İnsan Nöral Progenitor Hücre Kaynaklı Nöronlar ile Bir Neurite Outgrowth Assa ve Nörotoksisite Değerlendirmesi

Özet

Sunulan protokol, küçük molekül bileşiklerinin nörat dışı büyüme testini ve nörotoksisite değerlendirmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Özet

Neurite outgrowth tsay ve nörotoksisite değerlendirmesi burada sunulan yöntem kullanılarak yapılabilir iki önemli çalışmalardır. Bu protokol, nöronal morfolojinin, küçük molekül bileşikleri ile tedavi üzerine nötrit uzunluğu ve sinaptik protein lokalizasyonu ve bolluğu üzerine yapılan değişikliklerin nicel ölçümleri ile birlikte güvenilir bir analiz sağlar. Neurite outgrowth çalışmalarında sunulan yöntemin uygulanmasına ek olarak, potansiyel gelişimsel nörotoksisite etkisine göre ticari kimyasal bileşikleri değerlendirmek, ayırt etmek ve sıralamak için nörotoksisite değerlendirmesi yapılabilir.

Hücre hatları günümüzde yaygın olarak nörolojik bileşik tarama tahlillerinde kullanılan olsa da, genellikle genetik ve fenotipik doku kökenlerinden farklıdır. Birincil hücreler ise in vivo gözlenen önemli belirteçleri ve işlevleri korurlar. Bu nedenle, çeviri potansiyeli ve fizyolojik alaka nedeniyle bu hücrelerin neurite outgrowth çıkış ve nörotoksisite değerlendirmesi sunabilir önemli ölçüde birincil insan hücre modeli olarak insan nöral progenitor hücreleri (hNPCs) kullanarak yararlanabilir.

Burada sunulan yöntem, bileşiklerin insan nöral progenitor hücre kaynaklı nöronlardan yararlanarak nötrat büyümesini ve nörotoksisiteyi tetikleme yeteneğini taramak için kullanılabilir."

Giriş

Neurite büyüme nöronal ağ ve sinir rejenerasyon oluşumu için temel bir süreçtir^1,2. Bir yaralanma sonrasında, neurite outgrowth sinir sisteminin yenilenmesinde önemli bir rol oynar. Neurite outgrowth da nörodejeneratif^,bozukluklar ve nöronal yaralanma^3,4,5,6sonuçlarını artırmak için nöronal rejeneratif faaliyetleri indükleyen ekstrasellüler sinyal önemli bir unsurdur .

Çeşitli nöral soy üreten kendi farklılaşma potansiyelini koruyarak, insan nöral progenitor hücreleri (hNPCs) merkezi sinir sistemi çalışmaları için bir model sistemi sağlayabilir (CNS) fonksiyonu ve gelişimi^7,8,9. HNP'lerin birincil insan hücresi modeli olarak yüksek çeviri potansiyeli ve fizyolojik önemi, neurite büyümeye bağlı ilaç keşif taramalarında önemli bir avantaj sağlamaktadır. Ancak, bakım ve yüksek iş gücü tahlilleri için birincil hücre modelleri ölçekleme zaman alıcı ve emek yoğun^{olabilir 10,11,12,13}.

Neurite outgrowth çalışmalarında sunulan yöntemin uygulanmasına ek olarak, nörotoksisite değerlendirmesi hNPC kaynaklı nöronlar kullanılarak başka bir uygulamadır. Ya incelenmemiş ya da kötü anlaşılmış nörotoksisite potansiyeline sahip binlerce ticari kimyasal bileşik vardır. Bu nedenle, daha güvenilir ve etkili tarama deneyleri değerlendirmek için, ayırt etmek ve gelişimsel nörotoksisite ortaya potansiyeline dayalı bileşiklersıralamak için yüksek talep¹⁴. Ortamda denenmemiş bileşiklerin bolluğu ile birlikte nörolojik hastalıkların yaygınlık ve insidansı artış nörotoksisite 15 oluşturabilecek tehlikeli çevresel bileşikleri belirlemek için daha güvenilir ve verimli deneylergeliştirilmesini gerektirir¹⁵.

Burada sunulan yöntem, bileşiklerin insan nöral progenitor hücre kaynaklı nöronlardan yararlanarak nötrat büyümesini ve nörotoksisiteyi tetikleme yeteneğini taramak için kullanılabilir.

Protokol

Etik Açıklama: Fetal örnekler, Seattle'daki Washington Üniversitesi Doğum Kusurları Araştırma Laboratuvarı'ndan Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) tarafından desteklenen bir doku dağıtım programı ile alındı. Doğum Kusurları Araştırma Laboratuvarı velilerden uygun yazılı bilgilendirilmiş onam aldı ve doku ların temini Washington Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından izlendi. Tüm çalışma Miami^{Üniversitesi'nde}İnsan Konu Araştırma Ofisi tarafından onaylanması ile yapıldı 8 .

1. İnsan nöral progenitor hücrelerinin (hNPCs) izolasyonu ve kültürü

1. Beyin dokusunu 100 mm'lik petri kabına yerleştirin ve forceps kullanarak menenjleri dikkatlice çıkarın.
2. Beyin dokusunu 50 mL konik bir tüpe aktarın ve tüpü hafifçe ters çevirerek 20 mL PBS ile iki kez yıkayın.
3. Hücre ayrıştırma çözeltisindeki dokuyu batırarak beyin dokusunu 50 mL konik tüpe yerleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve DNase I (10 U/mL) 10 dakika boyunca 37 °C'de.
4. Tüp içeren beyin dokusuna 5 mL nöronal hücre kültürü ortamı (bkz. Malzeme Tablosu)ekleyin ve tek hücreli süspansiyon yapmak için 1000 μL pipet ucu ile 20 ila 30 kez üçleme yaparak nörosferleri mekanik olarak ayrıştırın.
5. Hücre kümelerini kaldırmak için hücre süspansiyonuna 70 μm'lik bir süzgeçten süzün.
6. Tablo 1'deayrıntılı bileşenlerle desteklenen 5-10 mL nöronal hücre kültürü ortamı ile sağlanan bir havalandırmalı T-25 şişesinde tek hücreli süspansiyon tohum.
   1. Heparin çözeltisini 0,2 μm filtre ile filtreleyerek sterilize edin. A vitamini olmadan B-27 takviyesi nöral atalar ve kök hücrelerin ekimi için serumsuz bir ektir, farklılaşma indüklemeden.
      NOT: İnsan nöral progenitor hücreleri (hNPCs) iptal fetus toplanan insan fetal beyin izole edilir. Kültürde 7-10 gün geçirdikten sonra, nöral kök hücreler (NSC' ler) serbest yüzen nörosfer kolonileri oluştururken, diğer hücre tipleri tek hücre olarak süspansiyonda kalır veya şişenin altına bağlanır. İzole hNPCs birkaç ay için süspansiyon nörosferler olarak kültürlü olabilir^8,16,17.

Tutar	Bileşen
100 μL	EGF (20 ng/mL)
100 μL	FGF (10 ng/mL)
2 mL	B-27, Eksi A vitamini (50X)
1 mL	L-alanyl-L-glutamin (100X) (bkz. malzeme tablosu)
4 μL	Heparin (2 g/mL)
96,8 mL	Nöronal hücre kültürü ortamı (bkz. malzeme tablosu)

Tablo 1. 100 mL kültür ortamı yapmak için gerekli bileşenler

2. HNPC'lerin geçişi

1. Yüzen küreler, büyük ve küçük nörosferler içeren ortamları toplayın ve bunları 50 mL konik tüpe aktarın.
   NOT: Bilinmeyen nedenlerden dolayı, nörosferlerin bölünmesinin zamanlaması 7 günden 30 güne kadar değişkendir. Ancak, genellikle, nörosferler 700-900 μm daha büyük bir çapa ulaştığında geçit edilmesi gerekir. Bu nörosferin merkezi kararmaya başlar, hangi hücre ölümü yüksek bir oranı bir işareti olarak kabul edilir¹⁸.
2. 3 dk için 300-400 x g santrifüj ile aşağı nörosferler spin.
3. Supernatant'ı dikkatlice aspire edin ve sonra küreleri 500 μL'lik çözülmüş hücre ayrışma reaktifinde batırın (bkz. Malzemeler Tablosu).
   1. 1,5 mL mikrotüpler başına 500 μL ekleyerek hücre bölünmesi reaktifinin aliquots olun ve -20 °C'de saklayın. Enzim aktivitesini kaybetmemek için, 37 °C'lik su/boncuk banyosunda RT'de veya sıcakta 5 dakika bekleterek hücre bölünmesi reaktifini eritin.
4. Kürelerin yoğunluğuna ve büyüklüğüne bağlı olarak, 37 °C'de batık küreleri 5-15 dakika kuluçkaya yatırın.
5. 5 dk nörosferleri tortulamak için 50 mL konik tüp ve 300-400 x g'de santrifüj içeren nörosferlere 5-10 mL önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin.
6. 1000 μL'lik bir pipet kullanarak, tüm nörosferler tek hücreli süspansiyona gelene kadar 2 mL kültür medyasında süpernatant ve hafifçe pipetaspire edin.
   NOT: Dissociation çıplak gözle görünür hale gelecektir. Dissociation önce, nörosferler küreler şeklindedir. Dissociation reaktifine daldırıladıktan ve yukarı ve aşağı borular birleştirdikten sonra tek hücre haline gelecektir.
   1. Hücreleri sayın ve tek hücreleri plakalayın, Kültür medyasının 10 mL'inde T-25 şişesi başına 2 ila 3 milyon hücre.
7. Kültür ortamının yarısını değiştirerek hücreleri 3 günde bir besleyin.
   1. Alt köşesinde olacak şekilde şişeyi yaslayarak nörosferleri yerleştirin. Nörosferler tortu kadar yaklaşık 1-2 dakika pozisyonda şişe tutun. Daha sonra yerleşmiş nörosferlerin üzerinde ortama serolojik pipet takarak ortamın yarısını nazikçe aspire edin. Ayrıştırılmış hücreler kültür¹⁹2-3 gün sonra küreler oluşturmak için biraraya gelebilir.

3. HNP'lerin dondurulması

1. DMSO'yu kültür ortamına %10 'lık (v/v) nihai konsantrasyona ekleyerek hücre dondurma ortamını hazırlayın veya hassas hücre tipleri için ticari olarak kullanılabilen kriyopreservation ortamı kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
2. Ortamı 50 mL konik bir tüpe aktararak ve kürelerin yer çekimine göre yerleşmesine izin vererek büyük küreleri sıralayın. Daha sonra büyük nörosferleri 200 veya 1000 μL'lik pipet ucu kullanarak geçmek için 50 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın ve çıkarın.
   NOT: Çapı 900 μm'den büyük olan nöroküreler büyük, çapı 500 μm'den küçük olanlar ise küçük olarak kabul edilir.
3. Kalan nörosferleri 3 dk. için 300-400 x g santrifüj ile aşağı doğru çevirin.
4. 1 mL kriyopreservation reaktifinde 100 küreye kadar yeniden askıya alın ve bir kriyotube aktarın.
5. Bir hücre dondurma kabında -80 °C'de geceleme (Bkz. Malzeme Tablosu)ve uzun süreli depolama için ertesi gün sıvı nitrojene taşıyın.
   NOT: Küçük ve orta büyüklükteki nörosferlerin dondurulması (çapı 900 μm'den düşük) ve büyük boyutlu nörosferlerin (çapı 900 μm'den büyük) veya tek hücrelerin dondurulmasını önlemek tercih edilir. Örneğin erimesırasında hücre hasarını azaltmak için, çözülmüş nörosferleri küçük bir T25 şişesine tohumlayarak hücreleri yoğun tutun.

4. HNP'lerin farklılaşması ve tedavisi

NOT: Farklılaşmayı sağlamak için nöroküreler tek hücrelere ayrıştırılır, sayılmaktadır ve 5 gün boyunca kaplanmış plakalar üzerinde tohumlanır. Daha sonra farklılaşmış hücreler immünboyama ve floresan nicelleştirme den önce test bileşikleri ile 24 saat tedavi edilir.

1. Kaplama
   1. 4 kuyulu cam oda kaydıraklar (8 kuyulu oda slaytlar kuyubaşına 140 μL) başına 200 μL poli-L-l-lizin (PLL) ekleyin.
   2. Oda sıcaklığında 1 saat (RT) için kuluçka.
   3. PBS ile 3x yıkayın.
   4. RT (yaklaşık 30 dakika) kuruolsun.
   5. 4 kuyulu cam hazne slaytları kuyubaşına 150 μL laminin (50 μg/mL) ekleyin (8 kuyulu hazneli slaytların kuyusu başına 120 μL).
   6. 37 °C'de 2 saat kuluçka.
   7. PBS ile 3x yıkayın.
      NOT: Kaplamalı hazne slaytları 4 °C'de 1 ay saklanabilir.
2. Hücreleri kaplama
   1. Sayısı ve plaka 80.000 tek hücreli nörosferler (tek bir hücre süspansiyon nörosferler) 4-iyi oda slaytlar kuyu başına (8-iyi oda slayt kuyu başına 70.000 hücre).
   2. 4 kuyulu oda slaytı kuyubaşına 500 μL ayırım ortamı ekleyin (8 kuyulu oda slaytları kuyubaşına 250 μL ortam).
      1. Farklılaşma ortamını ilk yapmak için, nöral indükleme ortamı (NIM) yapmak için tablo 2'deki aşağıdaki bileşenleri steril, tek kullanımlık bir kapsayıcıya ekleyin.
      2. Farklılaşma ortamı nı yapmak için bir önceki adımda yapılan NIM'in Tablo 3 ila 48,5 mL'sine aşağıdaki malzemeleri ekleyin.
   3. 37 °C'de 5 gün kuluçkaya yatırın.
   4. 5 gün sonra, her kuyudaki ortamın yarısını, uygun kontroller de dahil olmak üzere test bileşiklerinin istenilen konsantrasyonuyla karıştırılmış taze ortamla değiştirerek hücreleri 24 saat boyunca tedavi edin.

Tutar	Bileşen
49 mL	DMEM/F-12
0,5 mL	N2 takviyesi (100X)
0,5 mL	MEM esansiyel olmayan amino asitler (100X)
2 μL	Heparin (2 μg/mL) (Stok Conc. 50 mg/mL'dir)

Tablo 2. NIM 50 mL yapmak için gerekli bileşenler

Tutar	Bileşen
1 mL	B-27 (50X)
500 μL	Antibiyotik-Antimikotik (100X)
5 μL	Retinoik asit (0.1 μM)
50 μL	GDNF (10 g/mL)
50 μL	BDNF (10 g/mL)
5 μL	Askorbik asit (0.2 μg/mL) (Stok Conc. 2 mg/mL'dir) NOT: Taze yapılması önerilir.
48,5 mL	Nim

Tablo 3. 50 mL farklılaştırma ortamı yapmak için gerekli bileşenler

5. İmmünositokimya (ICC)

NOT: Hücreler %4 formaldehit ile sabitlenir. Permeabilizasyon ve engelleme daha sonra penetrasyonu artırmak ve antikorların nonspesifik bağlanmasını önlemek için yapılır. Hücreler daha sonra bir gecede primer antikorlar ile kuluçkaya yatırılır. Daha sonra hücreler floresan olarak etiketlenmiş ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırılır. Son olarak, çekirdeği lekelemek için DAPI kullandıktan sonra, oda slaytlar monte edilir.

1. Fiksasyon
   1. Yavaşça her kuyuda medya aspire.
   2. 4 kuyulu oda slaytları kuyubaşına 500 μL %4 formaldehit ekleyin (8 kuyulu hazne slaytların kuyusu başına 250 μL).
   3. RT'de 15 dakika kuluçka.
   4. 2x'i 500 μL PBS ile hafifçe yıkayın.
      NOT: Fiksasyondan sonra her kuyuda 1 mL PBS bırakılarak kültür slaytları 4 °C'de 3 aya kadar saklanabilir.
2. Hücre permeabilizasyonu ve bloke etme
   1. Antikor (Ab) tamponu yapmak için tablo 4'teki aşağıdaki bileşenleri steril, tek kullanımlık bir kaba ekleyin.
   2. Hücre permeabilizasyon ve engelleme çözeltisi yapmak için bir önceki adımda yapılan Ab tamponu ile Tablo 5'te aşağıdaki maddeleri karıştırın.
   3. 4 kuyulu oda slaytları kuyu başına 500 μL ekleyin ve RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: Ab tamponu 4 °C'de saklanabilir.

Tutar	Bileşen
1.75 g	NaCl (150 mM)
1.2 g	TrisBase (50 mM)
2 g	BSA 1%
3.6 g	L-lizin (100 mM)
8 g	Sodyum Azit (%4)
200 mL	Distile su. NOT: Başlangıçta gerekli bileşenleri 150 mL suda çözün, ardından 200 mL'ye ayarlayın.

Tablo 4. 200 mL Antikor tamponu yapmak için gerekli bileşenler

Tutar	Bileşen
600 μL	%20 Keçi serumu
6 μL	%0.2 Triton-X100
2394 μL	Antikor tamponu. NOT: Başlangıçta gerekli bileşenleri 2 mL Ab arabelleği içinde çözün ve sonra pH 7.4'e ayarlayın. Daha sonra 3 mL'nin son hacmine ayarlamak için daha fazla Ab arabelleği ekleyin ve sterilize edin.

Tablo 5. 3 mL hücre permeabilizasyonu ve engelleme çözeltisi yapmak için gerekli bileşenler

3. Boy -ama
   1. 500 μL PBS ile 2 x yıkayın.
   2. Seyreltilmiş primer antikor, anti-β-tubulin III (1:200) ve 4 °C (4-iyi oda slaytlar kuyu başına 200 μL) gecede kuluçka ekleyin. PBS'deki primer antikorseyreltin.
   3. PBS ile 2x yıkayın.
   4. Seyreltilmiş, PBS, floresan ikincil antikor, Alexa Fluor 488 (1:500) etiketli ve ışıktan korunan bir yerde RT 2 saat için kuluçka (4-iyi oda slaytlar kuyu başına 250 μL) ekleyin
   5. PBS ile 2x yıkayın.
   6. Seyreltilmiş, PBS, DAPI (300 nM konsantrasyonu) ve ışıktan korunan bir yerde RT 5 dakika kuluçka (4-iyi oda slaytlar kuyu başına 300 μL).
   7. PBS ile 3x yıkayın.
   8. Aşağıdaki yönergeleri kullanarak oda slaytlarını monte edin.
      1. Ayrılık sekmelerini kırarak ve conta ve tabanı çıkararak oda slaytını ayırın.
      2. 4 kuyulu oda slaytlarının kuyusu başına montaj çözeltisi (Bkz. Malzeme Tablosu)bir damla ekleyin. Ardından tüm slaydı kapsayacak şekilde bir kapak slaytı kullanın.
      3. Bir cıvık ve bir açıyla, sıvı damlanın dış kenarı ile temas ederken kapağın bir tarafını kaydırağa doğru yerleştirin.
      4. Yerine indirirken kapak lıyı montaj çözeltisinin üzerine dikkatlice getirin. kabarcıklar oluşturulmasını kaçının. Bir pipet ucu alın ve kapak kayma aşağı basın. Kabarcıklar yana doğru hareket edecek.
         NOT: Kabarcık oluşumu zaman zaman kaçınılmazdır. Oluşursa, birkaç olduğu sürece çevrelerindeki görüntü.
      5. Kür süresi için üreticinin yönergelerini izleyin. Görüntüleme sırasında kullanım zorluğu nedeniyle tedavi edilmeyen montaj çözümlerini kullanmaktan kaçının. Aksi takdirde, görüntüleme sırasında kapak kaymasının kaymasını önlemek için kenarlarda uygun bir kapak lı sızdırmazlık kullanılması gerekir.
      6. Kapak kapağını kapatmak için, oje kullanın ve kapak fişinin kenarında küçük bir çizgi yapın. Yaklaşık 2 dakika boyunca kuru oje izin verin.

6. Görüntü edinimi, neurite büyüme ve floresan yoğunluğu nicelleştirme

NOT: Boyamadan sonra, tedavi edilen hücrelerin görüntülerini elde etmek için 20x nesnel ve 1024 x 1024 piksel görüntü boyutuna sahip bir konfokal mikroskop kullanın. Her koşul da biyolojik çoğaltma başına en az iki alandan görüntü alın. Sonra neurit uzunluğu niteleme için Fiji görüntü analizi yazılımı (ImageJ 1.51u) kullanın. Kısaca, her nöron için en uzun neurit uzunluğunu ölçmek ve tedavi başına değerleri ortalama sonra, deneysel gruplar ve kontrol grubu arasındaki araçları karşılaştırmak için bağımsız gruplar için öğrencinin t testi kullanın.

NOT: Çeşitli ticari (Imaris, Volocity, Amira) ve açık kaynak (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Buzlu, KNIME) görüntü işleme programları mevcuttur. Bu programlar arasında, ImageJ biyolojik görüntü analizi için tercih edilen araç haline gelmiştir^20,21. https://imagej.net/Introduction'daki ImageJ portalı, ImageJ'in temel ve görüntü işleme, kolokalizasyon, dekonvolution, kayıt, segmentasyon, izleme ve görselleştirme gibi yerleşik işlevlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sağlayan yararlı bir bilgi kaynağıdır.

1. Fiji görüntü analiz yazılımı ile nöronal büyümenin ölçülmesi
   1. Şekil 1'degösterildiği gibi, görüntüyü sürükleyip Fiji yazılımına bırakarak veya Dosya' yı seçerek açın | Aç.
   2. Analiz'i Seçin | Araçlar | RoI yöneticisi, ve sonra sağ araç çubuğudüz ⁵ simgesine tıklayın ve serbest çizgiyegeçin. İsteğe bağlı olarak, satır genişliğini 10'a değiştirmek için aynı simgeye çift tıklayın ve ardından hücre gövdesinin yakınından başlayıp neuritin ucuna kadar uzanan en uzun neurite'yi takip edin.
   3. Ölçümü Yatırım Getirisi Yöneticisi'ne eklemek ve ölçülen nöronu vurgulamak için Ctrl + T & F tuşuna basın. YG'dekitüm sayıları seçin, Ölçü'yetıklayın, hesaplanan tüm uzunlukları seçin ve elektronik tabloya kopyalayın/yapıştırın.
2. Fiji görüntü analiz yazılımı ile etiketli hücrelerin floresan yoğunluğunun ölçülmesi
   1. Şekil 2'degösterildiği gibi, resmi açtıktan sonra, araç çubuğu Freehand seçimlerinde4^simgesine tıklayın. Hücrenin şeklini çizin.
   2. Analiz'i Seçin | Ölçümleri ayarlayın ve aşağıdaki değerleri seçin: Alan, Tümleşik yoğunluk, Ortalama gri değer | Analiz Et | Ölçü (bir değer yığını nın açOlduğu açılır kutu).
   3. Arka plan olarak hücrenin yanında bir bölge seçin (boyut önemli değildir) ve ardından Çözümle | Ölçün. Ölçülen tüm verileri seçin ve bir elektronik tabloya kopyalayın/yapıştırın.
      NOT: Entegre Yoğunluk (IntDen), floresan yoğunluklarını belirlemek için kullanılan öğedir. Bu çalışmada hedef molekülün floresan yoğunluğu başlangıçta hücredeki dağılımını analiz etmek ve daha sonra çeşitli tedaviler altında hedef molekülün bolluğunu ölçmek için ölçülür. Sonuç olarak, tedavilerin etkinliği ölçülecek ve kontrol ile karşılaştırılacaktır.

7. Nörotoksisite değerlendirmesi

NOT: Test bileşiklerinin sitotoksisitesi 384 kuyulu plakalarda değerlendirilir (Bkz. Malzemeler Tablosu) Parlak hücre canlılığı testi kullanılarak (bkz. Malzemeler Tablosu). HNPC'ler aynı yöntemle hazırlanır, hafif değişiklikler dışında, "HNPC'lerin Farklılaşması ve Tedavisi" bölümünde açıklanmıştır. Daha sonra, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ışıldayan hücre canlılık tsay tarafından oluşturulan bir Parlak sinyal ölçülür. Parlak sinyal hücresel ATP konsantrasyonu ile orantılıdır ve kendisi her kuyuda bulunan canlı hücre sayısıyla doğru orantılıdır.

1. Kaplama
   1. 384 kuyulu plaka nın kuyubaşına 30 μL poli-L-lizin (PLL) ekleyin.
   2. RT'de 1 saat kuluçka.
   3. PBS ile 2x yıkayın.
   4. RT (yaklaşık 30 dakika) kuruolsun.
   5. 384 kuyulu plakanın kuyubaşına 30 μL laminin (50 μg/mL) ekleyin.
   6. 37 °C'de 2 saat kuluçka.
   7. PBS ile 2x yıkayın.
      NOT: Kaplanmış 384 kuyulu plakalar 1 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir.
2. Hücreleri kaplama
   1. Farklılaşma ortamının 25 μL'sinde 384 kuyulu plakanın kuyubaşına 20.000 tek hücreli nöroküre sayısı ve plakası.
   2. 37 °C'de 5 gün kuluçkaya yatırın.
   3. 5 gün sonra, hücreleri 5 μL hacimde istenilen son konsantrasyonu 6 kat test bileşikleri ile 24 saat tedavi edin (kuyu başına 30°L'lik son hacmi yapmak için).
3. Hücre canlılığı tsası
   1. 384 kuyulu plakanın kuyubaşına 30 μL'lik parlak hücre canlılığı isame reaktifi ekleyin.
      NOT: Her kuyuda bulunan hacime eşit bir hacim liminesans hücre canlılık isabilme reaktifi ekleyin. Parlak hücre canlılığı isaveti reaktifini eritin ve kullanmadan önce RT'ye dengeleyin.
   2. 2 dakika boyunca bir tabak shaker çalkalayın (karıştırmak ve hücre lisis indüklemek için).
   3. Karışımı 30 s için 300-400 x g'de santrifüj ile aşağı doğru çevirin.
   4. 384 kuyulu plakayı ışıktan korunan bir yerde RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın (Parlak sinyali stabilize etmek için).
   5. Bir mikroplaka okuyucu ile parlaklık kaydedin.
      NOT: Velcade (10 μM'lik son konsantrasyonda) pozitif ve HBSS içeren DMSO (nihai konsantrasyon %0,1 veya %0,2) dahil olmak üzere canlılık tahlilleri için uygun kontrolleri kullanın negatif kontrol olarak.

Sonuçlar

El yazmasısunulan protokol başarıyla iki yeni yayınlanan kağıtları^22,23kullanılmıştır . Şekil 3, HDAC inhibitörlerinin epigenetik bileşikler olarak nötrit lerin uzantısı üzerindeki etkisini incelerken hNPC'lerden türetilmiş nöronların kullanımını göstermektedir.

Ayrıca, Şekil 4'te test edilen bileşiklerin nörotoksisitesi (HDAC inhibitörleri) ayn?...

Tartışmalar

Bu protokol, test bileşikleri ile tedavi üzerine neurite uzunluğu için test açıklayan birkaç yayınlanan makalelerden biridir. Ayrıca, bir neurite outgrowth tsay ve nörotoksisite değerlendirmesi için hNPCs nasıl kullanılacağını açıklar. HNCs kaynaklı nöronlar bu neurite outgrowth ve nörotoksisite değerlendirmesi kullanarak, epigenetik küçük molekül bileşikleri bir kategorinörojenik potansiyeli, HDAC inhibitörleri, neurite outgrowth indükleyen²²gösterilmiştir . Ayrı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well Glass Chamber Slides	Sigma	PEZGS0816
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001
Alexa Fluor 594	Invitrogen	R37117
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062
Anti-β-Tubulin III	Thermo	MA1-118X
B27	Thermo	17504001
B27 - minus vitamin A	Thermo	12587010
BDNF	PeproTech	450-02
BSA	Sigma	A8531
CellTiter-Glo	Promega	G7572
CoolCell	Corning	432000	Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930	Cryopreservation medium containing 10% DMSO
DAPI	Thermo	D1306
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	Sigma	34869-100ML
EGF	Gibco	PHG0311
FGF	Gibco	PHG6015
Formaldehyde	Thermo	FB002
GDNF	PeproTech	450-10
Glutamax	Gibco	35050061	L-alanyl-L-glutamine supplement
Goat Serum	Thermo	50062Z
Heparin	Calbiochem	375095
Laminin	Sigma	L2020-1MG
L-Ascorbic Acid	Sigma	A92902-25G
L-lysine	Sigma	L5501
MEM non-essential amino acids	Gibco	11140050
mFreSR	StemCell Technologies	5854	Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
N2	Gibco	17502048
NaCl	Sigma	71376
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates	Thermo	164610
PBS	Thermo	10010-049
Poly-L-lysine	Sigma	P5899-5MG
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo	P10144
Retinoic Acid	Sigma	R2625
Sodium Azide	Sigma	S2002
StemPro Accutase	Gibco	A1110501	Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes
Synaptophysin	Thermo	MA5-14532
Tris Base	Sigma	10708976001
Triton X-100	Sigma	X100-100ML