Высокочастотная ультразвуковая эхокардиография для оценки сердечной функции зебры

Резюме

Мы описываем протокол для оценки морфологии сердца и функции у взрослых зебры с помощью высокочастотной эхокардиографии. Метод позволяет визуализировать сердце и последующую количественную оценку функциональных параметров, таких как частота сердечных приступов (HR), выход сердца (CO), изменение дробной области (FAC), фракция выброса (EF), а также скорость притока крови и оттока.

Аннотация

Зебрафиш(Danio rerio) стал очень популярным модельным организмом в сердечно-сосудистых исследованиях, включая сердечные заболевания человека, во многом благодаря своей эмбриональной прозрачности, генетической уступчивости и удобствам для быстрых, высокопроизводительных исследований. Однако потеря прозрачности ограничивает анализ функций сердца на взрослой стадии, что усложняет моделирование возрастных заболеваний сердца. Для преодоления таких ограничений, высокочастотная ультразвуковая эхокардиография у зебры становится жизнеспособным вариантом. Здесь мы представляем подробный протокол для оценки сердечной функции у взрослых зебры с помощью неинвазивной эхокардиографии с помощью высокочастотного ультразвука. Метод позволяет визуализировать и анализировать измерение сердца зебры и количественно ежемерскую оценку важных функциональных параметров, включая частоту сердечных приступов, объем инсульта, выход сердца и выброс фракции. В этом методе, рыбы под обезглавлены и хранятся под водой и могут быть восстановлены после процедуры. Хотя высокочастотный ультразвук является дорогостоящей технологией, одиниковую платформу визуализации можно использовать для различных видов (например, мурина и зебры) путем адаптации различных преобразователей. Эхокардиография зебры является надежным методом сердечного фенотипирования, полезным для проверки и характеристики моделей заболеваний, особенно позднего начала заболеваний; экраны наркотиков; и исследования сердечно-сотруднических травм, восстановления и регенеративной способности.

Введение

Зебрафиш(Danio rerio) является устоявшейся позвоночной моделью для изучения процессов развития и заболеваний человека¹. Зебрафиш обладают высоким генетическим сходством с человеком (70%), генетической усваиваемостью, высокой плодовитостью и оптической прозрачностью во время эмбрионального развития, что позволяет прямо проводить визуальный анализ органов и тканей, в том числе сердца. Несмотря на наличие только одного предсердия и одного желудочка, сердце зебры(рисунок 1) физиологически похоже на четырехкамерные сердца млекопитающих. Важно отметить, что частота сердечных приступов зебры, морфология электрокардиограммы и потенциальная форма действия напоминают формы людей больше, чем виды мурин^2. Эти особенности сделали зебрафиш отличной моделью для сердечно-сосудистых исследований и обеспечили основные идеи в сердечное развитие^3,4, регенерация⁵, и патологические условия^1,,3^,4, в том числе атеросклероз, кардиомиопатии, аритмии, врожденные пороки сердца, и амилоидный свет сердечной токсичности^1,43,6. Оценка сердечной функции стала возможной на эмбриональной стадии (1-дневное послеоплодное) путем прямого видеоанализа с использованием высокоскоростной видеомикроскопии^7,,8. Тем не менее, зебрафиш теряют прозрачность за эмбриональной стадии, ограничивая функциональные оценки нормальных зрелых сердец и поздних сердечных заболеваний. Чтобы преодолеть это ограничение, эхокардиография была успешно использована в качестве высокого разрешения, в режиме реального времени, неинвазивные альтернативы изображений для оценки функции сердца зебры взрослых^{9,10,11,12,13,14,15}.

У зебры сердце расположено венцомально в грудной полости сразу же застежки с предсердием, расположенным в дорсе к желудочку. Атриум собирает венозную кровь из синусовой веносики и передает ее в желудочек, где он далее перекачивается в артериоз пулезного(рисунок 1). Здесь мы описываем физиологический, подводный протокол для оценки сердечной функции у взрослых зебры с помощью неинвазивной эхокардиографии с помощью линейного ультразвукового зонда с центральной частотой 50 МГц для Визуализации B-режима с разрешением 30 мкм. Так как ультразвуковые волны могут легко путешествовать через воду, сохраняя близость между рыбой и сканирующий зонд под водой обеспечивает достаточную контактную поверхность для обнаружения сердца без необходимости для ультразвукового геля и в целом менее напряженным для рыбы. Хотя альтернативные системы эхокардиографии зебры были зарегистрированы несколькими авторами^9,12,13, здесь мы представляем общие и наиболее часто используемые установки, которая применяется к высокочастотной ультразвука у животных.

Метод позволяет с высоким разрешением изображения сердца взрослого зебры, отслеживание сердечных структур, а также количественное измерение пиковых скоростей от измерений кровотока доплеров. Мы показываем надежную виво-количественную оценку важных систолических и диастолических параметров, таких как фракция выброса (EF), изменение дробной области (FAC), скорость притока и оттока желудочков, частота сердечных приступов (HR) и сердечный выброс (CO). Мы вносим свой вклад в создание надежного диапазона нормальных здоровых взрослых зебры сердечных функциональных и размерных параметров, чтобы позволить более точное обследование патологических состояний. В целом, мы предоставляем надежный метод для оценки сердечной функции у зебры, которая оказалась чрезвычайно полезной в создании и проверке моделей болезни сердца зебры^6,16, травмы сердца и восстановления^10,13, и регенерации^11,12, и может быть дополнительно использован для оценки потенциальных препаратов.

протокол

Все процедуры, связанные с зебрафишами, были одобрены нашим Институциональным Комитетом по уходу за животными и эксплуатации и соответствуют Закону о защите животных Министерства сельского хозяйства США.

1. Экспериментальная настройка

1. Настройка платформы для приобретения изображений
   1. Используя небольшие ножницы или скальпель сделать разрез на губку в положении 12 часов, чтобы держать рыбу во время сканирования. Поместите губку в стеклянный контейнер(рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Положение разреза должно позволить достаточно места для перемещения преобразователя, а также держать рыбу ниже линии воды, когда платформа наклонена для сканирования (Рисунок 2). Разрез может варьироваться в зависимости от размера рыбы; однако для стандартного размера и веса разрез должен составить примерно 2,5 см х 0,7 см х 0,5 см (длина, ширина и глубина соответственно). Стеклянный контейнер должен быть не менее 6 см глубиной, чтобы избежать утечки воды во время визуализации рыбы.
   2. Прикрепите стеклянную коробку, содержащую губку на ультразвуковой платформе, например, с помощью двусторонней ленты. Убедитесь, что стеклянная коробка находится в центре платформы и прочно прикрепляется(рисунок 2B).
   3. Наклоните платформу вперед около 30 ", используя ручку на левой стороне держателя платформы (Рисунок 2B). Заполните стеклянный квадрат 200-250 мл воды рыбной системы, содержащей 0,2 мг/мл трикатульфона (MS222).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трикаин может быть подготовлен в виде 4 мг/мл бульонного раствора в Tris 40 mM pH 7 и далее разбавлен до нужной концентрации в воде рыбной системы; 0,2 мг/мл было установлено, что лучшая концентрация¹⁶. Раствор из 4 мг/мл трикаина может храниться в течение длительного периода времени при -20 градусах Цельсия или при 4 градусах По области в течение одного месяца.
   4. Вставьте преобразователь в держатель микроманипулятора на работающую железнодорожную станцию, поворачивая выемку преобразователя к оператору. Держите массив параллельно земле с рабочей стороны продольной по отношению к сцене (см. Рисунок 2B). Оставьте достаточно места (10 см с обеих сторон) для теперь подключенной трансдуктер-железнодорожной системы для перемещения по x- и y-axes.
   5. Войти в программное обеспечение управления и выбрать мышь (малый) сосудистые. Создайте новое исследование, а также новую серию для каждого животного, включенного в исследование. Найдите новую кнопку исследования, расположенную в нижней левой части экрана, на странице браузера (представление начинается в B-режиме).

2. Обработка рыбы

ПРИМЕЧАНИЕ: Зебрафиш, используемых в этом исследовании были взрослые, 11-месячные самцы дикого типа штаммab/Tuebingen (AB/TU). Зебрафиш поддерживался в автономной системы протекать через аквариум на 28 градусов по Цельсию в постоянном световом цикле, установленном как 14 h свет/10 ч темно. Зебрафиш кормили два раза в день с рассолом креветки(Artemia nauplii) и сухих пищевых хлопьев.

1. Используя рыбную сеть, перенесите рыбу в небольшой резервуар, содержащий системную воду с 0,2 мг/мл трикаина. Подождите, пока рыба полностью анестезируется (без движения и никакого ответа на ощупь).
2. Используя пластиковую чайную ложку, аккуратно и быстро перенесите рыбу в стеклянную коробку, содержащую губку, в ранее сделанный разрез с брюшной стороной рыбы вверх.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что голова рыбы расположена к оператору (то же направление, как выемка преобразователя) и на несколько более высоком уровне по сравнению с остальной частью тела для достижения лучшей визуализации сердца.
3. Аккуратно опустите преобразователь (сохраняя исходное положение) с помощью ручки на железнодорожной системе, поместив его продольно и близко к брюшной стороне рыбы с выемкой преобразователя, обращенной к оператору. Оставьте 2-3 мм (не более 1 см) клиренс от рыбы. Отрегулируйте платформу в отношении преобразователя с помощью микроманипулятора во всех 3 осях, пока сердце рыбы не будет визуализировано, а затем начать приобретение изображения. Угол преобразователя не должен изменяться в течение всего приобретения изображения(рисунок 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: До тех пор, пока существует достаточная близость (до 1 см), вода в верхней части рыбы обеспечит контактную поверхность через жидкое поверхностное натяжение, что позволяет передавать ультразвуковые волны между зондом и рыбой. Поэтому нет необходимости толкать преобразователя против рыбы. Попробуйте завершить этот шаг и закончить сканирование менее чем за 3 минуты, чтобы предотвратить гибель рыбы или снижение частоты сердечных сокращений во время приобретения изображения. При необходимости используйте таймер. Сердце может быть найдено на верхней стороне экрана к левой стороне глаза, которая может быть легко визуализирована при перемещении x-оси вплоть до правой. Если есть постоянные трудности в поиске сердца в то время как в B-Mode, переключиться на цвет Доплера режиме, который позволит для отслеживания кровотока (красный указывает крови течет к оператору) и размещения сердца.

3. Приобретение изображения

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу Материалов для системы визуализации и программного обеспечения для анализа изображений.

1. Продольное представление B-Mode
   1. После локализации сердца, выберите или остаться в B-Mode (находится в нижней левой стороне сенсорного экрана после начала новой серии) и уменьшить поле для того, чтобы увеличить и присмотреться к сердцу для облегчения отслеживания во время анализа.
   2. Для того, чтобы иметь более четкое и четкое представление о сердце в b-Mode приобретение изображения, уменьшить поле путем увеличения дюйма Используйте сенсорный экран, чтобы вручную сузить поле на обоих x- и y-axes.
   3. При необходимости увеличьте качество/контраст изображения, установив динамический диапазон до 45-50 дБ. Перейдите к элементам управления B-режимом в опции More Controls и затем сохраните изменение в пресетах режима. Нажмите режим пресетов, чтобы выбрать оптимизированную настройку приобретения изображения каждый раз, прежде чем начать изображение новой серии.
   4. Возьмите столько изображений, сколько пожелает в длинной плоскости оси, выбрав Сохранить изображение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию и учебные ресурсы по приобретению изображений можно найти в https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab и https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
2. Продольное представление Импульсная волна
   1. Переключитесь на Color Doppler для обнаружения кровотока (выберите кнопку Color) и приобретения (найден в нижней левой части сенсорного экрана после начала новой серии).
   2. Используя положение сенсорного экрана, квадрант поверх атриовентрикулярного клапана и локализуйте приток, который будет отличаться красным цветовым сигналом(рисунок 3А). Сократите площадь квадранта как можно больше, чтобы увеличить частоту кадров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нижняя цвет импульсно-повторение-частота (Цвет PRF) (диапазон скорости), чтобы обеспечить желтый цвет можно увидеть в профиле скорости изображения Цвет доплера. Это увеличит диапазон скоростей, которые можно увидеть, и поможет создать мозаику цвета, которая позволит более четко визуализировать пиковые скорости.
   3. Активировать импульсную волну (выберите PW) Доплеровский режим для образца скорости притока желудочковой крови. Расположите ворота объема образца в центре атриовентрикулярного клапана (где красный цветной сигнал становится более желтоватым), чтобы определить максимальную скорость потока. Отрегулируйте угол PW на экране с помощью пальцев, чтобы он выравнивался в направлении притока крови. Нажмите начать или обновить, чтобы начать выборку скорости крови, поступающей в желудочек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что угол правильной линии параллельно кровоток для того, чтобы обеспечить последовательные и воспроизводимые результаты. Размещение правильной линии угла, чтобы она соответствовала направлению кровотока, гарантирует точное захват скорости.
   4. Повторите шаг 3.2.3 для определения скорости оттока, разместив квадрант Color Doppler на стыке желудочка и луковицы (буллювентрикулярный клапан) и локализуйте поток, который будет отличаться сигналом синего цвета(рисунок 3B). Расположите ворота объема образца прямо перед соединением желудочка-бульбуса и отрегулируйте линию коррекции угла в соответствии с направлением кровотока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как упоминалось ранее, для достижения точных значений скорости, убедитесь, что угол PW выравнивается с кровотоком.
   5. Отрегулируйте исходную линию (бар), опустив или подняв ее в панели скорости потока, чтобы полностью обнаружить и отследить пики сигнала(рисунок 3C,D). Определите пики притока в верхнем/положительном квадранте (сигнал, идущий к зонду) и пики оттока в нижнем/отрицательном квадранте (сигнал, уходящий от зонда).

4. Восстановление рыбы

1. Как только приобретение изображения завершено, используя чайную ложку, передать рыбу в регулярную систему атерированную воду без трикаина и пусть рыба восстановить (обычно занимает от 30 с до 2 минут, чтобы возобновить движение жаберных и плавание).
2. Чтобы помочь восстановлению, шприц воды неоднократно над жабры с помощью передачи пипетки для содействия аэрации воды и кислорода передачи.

5. Анализ изображений

1. Откройте программное обеспечение для анализа изображений.
2. Выберите изображение и нажмите на значок обработки изображений(рисунок 4). Используя имеющуюся шкалу(рисунок 4),отрегулируйте яркость и контрастность изображения, чтобы обеспечить четкую визуализацию стенок желудочков или шаблонкровного потока.
3. Используя изображение B-режима, откройте выпадающий список из PSLAX (парастернальной длинной оси) вариант на сердечный пакет / измерения (Рисунок 4). Выберите LV след и проследить желудочковой внутренней стенки в систолы и диастолии для получения желудочковой области (VA) в систоле (VAs) и диастоле (VAd), конец диастолического объема (EDV), и конец систолического объема (ESV) (Рисунок 5A, B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значения объема экстраполируются из отслеживания 2D-изображений и могут отклоняться от 3D-сущности. Для всех измерений, в среднем по крайней мере 3 репрезентативных сердечных циклов на одно животное.
4. Обратите внимание на объем хода и фракцию выброса, которые будут автоматически вычисляться и отображаться программным обеспечением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем хода и фракция выброса также могут быть вычисляться вручную с помощью формул
   СВ и EDV-ESV
   ЭФ -З. (EDV-ESV)/EDV
   где SV является объем инсульта, EDV является конец диастолический объем, ESV конец систолического объема, и EF является выброс фракции
5. Рассчитайте изменения дробной области с помощью формулы
   FAC = (VAd - VAs)/ VAd
   где FAC является дробное изменение области, VAd является желудочковой области в диастоле, и VAs является желудочковой области в систоле.
6. Рассчитайте сердечный выход с помощью формулы
   CO и HR x SV
   где CO является сердечный выход, HR частота сердечных приступов, и SV является объем инсульта
7. Используя изображение Pulsed Wave Doppler Mode, измерьте скорость притока крови, выбрав опцию MV Flow под сердечным пакетом (рисунок 4). Выберите E или A для ранней диастолы и поздней диастолы, соответственно, и определите пиковые скорости на графике(рисунок 3C).
8. Измерьте скорость оттока крови, выбрав AoV Flow и определите пики на трассировке(рисунок 3D).
9. Измерьте частоту сердечных приступов с помощью 2 различных методологий для более надежной оценки:
   1. Когда сердце визуализировано на экране во время приобретения изображения, подсчитайте удары в пределах 10 с и умножьте их на 6.
   2. Используя изображение Pulse Wave Doppler на программном обеспечении Vevo LAB, выберите кнопку частоты сердечных приступов и интервалы трассировки между 3 последовательными пиками аортального потока(рисунок 4 и рисунок 6).
   3. Для экспорта данных в электронную таблицу после того, как прослеживается LV и пики кровотока, нажмите на отчет и экспорт и сохранить, как excel.

Результаты

Описанный протокол позволяет измерять важные сердечные мерные и функциональные параметры, аналогичные технике, используемой в эхокардиографии человека и животных. B-Mode изображения позволяют отслеживания желудочковой внутренней стенки в систолы и диастолы

Обсуждение

Мы описываем систематический метод эхокардиографической визуализации и оценки сердечной функции у взрослых зебры. Эхокардиография является единственным доступным неинвазивным и наиболее надежным методом для живой взрослой рыбы сердечной визуализации и функционального анализа, и о...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double sided tape
Fish net
Glass container - 100 inch high
High frequency transducer	Fujifilm/VisualSonics	MX700	Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm
Plastic teaspoon
Scalpel or scissors
Small fish tanks
Sponge (kitchen sponge)
Transfer pipets (graduated 3 mL)	Samco Scientific	212
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Vevo 3100 Imaging system and imaging station	Fujifilm/VisualSonics
Vevo LAB sofware v 1.7.1	Fujifilm/VisualSonics