 5 dias, trate as células por 24 h por compostos de teste preparados em 6x a concentração final desejada em volume de 5 μL (para fazer o volume final de 30 μL por poço).
3. Ensaio de viabilidade celular
   1. Adicione 30 μL de reagente de ensaio de viabilidade celular luminescente por poço de placa de 384 poços.
      NOTA: Adicione um volume de reagente de ensaio de viabilidade celular luminescente igual ao volume presente em cada poço. Descongele o reagente de ensaio de viabilidade celular luminescente e equilibre-se ao RT antes de usar.
   2. Agite em um agitador de pratos por 2 minutos (para misturar e induzir a lise celular).
   3. Gire a mistura para baixo por centrifugação a 300-400 x g para 30 s.
   4. Incubar a placa de 384 poços por 10 min no RT em um lugar protegido da luz (para estabilizar o sinal luminescente).
   5. Regisso recorde luminescência com um leitor de microplaca.
      NOTA: Utilize controles apropriados para o ensaio de viabilidade, incluindo Velcade (em uma concentração final de 10 μM) como positivo e HBSS contendo DMSO (com concentração final de 0,1% ou 0,2%) como controle negativo.

Resultados

O protocolo apresentado no manuscrito foi utilizado com sucesso em dois artigos publicados recentemente^22,23. A Figura 3 demonstra o uso de neurônios derivados de hNPCs na análise do efeito dos inibidores de HDAC como compostos epigenéticos na extensão dos neurites como um marcador para o crescimento de neurite e subsequente capacidade neurogênica de compostos de pequenas moléculas.

Além disso, na <...

Discussão

Este protocolo é um dos poucos artigos publicados que descrevem o teste para o comprimento de neurite após o tratamento com compostos de teste. Além disso, descrevemos como usar hNPCs para um ensaio de crescimento de neurito e avaliação da neurotoxicidade. Utilizando este ensaio de crescimento neurite e avaliação neurotoxicidade em neurônios derivados de hNPCs, o potencial neurogênico de uma categoria de compostos epigenéticos de pequenas moléculas, inibidores de HDAC, na indução do crescimento de neurite é...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well Glass Chamber Slides	Sigma	PEZGS0816
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001
Alexa Fluor 594	Invitrogen	R37117
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062
Anti-β-Tubulin III	Thermo	MA1-118X
B27	Thermo	17504001
B27 - minus vitamin A	Thermo	12587010
BDNF	PeproTech	450-02
BSA	Sigma	A8531
CellTiter-Glo	Promega	G7572
CoolCell	Corning	432000	Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930	Cryopreservation medium containing 10% DMSO
DAPI	Thermo	D1306
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	Sigma	34869-100ML
EGF	Gibco	PHG0311
FGF	Gibco	PHG6015
Formaldehyde	Thermo	FB002
GDNF	PeproTech	450-10
Glutamax	Gibco	35050061	L-alanyl-L-glutamine supplement
Goat Serum	Thermo	50062Z
Heparin	Calbiochem	375095
Laminin	Sigma	L2020-1MG
L-Ascorbic Acid	Sigma	A92902-25G
L-lysine	Sigma	L5501
MEM non-essential amino acids	Gibco	11140050
mFreSR	StemCell Technologies	5854	Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
N2	Gibco	17502048
NaCl	Sigma	71376
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates	Thermo	164610
PBS	Thermo	10010-049
Poly-L-lysine	Sigma	P5899-5MG
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo	P10144
Retinoic Acid	Sigma	R2625
Sodium Azide	Sigma	S2002
StemPro Accutase	Gibco	A1110501	Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes
Synaptophysin	Thermo	MA5-14532
Tris Base	Sigma	10708976001
Triton X-100	Sigma	X100-100ML