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Method Article
제시된 프로토콜은 작은 분자 화합물의 neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가를 위한 방법을 설명합니다.
Neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가는 본원에 제시된 방법을 사용하여 수행될 수 있는 2개의 주요 연구이다. 이 프로토콜은 뉴라이트 길이 및 시냅스 단백질 국소화에 대한 수정의 정량적 측정과 함께 뉴런 형태학의 신뢰할 수있는 분석을 제공하고 작은 분자 화합물로 치료시 풍부합니다. 중성염 외성장 연구에서 제시된 방법의 적용 외에도, 신경 독성 평가는 잠재적인 발달 신경 독성 효과에 기초하여 상업적 화학 화합물을 평가, 구별 및 순위를 매기기 위해 수행될 수 있다.
세포주신경과학의 화합물 스크리닝 에세이에서 요즘 널리 사용되고 있지만, 종종 조직 기원과 는 유전적으로 다르습니다. 반면에 1차 세포는 생체 내에서 관찰되는 중요한 마커와 기능을 유지한다. 따라서, 이러한 세포가 중성자 성장 분석및 신경 독성 평가를 제공할 수 있는 번역 잠재력 및 생리적 관련성으로 인해 인간 신경 전구 세포(hNpC)를 1차 인간 세포 모델로 사용하여 상당히 유익할 수 있다.
본 명세서에서 제시된 방법은 인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 이용하여 중성기 의 성장과 신경 독성을 유도하는 화합물의 능력을 선별하는 데 활용될 수 있다, 인간 생물학을 밀접하게 대표하는 세포 모델."
중성성장은 뉴런 네트워크 형성과 신경재생1,,2의형성에 근본적인 과정이다. 부상 후, neurite 아웃 성장 신경계의 재생에 중요 한 역할을 한다. Neurite 아웃성장은 또한 신경 퇴행성 질환 및 신경 손상에 대한 결과를 향상시키기 위해 신경 재생 활동을 유도하는 세포 외 신호의 중요한 요소입니다3,,4,,5,,6.
다양한 신경 계보를 생성하는 데 있어 분화 잠재력을 유지함으로써, 인간 신경 전구 세포(hNpC)는 중추 신경계(CNS) 기능 및 개발7,,8,,9의연구를 위한 모델 시스템을 제공할 수 있다. 1 차인간 세포 모델로 hNPC의 높은 번역 잠재력 및 생리적 관련성은 neurite 아웃성장 관련 약물 발견 선별에서 상당한 이점을 제공합니다. 그러나, 고처리량 에 대한 1차 세포 모델의 유지 보수 및 스케일링은 시간이 많이 소요되고 노동 집약적인10,,11,,12,,13일수 있다.
중성기 외성장 연구에서 제시된 방법의 적용 외에도, 신경 독성 평가는 hNPC 유래 뉴런을 이용한 또 다른 응용이다. 검사되지 않거나 제대로 이해되지 않는 신경 독성 잠재력을 가진 수천 개의 상업적인 화학 화합물이 있습니다. 따라서, 보다 안정적이고 효과적인 스크리닝 실험은 개발 신경 독성을 유도하는 그들의 잠재력에 기초하여 화합물을 평가, 구별 및 순위를 매기는 데 큰 수요가14이다. 환경에서 테스트되지 않은 화합물의 풍부와 함께 신경 장애의 보급 및 발생률이 증가함에 따라 신경 독성을 유발할 수 있는 위험한 환경 화합물을 식별하기 위해 보다 신뢰할 수 있고 효율적인 실험이필요합니다(15)
본 명세서에서 제시된 방법은 인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 이용하여 중성기 의 성장과 신경 독성을 유도하는 화합물의 능력을 선별하는 데 활용될 수 있으며, 이는 인간 생물학을 밀접하게 대표하는 세포 모델이다.
윤리 성명서: 태아 표본은 국립 보건원(NIH)이 지원하는 조직 분배 프로그램을 통해 시애틀에 있는 워싱턴 대학의 출생 결함 연구소로부터 수신되었습니다. 출생 결함 연구소는 부모로부터 적절한 서면 통보 동의를 얻고 조직의 조달은 워싱턴 대학의 기관 검토 위원회에 의해 모니터링되었다. 모든 작업은 마이애미 대학의 인간 과목 연구 사무소의 승인으로 수행되었다8.
1. 인간 신경 전구 세포의 격리 및 배양 (hNPC)
금액 | 구성 요소 |
100 μL | EGF (20 ng/mL) |
100 μL | FGF (10 ng/mL) |
2 mL | B-27, 마이너스 비타민 A (50X) |
1 mL | L-alanyl-L-글루타민 (100X) (재료 표 참조) |
4 μL | 헤파린 (2 μg/mL) |
96.8 mL | 신경 세포 배양 배지 (재료의 표 참조) |
표 1. 문화 매체 100mL 제작에 필요한 구성 요소
2. hNPC를 전달
3. hNPC 동결
4. hNPC의 차별화 및 치료
참고: 분화를 유도하기 위해 신경구는 단일 세포로 분해되어 계산된 다음 5일 동안 코팅된 플레이트에 시드됩니다. 그런 다음 분화 된 세포는 면역 염색 및 형광 정량화 전에 테스트 화합물로 24 시간 동안 치료됩니다.
금액 | 구성 요소 |
49 mL | DMEM/F-12 |
0.5mL | N2 보충 (100 X) |
0.5mL | MEM 비필수 아미노산 (100X) |
2 μL | 헤파린 (2 μg/mL) (스톡 콘은 50 mg/mL) |
표 2. NIM 50mL 제작에 필요한 구성 요소
금액 | 구성 요소 |
1 mL | B-27 (50X) |
500 μL | 항생제 항진제 (100X) |
5 μL | 망리노산 (0.1 μM) |
50 μL | GDNF (10 μg/mL) |
50 μL | BDNF (10 μg/mL) |
5 μL | 아스코르브산(0.2 μg/mL) (스톡 콘은 2 mg/mL) 참고: 신선하게 만들 수 있도록 권장합니다. |
48.5mL | 님 |
표 3. 차별화 미디어 50mL 제작에 필요한 부품
5. 면역 세포 화학 (ICC)
참고 : 세포는 4 % 포름알데히드로 고정됩니다. 침투및 차단은 침투를 개선하고 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 수행됩니다. 세포는 그 때 일차 항체로 하룻밤 배양됩니다. 그 후, 세포는 형광으로 표지된 이차 항체로 배양됩니다. 마지막으로, DAPI를 사용하여 핵을 더럽힌 후 챔버 슬라이드가 장착됩니다.
금액 | 구성 요소 |
1.75 g | 나Cl (150mM) |
1.2 g | 트리스베이스 (50mM) |
2 g | BSA 1% |
3.6 g | L-리신 (100 mM) |
8 g | 아지데 나트륨 (4%) |
200 mL | 증류수. 참고: 처음에는 필요한 부품을 150mL의 물에 녹인 다음 200mL로 조정합니다. |
표 4. 항체 버퍼 200mL 만들기에 필요한 부품
금액 | 구성 요소 |
600 μL | 20% 염소 세럼 |
6 μL | 0.2% 트리톤 X100 |
2394 μL | 항체 버퍼. 참고: 처음에는 필요한 구성 요소를 Ab 버퍼 2mL로 용인한 다음 pH 7.4로 조정합니다. 그런 다음 Ab 버퍼를 더 추가하여 3mL의 최종 부피에 적응하고 필터 살균을 필터링합니다. |
표 5. 세포 투과 및 차단 용액 3mL 제작에 필요한 부품
6. 이미지 수집, 중성염 아웃성장과 형광 강도 정량화
참고: 염색 후 20배 목표와 1024 x 1024 픽셀의 이미지 크기로 공초점 현미경을 사용하여 처리된 세포의 이미지를 습득합니다. 조건당 생물학적 복제당 적어도 두 가지 필드에서 이미지를 가져 가라. 그런 다음 피지 이미지 분석 소프트웨어(ImageJ 1.51u)를 사용하여 중성기 길이의 정량화를 한다. 간단히, 각 뉴런에 대한 가장 긴 중성염의 길이를 측정하고 치료 당 값을 평균 한 후, 실험 그룹과 대조군 사이의 수단을 비교하기 위해 독립적 인 그룹에 대한 학생의 t 테스트를 사용합니다.
참고: 여러 상용(이마리스, 볼로시티, 아미라) 및 오픈 소스(이마제J, 셀프로파일러, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) 이미지 처리 프로그램을 사용할 수 있습니다. 이러한 프로그램 중 ImageJ는 생물학적 이미지 분석20,,21을선택하는 도구가 되었습니다. https://imagej.net/Introduction ImageJ 포털은 이미지 처리, 지역화, deconvolution, 등록, 세분화, 추적 및 시각화를 포함한 ImageJ의 기본 및 기본 기능에 대한 철저한 설명을 제공하는 유용한 정보 소스입니다.
7. 신경 독성 평가
참고: 시험 화합물의 세포 독성은 발광 세포 생존가능성 분석(재료 표참조)을 사용하여 384웰 플레이트(재료 표참조)에서 평가됩니다. hNPC는 "hNPc의 분화 및 처리" 섹션에 기재된 약간의 수정을 제외하고 동일한 방법에 따라 준비됩니다. 이어서, 발광 세포 생존성 분석에 의해 생성된 발광 신호는 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 측정된다. 발광 신호는 세포 ATP 농도에 비례하여 각 우물에 존재하는 실행 가능한 세포의 수에 직접적으로 비례합니다.
원고에 제시 된 프로토콜은 성공적으로 두 개의 최근에 출판 된논문22에서사용되었습니다 22,,23. 도 3은 중성염 아웃성장과 소분자 화합물의 후속 신경유발능력에 대한 마커로서 중성염의 연장에 대한 후성유전학적 화합물로서 HDAC 억제제의 효과를 검사하는 hNpC 유래 뉴런의 사용을 입증한다.
더욱이,
이 프로토콜은 시험 화합물을 가진 처리시 neurite 길이에 대한 시험을 설명하는 몇몇 간행된 논문 의 한개입니다. 또한, 우리는 중성자 아웃 성장 분석 및 신경 독성 평가에 hNPC를 사용하는 방법을 설명합니다. hNPC 유래 뉴런에 대한 이러한 중성기 내성장 분석 및 신경 독성 평가를 활용하여 후생유전학 소분자 화합물, HDAC 억제제의 범주의 신경성 잠재력을 유동적으로 유도하여22개의
모든 저자는 잠재적인 이해 상충이 없음을 나타냅니다.
이 연구는 NIMAD 연구 보조금에 의해 투자되었다 (940714) MAF에 수여.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
B27 | Thermo | 17504001 | |
B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
BDNF | PeproTech | 450-02 | |
BSA | Sigma | A8531 | |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
DAPI | Thermo | D1306 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
EGF | Gibco | PHG0311 | |
FGF | Gibco | PHG6015 | |
Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
GDNF | PeproTech | 450-10 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
Heparin | Calbiochem | 375095 | |
Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
L-lysine | Sigma | L5501 | |
MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
N2 | Gibco | 17502048 | |
NaCl | Sigma | 71376 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
PBS | Thermo | 10010-049 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
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