神经石生长分析与神经毒性评估与人类神经原生细胞衍生神经元

摘要

提出的方案描述了一种小分子化合物的神经质生长测定和神经毒性评估方法。

摘要

神经土虫生长测定和神经毒性评估是可以使用本文所述方法进行的两项主要研究。该协议提供可靠的神经元形态分析，以及神经石长度和突触蛋白定位和在小分子化合物处理时对富足的修改进行定量测量。除了在神经性生长研究中应用介绍的方法外，还可以进行神经毒性评估，根据其潜在的发育神经毒性效应评估、区分和排名商业化合物。

尽管细胞系现在广泛用于神经科学的复合筛选分析，但它们在基因和表型上往往与组织起源不同。另一方面，原细胞维持体内观察到的重要标记和功能。因此，由于这些细胞的转化潜力和生理相关性，可以提供神经素生长测定和神经毒性评估，可以大大受益于使用人类神经祖细胞（hNPCs）作为主要的人类细胞模型。

本文所介绍的方法可以利用人类神经祖细胞衍生神经元（一种密切代表人类生物学的细胞模型）来筛选化合物诱导神经性生长和神经毒性的能力。

引言

神经素生长是一个基础性神经网络和神经再生^{1，2,的过程}。受伤后，神经衰弱在神经系统的再生中起着关键作用。神经外生长也是诱导神经元再生活动细胞外信号的一个重要元素，可增强神经退行性疾病和神经元损伤的结果^{3，4，5，6。4,5,63}

通过保持其分化潜力，在产生各种神经血统，人类神经祖细胞（hNPCs）可以提供一个模型系统的研究中枢神经系统（CNS）的功能和发展^{7,7，8，9。,9}hNPCs作为初级人体细胞模型的高转化潜力和生理相关性，在神经素生长相关的药物发现筛查中提供了相当大的优势。然而，对高通量测定的原细胞模型的维护和缩放可能非常耗时和劳动密集型 10、11、12、13。^10,11,12,13

除了在神经素生长研究中应用介绍的方法外，神经毒性评估是使用 hNPC 衍生神经元的另一种应用。有成千上万的商业化合物，要么没有检查，要么神经毒性潜力不灵。因此，更可靠和有效的筛选实验，以评估，区分和排名化合物的基础上，其潜力，以引起发育神经毒性是高需求^14。神经紊乱的流行率和发病率的增加，以及环境中大量未经测试的化合物，需要开发更可信和更有效的实验，以识别可能构成神经毒性¹⁵的危险环境化合物。

本文所介绍的方法可以利用人类神经祖细胞衍生神经元（一种密切代表人类生物学的细胞模型）来筛选化合物诱导神经素生长和神经毒性的能力。

研究方案

伦理声明:通过国家卫生研究院（NIH）支持的组织分配计划，从西雅图华盛顿大学出生缺陷研究实验室接收胎儿标本。出生缺陷研究实验室获得父母的适当书面知情同意，组织采购由华盛顿大学机构审查委员会监测。所有工作均经迈阿密大学人类学科研究办公室批准^。

1. 人类神经祖细胞的分离与培养

1. 将脑组织放在 100 mm 培养皿中，然后用钳子小心地取出脑管。
2. 将脑组织转移到50 mL锥形管中，用20 mL的PBS轻轻反转管洗两次。
3. 通过将组织淹没在细胞分离溶液（参见材料表）和DNase I（10 U/mL）中的脑组织Table of Materials，在37°C下孵育10分钟。
4. 将5 mL的神经元细胞培养培养本（见材料表）添加到含有管的脑组织中，通过1000μL移液尖端三分20至30次，机械地分离神经球，形成单细胞悬浮液。
5. 通过 70 μm 细胞滤株过滤细胞悬浮液，以去除细胞簇。
6. 在通风的T-25烧瓶中播种单细胞悬浮液，其中5-10 mL的神经元细胞培养培养培养，并辅以表1中详细说明的成分。
   1. 通过 0.2 μm 过滤器进行过滤，对肝素溶液进行消毒。不含维生素A的B-27补充剂是培养神经祖细胞和干细胞的无血清补充剂，不诱导分化。
      注:人类神经祖细胞（hNPCs）是从流产胎儿收集的人类胎儿大脑中分离的。在培养7~10天后，神经干细胞（NSC）形成自由浮动的神经球菌落，而其他细胞类型作为单细胞或附着在烧瓶底部。分离的hNPCs可以培养为神经球在悬浮几个月^{8，16，17。,178,}

量	组件
100 μL	EGF （20 纳克/千升）
100 μL	FGF （10 ng/mL）
2 mL	B-27，减去维生素A（50倍）
1 mL	L-阿兰尼-L-谷氨酰胺（100X）（见材料表）
4 μL	肝素（2微克/微瓦）
96.8 mL	神经元细胞培养培养（见材料表）

表1.制作 100 mL 培养文化介质所需的组件

2. 传递 hNPC

1. 收集包含浮动球体、大和小神经球的介质，并将它们转移到 50 mL 锥形管中。
   注:由于未知原因，分裂神经球的时间从7天到30天变化。然而，一般来说，神经球需要通过时，他们达到直径大于700-900μm。这是当神经球的中心开始变暗，这被认为是一个高死亡率的细胞死亡率^18的标志。
2. 以300-400 x g的离心将神经球旋转3分钟。
3. 小心吸制上经剂，然后将球体淹没在500μL的解冻细胞分离试剂中（参见材料表）。
   1. 每1.5 mL微管加入500μL，并在-20°C下储存，使细胞分离试剂的等分。为避免失去酶活性，在37°C水/珠浴中，在RT或温暖5分钟时，解冻细胞分离试剂。
4. 根据球体的密度和大小，在37°C下孵育水下球体5-15分钟。
5. 将 5-10 mL 预热培养培养片添加到含有 50 mL 锥形管的神经球中，并在 300-400 x g下离心 5 分钟沉淀神经球。
6. 在 2 mL 培养介质中，使用 1000 μL 移液器上下吸出上流液和轻轻移液器，直到所有神经球都悬浮在单个细胞悬浮液中。
   注:分离将变得肉眼可见。在分离之前，神经球是球体的形式。在分离试剂中并上下移液后，它们将成为单细胞。
   1. 计算细胞并板单细胞，每T-25烧瓶在10mL培养培养的200万至300万个细胞。
7. 每3天用一半培养细胞进行饲料。用更换一半的培养媒体。
   1. 通过倾斜烧瓶来沉淀神经球，使之位于其底部角。将烧瓶保持约1-2分钟，直到神经球沉淀。然后通过将血清移液器插入稳定神经球上方的介质中，轻轻地吸气一半的介质。分离的细胞可以在培养¹⁹中 2 到 3 天后聚集形成球体。

3. 冻结国家警察

1. 通过将 DMSO 添加到培养基中，将 10% （v/v） 的最终浓度或将市售低温保存介质用于敏感细胞类型（参见材料表）来准备细胞冷冻介质。
2. 通过将介质转移到 50 mL 锥形管中，让球体通过重力沉淀来整理大球体。然后，使用 200 或 1000 μL 移液尖端将大神经球拆下并转移到新的 50 mL 锥形管中，用于传通。
   注:直径大于 900 μm 的神经球被视为大，直径小于 500 μm 的神经球被视为小。
3. 以300-400 x g的离心将剩余的神经球旋转下来3分钟。小心地去除上经剂。
4. 在1 mL的低温保存试剂中重新分配多达100个球体，并转移到冷冻管中。
5. 在-80°C下隔夜存放在细胞冷冻容器中（见材料表），第二天将其移至液氮中进行长期储存。
   注:最好冷冻中小型神经球（直径小于900μm），避免冻结大尺寸神经球（直径大于900μm）或单个细胞。为了减少样品解冻过程中细胞损伤，通过将解冻的神经球播种到一个小的T25烧瓶中，保持细胞的致密性。

4. 国家警察的差别化和待遇

注:为了诱导分化，神经球被分解成单细胞，计数，然后在涂层板上播种5天。然后，在免疫污染和荧光定量之前，用测试化合物处理分化细胞24小时。

1. 涂层
   1. 每 4 井玻璃室滑轨（8 井室滑轨每井 140 μL）添加 200 μL 聚 L-Lysine （PLL）。
   2. 在室温 （RT） 下孵育 1 小时。
   3. 用 PBS 清洗 3x。
   4. 让它在RT干燥（约30分钟）。
   5. 每 4 井玻璃室滑轨（8 井室滑轨每井 120 μL）添加 150 μL 层薄荷（50 μg/mL）。
   6. 在37°C下孵育2小时。
   7. 用 PBS 清洗 3x。
      注:涂层室滑轨可储存在4°C1个月。
2. 电镀细胞
   1. 计数和板80，000个单细胞神经球（神经球在单个细胞悬浮）每井4井室幻灯片（70，000细胞每井8井室幻灯片）。
   2. 每 4 井腔室滑轨每井添加 500 μL 的分化介质（8 井室滑轨每井 250 μL 介质）。
      1. 首先使分化介质，请将表2中的以下组件添加到无菌的一次性容器中，以制作神经诱导介质 （NIM）。
      2. 在上一步中制作的 NIM的 48.5 mL 中加入以下成分，以制作差异化介质。
   3. 在37°C下孵育5天。
   4. 5天后，用与所需浓度的测试化合物混合的新鲜介质（包括适当的对控制）更换每井中一半的介质，对细胞进行24小时治疗。

量	组件
49 mL	DMEM/F-12
0.5 mL	N2 补充 （100 倍）
0.5 mL	MEM 非必需氨基酸 （100 倍）
2 μL	肝素（2微克/mL）（库存孔是50毫克/千升）

表2. 制造50 mL 的 NIM 所需的组件

量	组件
1 mL	B-27 （50X）
500 μL	抗生素-抗霉菌 （100X）
5 μL	视网膜酸 （0.1 μM）
50 μL	GDNF （10 μg/mL）
50 μL	BDNF （10 μg/mL）
5 μL	抗坏血酸 （0.2 μg/mL） （库存康克是 2 mg/mL） 注意: 建议做新鲜.
48.5 mL	尼姆

表3.制造 50 mL 分分介质所需的组件

5. 免疫细胞化学

注:细胞用4%甲醛固定。然后进行渗透和阻断，以提高渗透率，防止抗体的非特异性结合。然后用原抗体在一夜之间孵育细胞。随后，细胞被荧光标记的二级抗体孵育。最后，使用DAPI染色核后，安装室滑梯。

1. 固定
   1. 轻轻吸气每个井中的介质。
   2. 每 4 井腔室滑轨每井添加 500 μL 4% 甲醛（8 井室滑轨每井 250 μL）。
   3. 在 Rt 孵育 15 分钟。
   4. 用 500 μL 的 PBS 轻轻清洗 2x。
      注:固定后，通过在每个井中留下 1 mL 的 PBS，培养幻灯片可以在 4 °C 中存储长达 3 个月。
2. 细胞渗透和阻塞
   1. 将表4中的以下成分添加到无菌的一次性容器中，以产生抗体（Ab）缓冲液。
   2. 将表5 中的以下成分与上一步中制作的 Ab 缓冲液混合，以使细胞渗透和阻塞溶液。
   3. 每井4井室滑轨添加500μL，在RT下孵育1小时。
      注:Ab 缓冲液可存储在 4 °C。

量	组件
1.75 克	纳克 （150 mM）
1.2 克	三边距（50 mM）
2 克	BSA 1%
3.6 克	L-lysine （100 mM）
8 克	阿齐德钠 （4%）
200 mL	蒸馏水。注:最初将所需成分溶解在150 mL水中，然后调整至200 mL。

表4.制造200 mL抗体缓冲液所需的组件

量	组件
600 μL	20% 山羊血清
6 μL	0.2% 特里顿-X100
2394 μL	抗体缓冲液。注:最初将所需分量溶解在 2 mL 的 Ab 缓冲液中，然后调整到 pH 7.4。然后添加更多的 Ab 缓冲液以调整到 3 mL 的最终体积并过滤灭菌。

表 5.制造 3 mL 细胞渗透和阻塞溶液所需的组件

3. 染色
   1. 用 500 μL PBS 清洗 2x。
   2. 加入稀释原抗体，抗β-多布林III（1:200），在4°C（4井室滑轨每井200μL）孵育过夜。稀释PBS中的原抗体。
   3. 用 PBS 清洗 2x。
   4. 在PBS中加入稀释的荧光标记二级抗体Alexa Fluor 488（1:500），在RT中孵育2小时，在不受光线保护的地方（4井室滑梯每井250μL）
   5. 用 PBS 清洗 2x。
   6. 在 PBS 中加入稀释的 DAPI（300 nM 浓度），并在 RT 中孵育 5 分钟，在防光的地方（4 井室滑轨每井 300 μL）。
   7. 用 PBS 清洗 3x。
   8. 使用以下说明安装腔室滑梯。
      1. 通过断开分离卡舌并拆下垫片和底座，将腔室幻灯片拆开。
      2. 在 4 孔室滑轨的井中添加一滴安装溶液（参见材料表）。然后使用封面幻灯片覆盖整个幻灯片。
      3. 使用钳子，以一定角度将盖的一侧滑到滑梯上，同时与液体滴的外缘接触。
      4. 将盖玻片放在安装溶液上时，请小心地将盖玻片放在安装溶液上。避免产生气泡。拿移液器尖端，然后按压在盖滑上。气泡将移动到侧面。
         注:气泡的形成有时是不可避免的。如果它发生，图像围绕他们只要有几个。
      5. 按照制造商的指示进行固化时间。避免使用非曲线安装解决方案，因为成像过程中处理困难。否则，在边缘上需要使用适当的盖玻片密封剂，以防止盖玻片在成像过程中滑动。
      6. 要密封盖玻片，请使用指甲油，并在盖玻片边缘做一条小线。让指甲油干燥约2分钟。

6. 图像采集、神经性生长和荧光强度定量

注:染色后，使用目标为 20 倍且图像大小为 1024 x 1024 像素的共合显微镜获取处理过的细胞的图像。根据每个条件每个生物复制的两个字段至少拍摄图像。然后使用斐济图像分析软件（ImageJ 1.51u）对神经石长度进行量化。简言之，测量每个神经元最长的神经素的长度，并在平均每次治疗值后，使用学生的 t 测试为独立组比较实验组和控制组之间的手段。

注: 有几个商业 （Imaris， Volocity， Amira） 和开源 （ImajeJ， CellProfiler， Vaa3D， BioImageXD， Icy， KNIME） 图像处理程序可用。在这些程序中，ImageJ已成为生物图像分析^{的首选工具20，21。,21}https://imagej.net/Introduction 的 ImageJ 门户是一个有用的信息来源，提供 ImageJ 的基本和内置功能，包括图像处理、结肠化、去卷积、注册、分段、跟踪和可视化。

1. 使用斐济图像分析软件测量神经元生长
   1. 如图1 所示，通过将其拖放到斐济软件或选择"文件|"打开。
   2. 选择分析 |工具 |ROI管理器，然后右键单击工具栏"^直"中的第5个图标，然后切换到手绘线。可选地，双击同一图标将线宽更改为 10，然后跟踪最长的神经石，从细胞体附近开始，一直延伸到神经石的尖端。
   3. 按Ctrl + T和 F将测量添加到 ROI 管理器并突出显示测量神经元。选择 ROI 中的所有数字，单击"测量"，选择所有计算长度，然后复制/粘贴到电子表格中。
2. 使用斐济图像分析软件测量标记细胞的荧光强度
   1. 如图2所示，打开图像后，单击工具栏"^手绘选择"中的第4个图标。绘制单元格的形状。
   2. 选择分析 |设置测量并选择以下值:面积、集成密度、均值灰色值 |分析 |测量（打开一个显示一叠值的弹出框）。
   3. 选择单元格旁边的区域作为背景（大小并不重要），然后选择"分析| "测量。选择所有测量数据并复制/粘贴到电子表格中。
      注:集成密度（IntDen）是用于确定荧光强度的项目。本研究中测量目标分子的荧光强度，以最初分析其在细胞中的分布，然后量化各种处理下目标分子的丰度。因此，治疗的有效性将被衡量，并与控制进行比较。

7. 神经毒性评估

注:使用发光细胞活性测定（见材料表），在384孔板中评估试验化合物Table of Materials的细胞毒性（见材料表）。hNPC是按照同样的方法编写的，但"国家警察的差别化和待遇"一节中描述的轻微修改除外。随后，利用微孔板读取器测量发光细胞可行性测定产生的发光信号。发光信号与细胞 ATP 浓度成正比，而细胞 ATP 浓度本身与每个井中存在的可行细胞数量成正比。

1. 涂层
   1. 每384井板的井中加入30μL的聚L-Lysine（PLL）。
   2. 在 Rt 孵育 1 小时。
   3. 用 PBS 清洗 2x。
   4. 让它在RT干燥（约30分钟）。
   5. 每384井板每井加入30μL层压素（50μg/mL）。
   6. 在37°C下孵育2小时。
   7. 用 PBS 清洗 2x。
      注:涂层的384孔板可以在4°C下储存1个月。
2. 电镀细胞
   1. 在25μL的分化介质中，每井384井板的20，000个单细胞神经球计数和板。
   2. 在37°C下孵育5天。
   3. 5天后，通过测试化合物在5μL体积中制备的6倍的最终所需浓度（使最终体积达到每井30μL）的试验化合物，对细胞进行24小时处理。
3. 细胞生存能力测定
   1. 在384井板的井中加入30μL的发光细胞可行性测定试剂。
      注:添加一卷发光细胞可行性测定试剂，其体积等于每个井中存在的体积。在使用前解冻发光细胞可行性测定试剂，并平衡至RT。
   2. 在板摇床上摇动2分钟（混合并诱导细胞解。
   3. 在300-400 x g下离心旋转混合物30 s。
   4. 在RT处孵育384井板10分钟，在不受光线保护的地方（稳定发光信号）。
   5. 使用微孔板读卡器记录发光。
      注:对可行性测定使用适当控制措施，包括 Velcade（最终浓度为 10 μM）为阳性，HBSS 含有 DMSO（最终浓度为 0.1% 或 0.2%）作为负控制。

结果

手稿中提出的协议已成功地用于最近发表的两篇论文^{22、23。,23}图3演示了利用NPPC衍生神经元来研究HDAC抑制剂作为表观遗传化合物对中性粒细胞延伸的影响，作为小分子化合物的神经质生成和随后的神经原能的标记。

此外，在图4中，还通过同时区分384孔板中的hNPC来评估测试化合物的神经...

讨论

该协议是少数发表论文之一，描述使用试验化合物治疗时神经石长度的测试。此外，我们描述了如何使用hNPCs进行神经性生长测定和神经毒性评估。通过利用这种神经性生长测定和神经毒性评估对NPPC衍生神经元，一类表观遗传小分子化合物，HDAC抑制剂的神经原能，在诱导神经素叶生长^{中表现出22。}此外，在Sartor等人提出的另一篇论文中，该协议用于在用几种表观遗传修饰剂化合?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well Glass Chamber Slides	Sigma	PEZGS0816
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001
Alexa Fluor 594	Invitrogen	R37117
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062
Anti-β-Tubulin III	Thermo	MA1-118X
B27	Thermo	17504001
B27 - minus vitamin A	Thermo	12587010
BDNF	PeproTech	450-02
BSA	Sigma	A8531
CellTiter-Glo	Promega	G7572
CoolCell	Corning	432000	Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930	Cryopreservation medium containing 10% DMSO
DAPI	Thermo	D1306
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	Sigma	34869-100ML
EGF	Gibco	PHG0311
FGF	Gibco	PHG6015
Formaldehyde	Thermo	FB002
GDNF	PeproTech	450-10
Glutamax	Gibco	35050061	L-alanyl-L-glutamine supplement
Goat Serum	Thermo	50062Z
Heparin	Calbiochem	375095
Laminin	Sigma	L2020-1MG
L-Ascorbic Acid	Sigma	A92902-25G
L-lysine	Sigma	L5501
MEM non-essential amino acids	Gibco	11140050
mFreSR	StemCell Technologies	5854	Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
N2	Gibco	17502048
NaCl	Sigma	71376
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates	Thermo	164610
PBS	Thermo	10010-049
Poly-L-lysine	Sigma	P5899-5MG
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo	P10144
Retinoic Acid	Sigma	R2625
Sodium Azide	Sigma	S2002
StemPro Accutase	Gibco	A1110501	Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes
Synaptophysin	Thermo	MA5-14532
Tris Base	Sigma	10708976001
Triton X-100	Sigma	X100-100ML