تصوير صدى القلب بالموجات فوق الصوتية عالي التردد لتقييم وظيفة القلب في زيبرافيش

Summary

نحن نصف بروتوكول لتقييم مورفولوجيا القلب ووظيفة في حمار وحشي بالغ باستخدام تخطيط صدى القلب عالي التردد. تسمح الطريقة بتصور القلب والقياس الكمي اللاحق للمعلمات الوظيفية ، مثل معدل ضربات القلب (HR) ، وناتج القلب (CO) ، وتغيير المنطقة الكسرية (FAC) ، وجزء القذف (EF) ، وتدفق الدم وسرعات التدفق إلى الخارج.

Abstract

أصبح حمار وحشي(Danio rerio)كائنًا نموذجيًا شائعًا جدًا في أبحاث القلب والأوعية الدموية ، بما في ذلك أمراض القلب البشري ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى شفافيته الجنينية ، وقابلية النقل الجينية ، ووسائل الراحة للدراسات السريعة عالية الإنتاجية. ومع ذلك ، فإن فقدان الشفافية يحد من تحليل وظائف القلب في مرحلة البالغين ، مما يعقد نمذجة أمراض القلب المرتبطة بالعمر. للتغلب على هذه القيود ، يظهر تصوير صدى القلب بالموجات فوق الصوتية عالي التردد في سمك الحمار الوحشي كخيار قابل للتطبيق. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لتقييم وظيفة القلب في سمك الحمار الوحشي الكبار عن طريق تخطيط صدى القلب غير الغازية باستخدام الموجات فوق الصوتية عالية التردد. تسمح الطريقة بتصور وتحليل بُعد قلب الحمار الوحشي وقياس المعلمات الوظيفية الهامة ، بما في ذلك معدل ضربات القلب وحجم السكتة الدماغية والإخراج القلبي وجزء القذف. في هذه الطريقة ، يتم تم ّت ّ تَدْوّر السمكَ وتبقى تحت الماء، ويمكن استردادها بعد العملية. على الرغم من أن الموجات فوق الصوتية عالية التردد هي تقنية مكلفة ، يمكن استخدام نفس منصة التصوير لأنواع مختلفة (على سبيل المثال ، المورين وسمك الحمار الوحشي) عن طريق تكييف محولات مختلفة. تصوير صدى القلب حمار وحشي هو طريقة قوية لفينوبة القلب، مفيدة في التحقق من صحة وتوصيف نماذج الأمراض، وخاصة الأمراض في وقت متأخر من ظهور; شاشات المخدرات؛ ودراسات من إصابة القلب، والانتعاش، والقدرة على التجديد.

Introduction

وحمار وحشي(Danio rerio)هو نموذج الفقاريات راسخة لدراسات عمليات التنمية والأمراض البشرية¹. وللحمار الوحشي تشابه وراثي كبير مع البشر (70%)، وقابلية للحصول على السمية الوراثية، وخصوبة عالية، وشفافية بصرية أثناء التطور الجنيني، مما يسمح بالتحليل البصري المباشر للأعضاء والأنسجة، بما في ذلك القلب. على الرغم من وجود الأذين واحد فقط والبطين واحد، وقلب حمار وحشي(الشكل 1)يشبه من الناحية الفسيولوجية إلى قلوب الثدييات أربع غرف. الأهم من ذلك ، فإن معدل ضربات القلب حمار وحشي ، ومورفولوجيا تخطيط القلب ، وشكل العمل المحتمل تشبه تلك التي من البشر أكثر من أنواع المورين^2. وقد جعلت هذه الميزات حمار وحشي نموذجا ممتازا لأبحاث القلب والأوعية الدموية وقدمت رؤى رئيسية في تطور القلب^3،4، تجديد⁵، والظروف المرضية^1،3،4، بما في ذلك تصلب الشرايين ، اعتلال عضلة القلب ، عدم انتظام ضربات القلب ، أمراض القلب الخلقية ، وسلسلة الأميلويد الضوئية السمية القلبية^1،4،6. وقد تم تقييم وظيفة القلب ممكن خلال المرحلة الجنينية (1 أيام بعد الإخصاب) من خلال تحليل الفيديو المباشر باستخدام المجهر الفيديو عالية السرعة^7،8. ومع ذلك، تفقد سمك الحمار الوحشي شفافيتها خارج المرحلة الجنينية، مما يحد من التقييمات الوظيفية للقلوب الناضجة العادية وأمراض القلب المتأخرة. للتغلب على هذا القيد ، تم استخدام تخطيط صدى القلب بنجاح كبديل تصويري عالي الدقة وفي الوقت الحقيقي وغير باضع لتقييم وظيفة قلب الحمار الوحشي البالغ^{9،10،11،12،13،14،15.}

في حمار وحشي، يقع القلب ventrally في تجويف الصدر الخلفي مباشرة إلى الخياشيم مع الأذين تقع الظهر إلى البطين. يجمع الأذين الدم الوريدي من الوريد الالجيوب الأنفية وينقلها إلى البطين حيث يتم ضخه إلى الشرايين اللمبية(الشكل 1). هنا، نصف بروتوكول فسيولوجية تحت الماء لتقييم وظيفة القلب في سمك الحمار الوحشي البالغ عن طريق تخطيط صدى القلب غير الغازيباستخدام مسبار الموجات فوق الصوتية الصفيف الخطي مع تردد مركز 50 ميغاهرتز للتصوير B-الوضع بدقة 30 ميكرومتر. منذ الموجات فوق الصوتية يمكن السفر بسهولة من خلال المياه، والحفاظ على القرب بين الأسماك ومسبار المسح تحت الماء يوفر ما يكفي من سطح الاتصال للكشف عن القلب مع عدم الحاجة إلى هلام الموجات فوق الصوتية وعموما أقل إرهاقا للأسماك. على الرغم من أن تم الإبلاغ عن أنظمة تخطيط صدى صدى الحمار الوحشي البديلة من قبل العديد من المؤلفين^9،12،13، هنا نقدم الإعداد العام والأكثر استخدامًا الذي ينطبق على الموجات فوق الصوتية عالية التردد في الحيوانات.

تسمح هذه الطريقة بالتصوير عالي الدقة لقلب سمك الحمار الوحشي البالغ ، وتتبع هياكل القلب ، وقياس سرعات الذروة من قياسات تدفق الدم دوبلر. نظهر موثوقية في القياس الكمي الجسمي للمعلمات الانقباضي والانبساطي الهامة، مثل كسر القذف (EF)، وتغيير المنطقة الكسرية (FAC)، وتدفق الدم البطيني وسرعات التدفق، ومعدل ضربات القلب (HR)، وناتج القلب (CO). نحن نساهم في إنشاء مجموعة موثوقة من المعلمات القلبية والوظائف والأبعاد الصحية للبالغين العاديين للسماح بإجراء تقييم أكثر دقة للحالات المرضية. عموما، ونحن نقدم طريقة قوية لتقييم وظيفة القلب في حمار وحشي، والتي أثبتت مفيدة للغاية⁶في إنشاء والتحقق من صحة نماذج أمراض القلب حمار وحشي^6،16،إصابة القلب والانتعاش^10،,13،وتجديد^11،,12،ويمكن استخدامها كذلك لتقييم الأدوية المحتملة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على حمار وحشي من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية والاستخدام وهي متوافقة مع قانون رعاية الحيوان في وزارة الزراعة الأميركية.

1- الإعداد التجريبي

1. إعداد النظام الأساسي للحصول على الصور
   1. باستخدام مقص صغير أو مشرط إجراء شق على الاسفنج في موقف 12:00 لعقد الأسماك أثناء المسح الضوئي. ضع الاسفنجة في وعاء زجاجي(الشكل 2A).
      ملاحظة: يجب أن يسمح موضع الشق بمساحة كافية لتحريك المحول وكذلك للحفاظ على الأسماك رفع الصوت عاليا خط المياه عندما يميل منصة للمسح الضوئي(الشكل 2). يمكن أن يختلف الشق حسب حجم السمك. ومع ذلك ، بالنسبة للحجم والوزن القياسيين ، يجب أن يكون الشق حوالي 2.5 سم × 0.7 سم × 0.5 سم (الطول والعرض والعمق ، على التوالي). يجب أن يكون عمق الحاوية الزجاجية 6 سم على الأقل لتجنب تسرب المياه أثناء تصوير الأسماك.
   2. لصق مربع الزجاج الذي يحتوي على الاسفنج على منصة الموجات فوق الصوتية، على سبيل المثال باستخدام الشريط على الوجهين. تأكد من أن الصندوق الزجاجي في وسط المنصة ومتصل بإحكام(الشكل 2B).
   3. إمالة المنصة إلى الأمام حوالي 30 درجة باستخدام مقبض الباب على الجانب الأيسر من حامل المنصة(الشكل 2B). ملء مربع زجاجي مع 200-250 مل من المياه نظام الأسماك التي تحتوي على 0.2 ملغ / مل tricaine الميثانسولنات (MS222).
      ملاحظة: يمكن إعداد التريكين كحل مخزون 4 ملغ/مل في تريس 40 ممل درجة الحموضة 7 ومخففة إلى التركيز المطلوب في مياه نظام السمك؛ تم العثور على 0.2 ملغ / مل ليكون أفضل تركيز^16. يمكن تخزين محلول مخزون التريكائين 4 ملغم/مل لفترة طويلة من الزمن عند -20 درجة مئوية أو عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
   4. أدخل محول داخل حامل micromanipulator على محطة السكك الحديدية العاملة، وتحويل درجة من محول نحو المشغل. الحفاظ على مجموعة موازية للأرض مع الجانب العامل الطولية فيما يتعلق المرحلة (انظر الشكل 2B). اترك مساحة كافية (10 سم على كلا الجانبين) لنظام محول السكك الحديدية المتصل الآن للتحرك على طول محاور x و y.
   5. تسجيل الدخول إلى برنامج التحكم واختيار الماوس (صغير) الأوعية الدموية. إنشاء دراسة جديدة وكذلك سلسلة جديدة لكل الحيوانات المدرجة في الدراسة. ابحث عن زر الدراسة الجديد الموجود على الجانب الأيسر السفلي من الشاشة على صفحة المستعرض (يبدأ العرض في وضع B).

2. التعامل مع الأسماك

ملاحظة: كان سمك الحمار الوحشي المستخدم في هذه الدراسة من الذكور البالغين البالغين البالغين البالغين البالغين البالغين البالغين البالغين البالغين من العمر 11 شهرًا من سلالة AB/Tuebingen البرية (AB/TU). تم الحفاظ على حمار وحشي في نظام حوض السمك التدفق القائم بذاته من خلال في 28 درجة مئوية في دورة ضوء ثابت تعيين كما 14 ساعة ضوء / 10 ح الظلام. تم تغذية حمار وحشي مرتين يوميا مع الروبيان محلول ملحي(أرتيميا nauplii)ورقائق الطعام الجاف.

1. باستخدام شبكة سمك، نقل الأسماك إلى خزان صغير يحتوي على مياه النظام مع 0.2 ملغ / مل tricaine. انتظر حتى يتم تم تهيأ السمك بالكامل (لا حركة ولا استجابة للمس).
2. باستخدام ملعقة صغيرة بلاستيكية، بلطف وبسرعة نقل الأسماك إلى مربع زجاجي يحتوي على الاسفنج ة في شق المحرز سابقا مع الجانب البطني من الأسماك التي تواجه لأعلى.
   ملاحظة: تأكد من وضع رأس السمكة نحو المشغل (نفس اتجاه درجة المحول) وعلى مستوى أعلى قليلاً مقارنة ببقية الجسم لتحقيق تصور قلب أفضل.
3. خفض بلطف محول (الحفاظ على موقفها الأصلي) باستخدام مقبض على نظام السكك الحديدية، ووضعه طوليا وعلى مقربة من الجانب البطني من الأسماك مع الشق من محول التي تواجه المشغل. ترك 2-3 ملم (لا يزيد عن 1 سم) إزالة من الأسماك. ضبط منصة فيما يتعلق محول باستخدام micromanipulator في جميع المحاور 3 حتى يتم تصور قلب السمك ومن ثم البدء في الحصول على صورة. لا ينبغي تغيير زاوية المحول خلال الحصول على الصورة بأكملها(الشكل 2C).
   ملاحظة: طالما أن هناك ما يكفي من القرب (تصل إلى 1 سم)، فإن الماء على رأس الأسماك سيوفر سطح اتصال عن طريق التوتر السطحي السائل الذي يسمح بنقل موجات الموجات فوق الصوتية بين المسبار والأسماك. لذلك ، ليست هناك حاجة لدفع محول ضد الأسماك. حاول إكمال هذه الخطوة والانتهاء من الفحص في أقل من 3 دقائق لمنع موت الأسماك أو انخفاض معدل ضربات القلب أثناء الحصول على الصورة. إذا لزم الأمر، استخدم جهاز ضبط وقت. يمكن العثور على القلب على الجانب العلوي من الشاشة نحو الجانب الأيسر من العين ، والتي يمكن تصورها بسهولة إذا كان تحريك المحور س على طول الطريق إلى اليمين. إذا كان هناك صعوبة مستمرة في العثور على القلب أثناء وجوده في وضع B، والتحول إلى وضع دوبلر اللون، والتي سوف تسمح لتتبع تدفق الدم (الأحمر يشير إلى تدفق الدم نحو المشغل) وتحديد موقع القلب.

3. الحصول على صورة

ملاحظة: راجع جدول المواد لنظام التصوير وبرامج تحليل الصور.

1. عرض طولي B-وضع
   1. بعد توطين القلب، اختر أو ابق في B-Mode (تم العثور عليه في الجانب الأيسر السفلي من شاشة اللمس بعد بدء سلسلة جديدة) وتقليل الحقل من أجل التكبير وإلقاء نظرة فاحصة على القلب لتسهيل التتبع أثناء التحليل.
   2. من أجل الحصول على رؤية أقرب وأوضح للقلب في اكتساب صورة B-Mode ، قم بتقليل الحقل عن طريق التكبير. استخدم شاشة اللمس لتضييق الحقل يدويًا على كل من المحورين س وص.
   3. إذا لزم الأمر، قم بتحسين جودة/تباين الصورة عن طريق تعيين النطاق الديناميكي إلى 45-50 ديسيبل. انتقل إلى عناصر التحكم في وضع B في خيار المزيد من عناصر التحكم ثم احفظ التغيير إلى إعدادات الوضع المسبقة. اضغط على الإعدادات المسبقة لوضع لتحديد إعداد الحصول على الصور الأمثل في كل مرة قبل البدء في تصوير سلسلة جديدة.
   4. التقاط العديد من الصور كما هو مطلوب في مستوى المحور الطويل عن طريق تحديد حفظ الصورة.
      ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من المعلومات التفصيلية وموارد التدريب على الحصول على الصور في https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
2. عرض طولي موجة نبض
   1. التبديل إلى دوبلر اللون للكشف عن تدفق الدم (حدد زر اللون) واقتناء (وجدت في الجانب الأيسر السفلي من شاشة اللمس بعد أن بدأت سلسلة جديدة).
   2. باستخدام الشاشة التي تعمل باللمس موقف الربع على رأس الصمام الأذيني البطيني وتوطين تدفق، والتي سوف تتميز إشارة اللون الأحمر(الشكل 3A). تقليل مساحة الربع قدر الإمكان لزيادة معدل الإطار.
      ملاحظة: خفض لون نبض التكرار-التردد (لون PRF) (نطاق السرعة) لضمان اللون الأصفر يمكن أن ينظر إليه في التشكيل الجانبي للسرعة من صورة دوبلر اللون. وهذا سيزيد من نطاق السرعات التي يمكن رؤيتها وسيساعد على إنشاء فسيفساء من الألوان التي من شأنها أن تسمح لتصور أكثر وضوحا سرعات الذروة.
   3. تنشيط موجة النبض (حدد PW)وضع دوبلر لأخذ عينة من سرعة تدفق الدم البطيني. ضع بوابة حجم العينة في مركز الصمام الأذيني البطيني (حيث تصبح إشارة اللون الأحمر أكثر صفراء) للكشف عن سرعة التدفق القصوى. ضبط زاوية PW على الشاشة باستخدام أصابعك بحيث تتماشى مع اتجاه تدفق الدم. اضغط على البدء أو التحديث لبدء أخذ عينات من سرعة تدفق الدم إلى البطين.
      ملاحظة: تأكد من أن الخط الصحيح للزاوية يوازي تدفق الدم من أجل توفير نتائج متسقة وقابلة للتكرار. وضع خط الزاوية الصحيح بحيث يطابق اتجاه تدفق الدم سيضمن التقاط السرعات بدقة.
   4. كرر الخطوة 3.2.3 لتحديد سرعة التدفق إلى الخارج عن طريق وضع رباعي اللون دوبلر عند التقاطع بين البطين واللمبة (صمام لمبة) وتوطين التدفق ، والذي سيتم تمييزه بإشارة اللون الأزرق(الشكل 3B). ضع بوابة حجم العينة مباشرة قبل تقاطع البطين واللمبة وضبط خط تصحيح الزاوية لتتناسب مع اتجاه تدفق الدم.
      ملاحظة: كما ذكر من قبل، لتحقيق قيم السرعة الدقيقة، تأكد من محاذاة زاوية PW مع تدفق الدم.
   5. ضبط خط الأساس (شريط)، وخفض أو رفعه في لوحة سرعة التدفق، من أجل الكشف عن وتتبع تماما قمم إشارة(الشكل 3C، D). تحديد قمم التدفق الداخلي في الربع العلوي/الإيجابي (إشارة تتجه نحو المسبار) وقمم التدفق إلى الخارج في الربع السفلي/السالب (إشارة تبتعد عن المسبار).

4- استعادة الأسماك

1. بمجرد اكتمال الحصول على الصورة ، وذلك باستخدام ملعقة صغيرة ، ونقل الأسماك إلى نظام المياه المهواة النظام العادي خالية من tricaine والسماح للأسماك استرداد (عادة ما يستغرق 30 ق إلى 2 دقيقة لاستئناف حركة الخياشيم والسباحة).
2. للمساعدة في الانتعاش، بخ المياه مرارا وتكرارا على الخياشيم باستخدام ماصة نقل لتعزيز تهيئة المياه ونقل الأكسجين.

5- تحليل الصور

1. افتح برنامج تحليل الصور.
2. حدد صورة وانقر على رمز معالجة الصور(الشكل 4). باستخدام المقياس المتاح(الشكل 4)، قم بضبط السطوع والتباين في الصورة للسماح بتصور واضح للجدران البطينية أو نمط تدفق الدم.
3. باستخدام صورة وضع B، افتح القائمة المنسدلة من خيار PSLAX (محور طويل باراستيرنال) على حزمة/قياسات القلب(الشكل 4). حدد تتبع LV وتتبع الجدار الداخلي البطيني عند الانقباض والانبساط للحصول على منطقة البطين (VA) في التصريف (VAs) والانبساط (VAd) ، ونهاية الحجم الانبساطي (EDV) ، ونهاية الحجم الانقباضي (ESV)(الشكل 5A ،B).
   ملاحظة: يتم استقراء قيم وحدة التخزين من تتبع الصور 2D وقد تنحرف عن الكيان ثلاثي الأبعاد. بالنسبة لجميع القياسات، متوسط 3 دورات قلبية تمثيلية على الأقل لكل الحيوان.
4. لاحظ حجم الحد وكسر الإخراج الذي سيتم حسابه وعرضه تلقائيًا بواسطة البرنامج.
   ملاحظة: يمكن أيضًا حساب حجم السكتة الدماغية وكسر الإخراج يدويًا باستخدام الصيغ
   SV = EDV-ESV
   EF = (EDV-ESV)/EDV
   حيث SV هو حجم السكتة الدماغية، EDV هو نهاية حجم الانبساطي، ESV هو نهاية حجم الانقباضي، وEF هو طرد كسر
5. حساب تغيير المساحة الكسرية باستخدام الصيغة
   FAC = (VAd - VAs)/ VAd
   حيث FAC هو تغيير المنطقة الكسرية، VAd هو منطقة البطين في انبساط، وVAs هي منطقة البطين في systole.
6. حساب الناتج القلبي باستخدام الصيغة
   CO = الموارد البشرية x SV
   حيث CO هو الناتج القلبي، والموارد البشرية هو معدل ضربات القلب، وSV هو حجم السكتة الدماغية
7. باستخدام صورة وضع دوبلر موجة نبضية، قياس سرعة تدفق الدم من خلال اختيار الخيار تدفق MV تحت حزمة القلب(الشكل 4). حدد E أو A للانجراف المبكر والانجراف المتأخر ، على التوالي ، وحدد سرعات الذروة على الرسم البياني(الشكل 3C).
8. قياس سرعة تدفق الدم عن طريق اختيار تدفق AoV وتحديد القمم على التتبع(الشكل 3D).
9. قياس معدل ضربات القلب باستخدام منهجيتين مختلفتين لتقييم أكثر موثوقية:
   1. عندما يتم تصور القلب على الشاشة أثناء الحصول على الصورة، عد يدق في غضون 10 ق وتتضاعف في 6.
   2. باستخدام صورة نبض موجة دوبلر على برنامج Vevo LAB ، اختر زر معدل ضربات القلب وفترات التتبع بين 3 قمم تدفق أبهري متتالية(الشكل 4 والشكل 6).
   3. لتصدير البيانات إلى جدول بيانات بعد تتبع LV وقمم تدفق الدم ، انقر على تقرير | تصدير | حفظ كما | التفوق.

النتائج

يسمح البروتوكول الموصوف بقياس الأبعاد القلبية المهمة والمعلمات الوظيفية ، على غرار التقنية المستخدمة في تخطيط صدى القلب البشري والحيواني. تسمح صور B-Mode بتتبع الجدار الداخلي البطيني في الانقباض والانانبساط(الشكل 5)والحصول على بيانات الأبعاد ، مثل أبعاد ا...

Discussion

نحن نصف طريقة منهجية لتصوير صدى القلب وتقييم وظيفة القلب في سمك الحمار الوحشي الكبار. تخطيط صدى القلب هو الأسلوب الوحيد المتاح غير الغازية والأكثر قوة لتصوير القلب الأسماك البالغة الحية والتحليل الوظيفي، وأنها أصبحت شعبية متزايدة في أبحاث القلب والأوعية الدموية حمار وحشي. مقدار الوقت ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double sided tape
Fish net
Glass container - 100 inch high
High frequency transducer	Fujifilm/VisualSonics	MX700	Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm
Plastic teaspoon
Scalpel or scissors
Small fish tanks
Sponge (kitchen sponge)
Transfer pipets (graduated 3 mL)	Samco Scientific	212
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Vevo 3100 Imaging system and imaging station	Fujifilm/VisualSonics
Vevo LAB sofware v 1.7.1	Fujifilm/VisualSonics