Un ensayo de crecimiento de neurita y evaluación de neurotoxicidad con neuronas derivadas de células de progenitor neuronales humanos

Resumen

El protocolo presentado describe un método para un ensayo de crecimiento de neurito y la evaluación de la neurotoxicidad de compuestos de moléculas pequeñas.

Resumen

El ensayo de crecimiento de la neurita y la evaluación de la neurotoxicidad son dos estudios principales que se pueden realizar utilizando el método presentado en el presente documento. Este protocolo proporciona un análisis fiable de la morfología neuronal junto con mediciones cuantitativas de modificaciones en la longitud de la neurita y la localización de proteínas sinápticas y abundancia en el tratamiento con compuestos de moléculas pequeñas. Además de la aplicación del método presentado en estudios de crecimiento de neuritas, se puede realizar una evaluación de la neurotoxicidad para evaluar, distinguir y clasificar los compuestos químicos comerciales en función de su posible efecto de neurotoxicidad del desarrollo.

A pesar de que las líneas celulares se utilizan hoy en día en ensayos de cribado compuestos en neurociencia, a menudo difieren genética y fenotípicamente de su origen tisular. Las células primarias, por otro lado, mantienen marcadores y funciones importantes observados in vivo. Por lo tanto, debido al potencial de traducción y la relevancia fisiológica que estas células podrían ofrecer un ensayo de crecimiento de neurita y la evaluación de la neurotoxicidad puede beneficiarse considerablemente del uso de células progenitoras neuronales humanas (hNPC) como el modelo de células humanas primarias.

El método presentado aquí se puede utilizar para detectar la capacidad de los compuestos para inducir el crecimiento de la neurita y la neurotoxicidad aprovechando las neuronas derivadas de células progenitoras neuronales humanas, un modelo celular que representa estrechamente la biología humana."

Introducción

El crecimiento de la neurita es un proceso fundamental para la formación de la red neuronal y la regeneración nerviosa^1,2. Después de una lesión, el crecimiento de la neurita juega un papel clave en la regeneración del sistema nervioso. El crecimiento de la neurita es también un elemento importante de la señalización extracelular en la inducción de actividades regenerativas neuronales para mejorar los resultados de los trastornos neurodegenerativos y lesiones neuronales^3,,4,5,6.

Al mantener su potencial de diferenciación en la producción de varios linajes neuronales, las células progenitoras neuronales humanas (hNPC) podrían proporcionar un sistema modelo para los estudios de la función del sistema nervioso central (SNC) y el desarrollo^7,,8,,9. El alto potencial traslacional y la relevancia fisiológica de los hNPC como modelo de células humanas primarias ofrecen una ventaja considerable en las pruebas de descubrimiento de fármacos relacionadas con el crecimiento de neuritas. Sin embargo, el mantenimiento y escalado de los modelos de células primarias para ensayos de alto rendimiento podría ser lento y laborioso^10,,11,12,13.

Además de la aplicación del método presentado en estudios de crecimiento de neuritas, la evaluación de la neurotoxicidad es otra aplicación utilizando las neuronas derivadas de hNPC. Hay miles de compuestos químicos comerciales que no se examinan o con potencial de neurotoxicidad mal entendido. Por lo tanto, experimentos de cribado más fiables y eficaces para evaluar, distinguir y clasificar compuestos en función de su potencial para provocar neurotoxicidad del desarrollo está en alta demanda¹⁴. El aumento de la prevalencia y la incidencia de trastornos neurológicos junto con la abundancia de compuestos no probados en el medio ambiente requiere el desarrollo de experimentos más fiables y eficientes para identificar compuestos ambientales peligrosos que puedan suponer neurotoxicidad¹⁵.

El método presentado aquí se puede utilizar para detectar la capacidad de los compuestos para inducir el crecimiento de la neurita y la neurotoxicidad aprovechando las neuronas derivadas de células progenitoras neuronales humanas, un modelo celular que representa estrechamente la biología humana.

Protocolo

Declaración de ética: Los especímenes fetales fueron recibidos del Laboratorio de Investigación de Defectos de Nacimiento de la Universidad de Washington en Seattle a través de un programa de distribución de tejidos apoyado por el Instituto Nacional de Salud (NIH). El Laboratorio de Investigación de Defectos De Nacimiento obtuvo el consentimiento fundamentado por escrito apropiado de los padres y la adquisición de tejidos fue monitoreada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Washington. Todo el trabajo se realizó con la aprobación de la Oficina de Investigación de Sujetos Humanos de la Universidad de Miami^8.

1. Aislamiento y cultivo de células progenitoras neuronales humanas (hNPC)

1. Coloque el tejido cerebral en una placa Petri de 100 mm y retire cuidadosamente las meninges usando fórceps.
2. Transfiera el tejido cerebral a un tubo cónico de 50 ml y lávelo dos veces con 20 ml de PBS invirtiendo suavemente el tubo.
3. Incubar el tejido cerebral en un nuevo tubo cónico de 50 ml sumergiendo el tejido en la solución de disociación celular (ver Tabla de materiales)y DNase I (10 U/ml) durante 10 min a 37oC.
4. Añadir 5 ml de medio de cultivo celular neuronal (ver Tabla de materiales)al tejido cerebral que contiene tubo y disociar mecánicamente las neuroesferas mediante la trituración de 20 a 30 veces a través de una punta de pipeta de 1000 l para hacer una suspensión de una sola célula.
5. Filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 70 m para eliminar los racimos de células.
6. Semilla de la suspensión monocelular en un matraz T-25 ventilado provisto de 5-10 ml de medio de cultivo celular neuronal complementado con componentes detallados en la Tabla 1.
   1. Esterilice la solución de heparina filtrando a través de un filtro de 0,2 m. El suplemento B-27 sin vitamina A es un suplemento libre de suero para el cultivo de progenitores neuronales y células madre, sin inducir la diferenciación.
      NOTA: Las células progenitoras neuronales humanas (hNPC) están aisladas del cerebro fetal humano recogido del feto abortado. Después de 7-10 días en el cultivo, las células madre neurales (NC) forman colonias de neuroesfera flotantes, mientras que otros tipos de células permanecen en suspensión como células individuales o se unen a la parte inferior del matraz. Los hNPC aislados se pueden cultivar como neuroesferas en suspensión durante varios^{meses 8,,16,,17}.

Cantidad	Componente
100 l	EGF (20 ng/mL)
100 l	FGF (10 ng/mL)
2 mL	B-27, Menos vitamina A (50X)
1 mL	L-alanil-L-glutamina (100X) (ver tabla de materiales)
4 l	Heparina (2 g/ml)
96,8 mL	Medio de cultivo celular neuronal (ver tabla de materiales)

Tabla 1. Componentes necesarios para la fabricación de 100 ml de medios de cultivo

2. Pasar los hNPC

1. Recoger los medios que contienen las esferas flotantes, grandes y pequeñas neuroesferas, y transferirlos a un tubo cónico de 50 ml.
   NOTA: Debido a razones desconocidas, el momento para dividir las neuroesferas es variable de 7 días a 30 días. Sin embargo, generalmente, las neuroesferas necesitan ser pasajes cuando alcanzan un diámetro mayor que 700-900 m. Esto es cuando el centro de la neuroesfera comienza a oscurecer, lo que se considera como un signo de una alta tasa de muerte celular¹⁸.
2. Gire las neuroesferas hacia abajo por centrifugación a 300-400 x g durante 3 min.
3. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y luego sumergir las esferas en 500 l de reactivo de disociación celular descongelada (ver Tabla de Materiales).
   1. Haga alícuotas de reactivo de disociación celular añadiendo 500 l por microtubos de 1,5 ml y guárdelos a -20 oC. Para evitar la pérdida de actividad enzimática, descongele el reactivo de disociación celular sosteniendo en RT o caliente durante 5 minutos en un baño de agua/perla de 37oC.
4. Dependiendo de la densidad y el tamaño de las esferas, incubar las esferas sumergidas a 37oC durante 5-15 min.
5. Añadir 5-10 ml de medios de cultivo precalentó a las neuroesferas que contienen tubo cónico de 50 ml y centrífuga a 300-400 x g durante 5 minutos para sedimentar las neuroesferas.
6. Aspirar el sobrenadante y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo, usando una pipeta de 1000 l, en 2 ml de medios de cultivo hasta que todas las neuroesferas estén en una sola suspensión celular.
   NOTA: La disociación se hará visible a simple vista. Antes de la disociación, las neuroesferas están en forma de esferas. Después de sumergirse en el reactivo de disociación y por pipetear hacia arriba y hacia abajo, se convertirán en células individuales.
   1. Contar las células y placar las células individuales, 2 a 3 millones de células por matraz T-25 en 10 ml de medios de cultivo.
7. Alimentar las células cada 3 días reemplazando la mitad de los medios de cultivo.
   1. Asenta las neuroesferas inclinando el matraz para que esté en su esquina inferior. Sostenga el matraz en la posición durante aproximadamente 1-2 minutos hasta que el sedimento de las neuroesferas. A continuación, aspirar la mitad de los medios suavemente insertando la pipeta serológica en los medios por encima de las neuroesferas asentadas. Las células disociadas pueden agregarse para formar esferas después de 2 a 3 días en el cultivo¹⁹.

3. Congelación de los hNPC

1. Preparar el medio de congelación celular añadiendo DMSO a los medios de cultivo a una concentración final del 10% (v/v) o utilizar un medio de criopreservación disponible comercialmente para tipos de celdas sensibles (consulte Tabla de materiales).
2. Ordene las esferas grandes transfiriendo los medios a un tubo cónico de 50 ml y dejando que las esferas se asienten por gravedad. A continuación, retire y transfiera las grandes neuroesferas a un nuevo tubo cónico de 50 ml para el passaging usando una punta de pipeta de 200 o 1000 l.
   NOTA: Las neuroesferas con un diámetro superior a 900 m se consideran grandes y las que tienen un diámetro inferior a 500 m se consideran pequeñas.
3. Gire las neuroesferas restantes hacia abajo por centrifugación a 300-400 x g durante 3 min. Retire cuidadosamente el sobrenadante.
4. Resuspender hasta 100 esferas en 1 ml de reactivo de criopreservación y transferirlo a un criotubo.
5. Conservar durante la noche a -80 oC en un recipiente de congelación celular (ver Tabla de materiales)y trasladarlo al nitrógeno líquido al día siguiente para su almacenamiento a largo plazo.
   NOTA: Es preferible congelar neuroesferas pequeñas a medianas (inferiores a 900 m de diámetro) y evitar la congelación de neuroesferas de gran tamaño (más de 900 m de diámetro) o células individuales. Con el fin de reducir el daño celular durante la descongelación de la muestra, mantenga las células densas sembrando las neuroesferas descongeladas en un pequeño matraz T25.

4. Diferenciación y tratamiento de los hNPC

NOTA: Para inducir la diferenciación, las neuroesferas se desagregan en células individuales, se cuentan y luego se siembran en placas recubiertas durante 5 días. Luego, las células diferenciadas se tratan durante 24 h con compuestos de ensayo antes de la inmunosuferencia y la cuantificación de la fluorescencia.

1. Capa
   1. Añadir 200 l de poli-L-lisina (PLL) por pocero de los portaobjetos de cámara de vidrio de 4 pod (140 l por pocero de los portaobjetos de cámara de 8 polos).
   2. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (RT).
   3. Lavar 3x con PBS.
   4. Dejar secar a RT (durante unos 30 min).
   5. Añadir 150 l de laminin (50 g/ml) por pocero de los portaobjetos de cámara de vidrio de 4 podéricos (120 oL por pocero de los portaobjetos de cámara de 8 pocín).
   6. Incubar durante 2 h a 37oC.
   7. Lavar 3x con PBS.
      NOTA: Los portaobjetos de cámara recubiertos se pueden almacenar a 4 oC durante 1 mes.
2. Chapar las células
   1. Recuento y placa 80.000 neuroesferas de una sola célula (neuroesferas en una sola suspensión celular) por pozo de diapositivas de cámara de 4 pozos (70.000 células por pozo de tobogán de cámara de 8 pozos).
   2. Añadir 500 l de medios de diferenciación por poción de tobogán de cámara de 4 pocólo (250 oL de soportes de cámara de 8 pocódizos).
      1. Para hacer primero el medio de diferenciación, agregue los siguientes componentes de la Tabla 2 a un contenedor estéril y desechable para hacer el medio de inducción neuronal (NIM).
      2. Agregue los siguientes ingredientes en la Tabla 3 a 48,5 ml de NIM realizada en el paso anterior para hacer la diferenciación de medios.
   3. Incubar durante 5 días a 37oC.
   4. Después de 5 días, tratar las células durante 24 h reemplazando la mitad de los medios en cada pozo con medios frescos mezclados con la concentración deseada de compuestos de prueba, incluyendo controles apropiados.

Cantidad	Componente
49 mL	DMEM/F-12
0,5 mL	N2 suplemento (100X)
0,5 mL	MeM aminoácidos no esenciales (100X)
2 l	Heparina (2 g/ml) (Stock Conc. es de 50 mg/ml)

Tabla 2. Componentes necesarios para fabricar 50 mL de NIM

Cantidad	Componente
1 mL	B-27 (50X)
500 l	Antibiótico-antimiótico (100X)
5 l	Acido retinoico (0,1 m)
50 l	GDNF (10 g/ml)
50 l	BDNF (10 g/ml)
5 l	Acido ascórbico (0,2 g/ml) (Stock Conc. es 2 mg/ml) NOTA: Se recomienda que se haga fresco.
48,5 mL	Nim

Cuadro 3. Componentes necesarios para fabricar 50 ml de medios de diferenciación

5. Inmunocitoquímica (ICC)

NOTA: Las celdas se fijan con un 4% de formaldehído. A continuación, se realiza la permeabilización y el bloqueo para mejorar la penetración y prevenir la unión inespecífica de anticuerpos. Luego, las células se incuban con anticuerpos primarios durante la noche. Posteriormente, las células se incuban con anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente. Finalmente, después de usar DAPI para manchar el núcleo, se montan los portaobjetos de la cámara.

1. Fijación
   1. Aspirar suavemente los medios de cada pozo.
   2. Añadir 500 l de 4% de formaldehído por pocón de toboganes de cámara de 4 pocód siguientes (250 l por pocmillo de diapositivas de cámara de 8 pocód siguientes).
   3. Incubar durante 15 min en RT.
   4. Lavar suavemente 2x con 500 s de PBS.
      NOTA: Después de la fijación, dejando 1 ml de PBS en cada pozo, las diapositivas de cultivo se pueden almacenar a 4 oC durante un máximo de 3 meses.
2. Permeabilización y bloqueo celular
   1. Agregue los siguientes componentes de la Tabla 4 a un recipiente estéril y desechable para hacer el tampón de anticuerpos (Ab).
   2. Mezclar los siguientes ingredientes en la Tabla 5 con el tampón Ab hecho en el paso anterior para hacer que la célula permeabilización y solución de bloqueo.
   3. Añadir 500 l por poción de toboganes de cámara de 4 pocóculos e incubar durante 1 h en RT.
      NOTA: El búfer Ab se puede almacenar a 4 oC.

Cantidad	Componente
1,75 g	NaCl (150 mM)
1,2 g	TrisBase (50 mM)
2 g	BSA 1%
3,6 g	L-lisina (100 mM)
8 g	Azida de sodio (4%)
200 mL	Agua destilada. NOTA: Disolver inicialmente los componentes requeridos en 150 ml de agua y, a continuación, ajustar a 200 ml.

Cuadro 4. Componentes necesarios para fabricar 200 ml de tampón de anticuerpos

Cantidad	Componente
600 l	20% Suero de cabra
6 L	0.2% Tritón-X100
2394 L	Búfer de anticuerpos. NOTA: Disolver inicialmente los componentes necesarios en 2 ml del búfer Ab y, a continuación, ajustar a pH 7.4. A continuación, agregue más búfer Ab para ajustar al volumen final de 3 ml y filtrar esterilizar.

Cuadro 5. Componentes necesarios para hacer 3 ml de permeabilización celular y solución de bloqueo

3. Tinción
   1. Lavar 2x con 500 l de PBS.
   2. Añadir el anticuerpo primario diluido, anti-tubulina III (1:200), e incubar durante la noche a 4 oC (200 oC por poc de toboganes de cámara de 4 pocicos). Diluir el anticuerpo primario en PBS.
   3. Lavar 2x con PBS.
   4. Añadir el anticuerpo secundario diluido, en PBS, con etiqueta fluorescente, Alexa Fluor 488 (1:500), e incubar durante 2 horas en RT en un lugar protegido de la luz (250 oL por pocillo de las diapositivas de cámara de 4 podillos)
   5. Lavar 2x con PBS.
   6. Añadir el diluido, en PBS, DAPI (concentración de 300 nM) e incubar durante 5 minutos a RT en un lugar protegido de la luz (300 l por pocillo de diapositivas de cámara de 4 pocillos).
   7. Lavar 3x con PBS.
   8. Monte las correderas de la cámara siguiendo las siguientes instrucciones.
      1. Desmonte el tobogán de la cámara rompiendo las pestañas de separación y quitando la junta y la base.
      2. Añada una gota de la solución de montaje (consulte Tabla de materiales)por pozo de portaobjetos de 4 pozos. A continuación, utilice una diapositiva de cubierta para cubrir toda la diapositiva.
      3. Usando una pinza y en un ángulo, coloque un lado del resbalón de la cubierta contra la corredera mientras hace contacto con el borde exterior de la gota de líquido.
      4. Coloque cuidadosamente la cubierta sobre la solución de montaje al colocarla en su lugar. Evitar la creación de burbujas. Tome una punta de pipeta y presiónelo hacia abajo en el resbalón de la cubierta. Las burbujas se moverán hacia un lado.
         NOTA: La formación de burbujas es inevitable a veces. Si ocurre, imagen alrededor de ellos siempre y cuando haya algunos.
      5. Siga las instrucciones del fabricante para el tiempo de curado. Evite el uso de soluciones de montaje sin curvas debido a la dificultad de manipulación durante la toma de imágenes. De lo contrario, se requiere el uso de un sellador de cubrelip adecuado en los bordes para evitar que el cubreobjetos se deslice durante la toma de imágenes.
      6. Para sellar el cubreobjetos, utilice esmalte de uñas y haga una pequeña línea en el borde del resbalón de la cubierta. Deje secar el esmalte de uñas durante unos 2 minutos.

6. Adquisición de imágenes, crecimiento de neurita y cuantificación de la intensidad de la fluorescencia

NOTA: Después de la tinción, utilice un microscopio confocal con un objetivo de 20x y un tamaño de imagen de 1024 x 1024 píxeles para adquirir las imágenes de las celdas tratadas. Tome la imagen al menos de dos campos por réplica biológica por condición. A continuación, utilice el software de análisis de imágenes de Fiji (ImageJ 1.51u) para cuantificar la longitud del neurito. Brevemente, medir la longitud de la neurita más larga para cada neurona y después de promediar los valores por tratamiento, utilizar la prueba t del estudiante para grupos independientes para comparar los medios entre los grupos experimentales y el grupo de control.

NOTA: Varios programas de procesamiento de imágenes comerciales (Imaris, Volocity, Amira) y de código abierto (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) están disponibles. Entre estos programas, ImageJ se ha convertido en la herramienta de elección para el análisis de imágenes biológicas^20,,21. El portal ImageJ en https://imagej.net/Introduction es una fuente útil de información que proporciona una descripción completa de las funciones básicas e integradas de ImageJ, incluyendo procesamiento de imágenes, colocación, desconvolución, registro, segmentación, seguimiento y visualización.

1. Medición del crecimiento neuronal con el software de análisis de imágenes de Fiji
   1. Como se ilustra en la Figura 1, abra la imagen arrastrándola y soltándola sobre el software de Fiji o seleccionando Archivo . Abrir.
   2. Seleccione Analizar ?? Herramientas ? Administrador de ROI, y luego haga clic con el botón derecho en el icono^{5 en} la barra de herramientas Recta y cambie a línea a mano alzada. Opcionalmente, haga doble clic en el mismo icono para cambiar el ancho de la línea a 10, y luego trace el neurito más largo, comenzando cerca del cuerpo de la celda y extendiéndose hasta la punta del neurito.
   3. Presione Ctrl + T y luego F para agregar la medición al Administrador de ROI y resaltar la neurona medida. Seleccione todos los números en el ROI, haga clic en Medir, seleccione todas las longitudes calculadas y copie/pegue en una hoja de cálculo.
2. Medición de la intensidad de fluorescencia de las células etiquetadas con el software de análisis de imágenes de Fiji
   1. Como se ilustra en la Figura 2,después de abrir la imagen, haga clic en el icono 4^en la barra de herramientas Selecciones a mano alzada. Dibuja la forma de la celda.
   2. Seleccione Analizar ?? Establezca Mediciones y seleccione los siguientes valores: Area, Densidad integrada, Valor gris medio ? Analizar ? Medir (se abre un cuadro emergente con una pila de valores).
   3. Seleccione una región junto a la celda como fondo (el tamaño no es importante) y, a continuación, seleccione Analizar . Medir. Seleccione todos los datos medidos y copie/pegue en una hoja de cálculo.
      NOTA: Densidad integrada (IntDen) es el elemento utilizado para determinar las intensidades fluorescentes. En este estudio se mide la intensidad fluorescente de la molécula diana para analizar inicialmente su distribución en la célula y posteriormente cuantificar la abundancia de la molécula diana bajo diversos tratamientos. En consecuencia, se medirá la eficacia de los tratamientos y se comparará con el control.

7. Evaluación de neurotoxicidad

NOTA: La citotoxicidad de los compuestos de ensayo se evalúa en placas de 384 pozos (ver Tabla de materiales)utilizando un ensayo de viabilidad de celdas luminiscentes (ver Tabla de materiales). Los hNPC se preparan siguiendo el mismo método, excepto ligeras modificaciones, descritas en la sección "Diferenciación y tratamiento de los hNPC". Posteriormente, se mide una señal luminiscente generada por un ensayo de viabilidad de células luminiscentes utilizando un lector de microplacas. La señal luminiscente es proporcional a la concentración celular de ATP que a su vez es directamente proporcional al número de células viables presentes en cada pozo.

1. Capa
   1. Añadir 30 l de poli-L-lisina (PLL) por poción de placa de 384 pocillos.
   2. Incubar durante 1 h en RT.
   3. Lavar 2x con PBS.
   4. Dejar secar a RT (durante unos 30 min).
   5. Añadir 30 l de laminin (50 g/ml) por pocero de placa de 384 pocillos.
   6. Incubar durante 2 h a 37oC.
   7. Lavar 2x con PBS.
      NOTA: Las placas recubiertas de 384 pozos se pueden almacenar a 4 oC durante 1 mes.
2. Chapar las células
   1. Recuento y placa 20.000 neuroesferas de una sola célula por poción de placa de 384 pocillos en 25 l de medios de diferenciación.
   2. Incubar durante 5 días a 37oC.
   3. Después de 5 días, tratar las células durante 24 h por compuestos de ensayo preparados a 6 veces la concentración final deseada en volumen de 5 l (para hacer el volumen final de 30 l por pozo).
3. Ensayo de viabilidad celular
   1. Añadir 30 l de reactivo de ensayo de viabilidad de células luminiscentes por pocero de placa de 384 pocillos.
      NOTA: Añada un volumen de reactivo de viabilidad de celda luminiscente igual al volumen presente en cada pozo. Descongelar el reactivo de viabilidad de la célula luminiscente y equilibrar a RT antes de su uso.
   2. Agitar en un agitador de placa durante 2 minutos (para mezclar e inducir la lelisis celular).
   3. Girar la mezcla hacia abajo por centrifugación a 300-400 x g durante 30 s.
   4. Incubar la placa de 384 pozos durante 10 minutos en RT en un lugar protegido de la luz (para estabilizar la señal luminiscente).
   5. Graba luminiscencia con un lector de microplacas.
      NOTA: Utilice los controles adecuados para el ensayo de viabilidad, incluyendo Velcade (a una concentración final de 10 m) como positivo y HBSS que contenga DMSO (con una concentración final de 0,1% o 0,2%) como control negativo.

Resultados

El protocolo presentado en el manuscrito se ha utilizado con éxito en dos artículos publicados recientemente^22,,23. La Figura 3 demuestra el uso de neuronas derivadas de hNPCs en el examen del efecto de los inhibidores de la HDAC como compuestos epigenéticos en la extensión de las neuritas como marcador para el crecimiento de la neurita y la posterior capacidad neurogénica de compuestos de moléculas pequeñas.

Discusión

Este protocolo es uno de los pocos artículos publicados que describen la prueba de la longitud de la neurita tras el tratamiento con compuestos de prueba. Además, describimos cómo utilizar hNPCs para un ensayo de crecimiento de neurita y una evaluación de neurotoxicidad. Mediante la utilización de este ensayo de crecimiento de neurita y la evaluación de la neurotoxicidad en las neuronas derivadas de hNPCs, se demuestra el potencial neurogénico de una categoría de compuestos epigenéticos de moléculas pequeñas, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well Glass Chamber Slides	Sigma	PEZGS0816
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001
Alexa Fluor 594	Invitrogen	R37117
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062
Anti-β-Tubulin III	Thermo	MA1-118X
B27	Thermo	17504001
B27 - minus vitamin A	Thermo	12587010
BDNF	PeproTech	450-02
BSA	Sigma	A8531
CellTiter-Glo	Promega	G7572
CoolCell	Corning	432000	Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930	Cryopreservation medium containing 10% DMSO
DAPI	Thermo	D1306
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	Sigma	34869-100ML
EGF	Gibco	PHG0311
FGF	Gibco	PHG6015
Formaldehyde	Thermo	FB002
GDNF	PeproTech	450-10
Glutamax	Gibco	35050061	L-alanyl-L-glutamine supplement
Goat Serum	Thermo	50062Z
Heparin	Calbiochem	375095
Laminin	Sigma	L2020-1MG
L-Ascorbic Acid	Sigma	A92902-25G
L-lysine	Sigma	L5501
MEM non-essential amino acids	Gibco	11140050
mFreSR	StemCell Technologies	5854	Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
N2	Gibco	17502048
NaCl	Sigma	71376
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates	Thermo	164610
PBS	Thermo	10010-049
Poly-L-lysine	Sigma	P5899-5MG
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo	P10144
Retinoic Acid	Sigma	R2625
Sodium Azide	Sigma	S2002
StemPro Accutase	Gibco	A1110501	Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes
Synaptophysin	Thermo	MA5-14532
Tris Base	Sigma	10708976001
Triton X-100	Sigma	X100-100ML