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Method Article
Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode für einen Neuriten-Auswuchs-Assay und neurotoxizitätsbewertete kleine Molekülverbindungen.
Neuriten-Auswuchs-Assay und Neurotoxizitätsbewertung sind zwei wichtige Studien, die mit der vorgestellten Methode hierin durchgeführt werden können. Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Analyse der neuronalen Morphologie zusammen mit quantitativen Messungen von Modifikationen auf Neuritenlänge und synaptische Proteinlokalisierung und Fülle bei der Behandlung mit kleinen Molekülverbindungen. Zusätzlich zur Anwendung der vorgestellten Methode in Neuriten-Auswuchsstudien kann eine Neurotoxizitätsbewertung durchgeführt werden, um kommerzielle chemische Verbindungen auf der Grundlage ihrer potenziellen Entwicklungs-Neurotoxizitätswirkung zu bewerten, zu unterscheiden und zu ordnen.
Obwohl Zelllinien heutzutage in zusammengesetzten Screening-Assays in der Neurowissenschaft weit verbreitet sind, unterscheiden sie sich oft genetisch und phänotypisch von ihrem Gewebeursprung. Primärzellen hingegen behalten wichtige Marker und Funktionen bei, die in vivo beobachtet werden. Aufgrund des Übersetzungspotenzials und der physiologischen Relevanz, dass diese Zellen einen Neuriten-Auswuchs-Assay anbieten könnten, kann die Neurotoxizitätsbewertung erheblich von der Verwendung menschlicher neuronaler Vorläuferzellen (hNPCs) als primäres menschliches Zellmodell profitieren.
Die vorgestellte Methode hierin kann verwendet werden, um für die Fähigkeit von Verbindungen zu untersuchen, um Neuritenwachstum und Neurotoxizität zu induzieren, indem die Vorteile der menschlichen neuronalen Vorläuferzell-abgeleiteten Neuronen, ein Zellmodell, das eng die menschliche Biologie darstellt."
Das Neuritwachstum ist ein Prozess, der für die Bildung des neuronalen Netzwerks und der Nervenregeneration1,2von grundlegender Bedeutung ist. Nach einer Verletzung spielt das Neuritenwachstum eine Schlüsselrolle bei der Regeneration des Nervensystems. Neuritenwachstum ist auch ein wichtiges Element der extrazellulären Signalisierung bei der Induktion neuronaler regenerativer Aktivitäten zur Verbesserung der Ergebnisse bei neurodegenerativen Erkrankungen und neuronalen Verletzungen3,4,5,6.
Durch die Aufrechterhaltung ihres Differenzierungspotenzials bei der Herstellung verschiedener neuronaler Abstammungen könnten menschliche neuronale Vorläuferzellen (hNPCs) ein Modellsystem für Studien der Funktion des zentralnervensystems (ZNS) und der Entwicklung7,8,9. Hohes Translationspotenzial und physiologische Relevanz von hNPCs als primäres menschliches Zellmodell bieten einen erheblichen Vorteil bei neurititbedingten Antik-Entdeckungsscreenings. Die Wartung und Skalierung der primären Zellmodelle für Tests mit hohem Durchsatz kann jedoch zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein10,11,12,13.
Neben der Anwendung der vorgestellten Methode in Neuriten-Auswuchsstudien ist die Neurotoxizitätsbewertung eine weitere Anwendung mit den hNPC-abgeleiteten Neuronen. Es gibt Tausende von kommerziellen chemischen Verbindungen, die entweder nicht untersucht werden oder mit schlecht verstandenem Neurotoxizitätspotenzial. Daher sind zuverlässigere und effektivere Screening-Experimente zur Bewertung, Unterscheidung und Rangfolge von Verbindungen basierend auf ihrem Potenzial, eine Entwicklungsneurotoxizität auszulösen, sehr gefragt14. Die Zunahme der Prävalenz und Inzidenz von neurologischen Störungen zusammen mit der Fülle von ungetesteten Verbindungen in der Umwelt erfordert die Entwicklung von vertrauenswürdigeren und effizienteren Experimenten, um gefährliche Umweltverbindungen zu identifizieren, die Neurotoxizität darstellen können15.
Die vorgestellte Methode hierin kann verwendet werden, um für die Fähigkeit von Verbindungen zu untersuchen, um Neuritenwachstum und Neurotoxizität zu induzieren, indem die Vorteile der menschlichen neuronalen Vorläufer-Zell-abgeleiteten Neuronen, ein Zellmodell, das eng die menschliche Biologie darstellt.
Ethik-Erklärung: Fetale Proben wurden vom Birth Defects Research Laboratory der University of Washington in Seattle über ein Vom National Institute of Health (NIH) unterstütztes Gewebeverteilungsprogramm erhalten. Das Birth Defects Research Laboratory erhielt die entsprechende schriftliche Zustimmung der Eltern in Kenntnis der Sachlage und die Beschaffung von Geweben wurde vom Institutional Review Board der University of Washington überwacht. Alle Arbeiten wurden mit Genehmigung des Human Subject Research Office an der University of Miami8durchgeführt.
1. Isolation und Kultur menschlicher neuronaler Vorläuferzellen (hNPCs)
Menge | Komponente |
100 l | EGF (20 ng/ml) |
100 l | FGF (10 ng/ml) |
2 mL | B-27, Minus Vitamin A (50X) |
1 ml | L-Alanyl-L-Glutamin (100X) (siehe Materialtabelle) |
4 l | Heparin (2 g/ml) |
96,8 ml | Neuronale Zellkulturmedium (siehe Materialtabelle) |
Tabelle 1. Komponenten, die für die Herstellung von 100 ml Kulturmedien erforderlich sind
2. Passaging der hNPCs
3. Einfrieren der hNPCs
4. Differenzierung und Behandlung von hNPCs
HINWEIS: Um eine Differenzierung zu induzieren, werden Neurosphären in einzelne Zellen zerlegt, gezählt und dann 5 Tage lang auf beschichteten Platten gesät. Anschließend werden differenzierte Zellen für 24 h mit Testverbindungen vor Immunfärbung und Fluoreszenzquantififizierung behandelt.
Menge | Komponente |
49 ml | DMEM/F-12 |
0,5 ml | N2-Ergänzung (100X) |
0,5 ml | MEM nicht essentielle Aminosäuren (100X) |
2 l | Heparin (2 g/ml) (Lager-Conc. ist 50 mg/ml) |
Tabelle 2. Erforderliche Komponenten für die Herstellung von 50 ml NIM
Menge | Komponente |
1 ml | B-27 (50X) |
500 l | Antibiotika-Antimykotika (100X) |
5 l | Retinsäure (0,1 m) |
50 l | GDNF (10 g/ml) |
50 l | BDNF (10 g/ml) |
5 l | Ascorbinsäure (0,2 g/ml) (Stock Conc. ist 2 mg/ml) HINWEIS: Empfohlen, frisch zubereitet zu werden. |
48,5 ml | Nim |
Tabelle 3. Komponenten, die für die Herstellung von 50 ml Differenzierungsmedien erforderlich sind
5. Immunzytochemie (ICC)
HINWEIS: Die Zellen sind mit 4% Formaldehyd fixiert. Permeabilisierung und Blockierung wird dann durchgeführt, um die Penetration zu verbessern und unspezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern. Die Zellen werden dann über Nacht mit primären Antikörpern inkubiert. Anschließend werden Die Zellen mit fluoreszierend markierten Sekundärantikörpern inkubiert. Schließlich werden nach der Verwendung von DAPI, um den Kern zu beflecken, Kammerschlitten montiert.
Menge | Komponente |
1,75 g | NaCl (150 mM) |
1,2 g | TrisBase (50 mM) |
2 g | BSA 1% |
3,6 g | L-Lysin (100 mM) |
8 g | Natriumazid (4%) |
200 ml | Destilliertes Wasser. HINWEIS: Lösen Sie zunächst die benötigten Komponenten in 150 ml Wasser auf, dann stellen Sie sie auf 200 ml ein. |
Tabelle 4. Komponenten für die Herstellung von 200 ml Antikörperpuffer erforderlich
Menge | Komponente |
600 l | 20% Ziegenserum |
6 l | 0,2% Triton-X100 |
2394 l | Antikörperpuffer. HINWEIS: Lösen Sie zunächst die erforderlichen Komponenten in 2 ml Ab-Puffer auf und stellen Sie dann pH 7,4 ein. Fügen Sie dann mehr Ab-Puffer hinzu, um sich an das Endvolumen von 3 ml anzupassen und filtern Sie sie. |
Tabelle 5. Komponenten, die für die Herstellung von 3 ml Zellpermeabilisations- und Blockierlösung erforderlich sind
6. Bildaufnahme, Neuritenwachstum und Fluoreszenzintensitätsquantifizierung
HINWEIS: Verwenden Sie nach der Färbung ein konfokales Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv und einer Bildgröße von 1024 x 1024 Pixeln, um die Bilder der behandelten Zellen zu erfassen. Nehmen Sie mindestens Bilder aus zwei Feldern pro biologischer Replikation pro Bedingung auf. Verwenden Sie dann die Fidschi-Bildanalysesoftware (ImageJ 1.51u) zur Quantifizierung der Neuritenlänge. Kurz gesagt, messen Sie die Länge des längsten Neurites für jedes Neuron und nach der Mittelung der Werte pro Behandlung, verwenden Sie den t-Test des Studenten für unabhängige Gruppen, um die Mittelwerte zwischen experimentellen Gruppen und Kontrollgruppen zu vergleichen.
HINWEIS: Mehrere kommerzielle (Imaris, Volocity, Amira) und Open Source (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) Bildverarbeitungsprogramme sind verfügbar. Unter diesen Programmen ist ImageJ zum Werkzeug der Wahl für die biologische Bildanalysegeworden 20,21. Das ImageJ-Portal auf https://imagej.net/Introduction ist eine nützliche Informationsquelle, die eine gründliche Beschreibung der grundlegenden und integrierten Funktionen von ImageJ bietet, einschließlich Bildverarbeitung, Kolokalisierung, Dekonvolution, Registrierung, Segmentierung, Tracking und Visualisierung.
7. Neurotoxizitätsbewertung
ANMERKUNG: Die Zytotoxizität von Prüfverbindungen wird in 384-Well-Platten (siehe Materialtabelle) mit einem leuchtmförmigen Zelllebensfähigkeitstest (siehe Tabelle der Materialien) bewertet. Die hNPCs werden nach der gleichen Methode hergestellt, mit Ausnahme leichter Änderungen, die im Abschnitt "Differenzierung und Behandlung von hNPCs" beschrieben sind. Anschließend wird ein Lumineszenzsignal gemessen, das durch den Leuchtstoffzell-Lebensfähigkeitstest erzeugt wird, indem ein Mikroplattenleser verwendet wird. Das Leuchtsignal ist proportional zur zellulären ATP-Konzentration, die selbst direkt proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen ist, die in jedem Brunnen vorhanden sind.
Das im Manuskript vorgestellte Protokoll wurde erfolgreich in zwei kürzlich veröffentlichten Papieren22,23verwendet. Abbildung 3 zeigt die Verwendung von hNPCs-abgeleiteten Neuronen bei der Untersuchung der Wirkung von HDAC-Inhibitoren als epigenetische Verbindungen auf die Ausdehnung von Neuriten als Marker für das Neuritenwachstum und die anschließende neurogene Fähigkeit kleiner Molekülverbindungen.
Dieses Protokoll ist eines der wenigen veröffentlichten Papiere, die den Test auf Neuritenlänge bei der Behandlung mit Testverbindungen beschreiben. Darüber hinaus beschreiben wir, wie hNPCs für einen Neuriten-Outgrowth-Assay und eine Neurotoxizitätsbewertung verwendet werden. Durch die Verwendung dieses Neuriten-Outgrowth-Assays und der Neurotoxizitätsbewertung an hNPCs-abgeleiteten Neuronen wird das neurogene Potenzial einer Kategorie von epigenetischen Kleinmolekülverbindungen, HDAC-Hemmern, bei der Induktion v...
Alle Autoren weisen auf keine potenziellen Interessenkonflikte hin.
Diese Forschung wurde durch ein NIMAD-Forschungsstipendium (940714) finanziert, das mAF gewährt wurde.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
B27 | Thermo | 17504001 | |
B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
BDNF | PeproTech | 450-02 | |
BSA | Sigma | A8531 | |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
DAPI | Thermo | D1306 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
EGF | Gibco | PHG0311 | |
FGF | Gibco | PHG6015 | |
Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
GDNF | PeproTech | 450-10 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
Heparin | Calbiochem | 375095 | |
Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
L-lysine | Sigma | L5501 | |
MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
N2 | Gibco | 17502048 | |
NaCl | Sigma | 71376 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
PBS | Thermo | 10010-049 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
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