Ecocardiografía por ultrasonido de alta frecuencia para evaluar la función cardíaca del pez cebra

Resumen

Describimos un protocolo para evaluar la morfología del corazón y la función en el pez cebra adulto utilizando ecocardiografía de alta frecuencia. El método permite la visualización del corazón y la posterior cuantificación de parámetros funcionales, como la frecuencia cardíaca (HR), la salida cardíaca (CO), el cambio de área fraccionaria (FAC), la fracción de eyección (EF) y las velocidades de entrada y salida de la sangre.

Resumen

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un organismo modelo muy popular en la investigación cardiovascular, incluyendo enfermedades cardíacas humanas, en gran parte debido a su transparencia embrionaria, traibilidad genética, y la amenidad a estudios rápidos y de alto rendimiento. Sin embargo, la pérdida de transparencia limita el análisis de la función cardíaca en la etapa adulta, lo que complica el modelado de afecciones cardíacas relacionadas con la edad. Para superar estas limitaciones, la ecocardiografía ecografio de alta frecuencia en el pez cebra está emergiendo como una opción viable. Aquí, presentamos un protocolo detallado para evaluar la función cardíaca en peces cebra adultos mediante ecocardiografía no invasiva mediante ultrasonido de alta frecuencia. El método permite la visualización y análisis de la dimensión cardíaca del pez cebra y la cuantificación de parámetros funcionales importantes, incluyendo la frecuencia cardíaca, el volumen del accidente cerebrovascular, la salida cardíaca y la fracción de eyección. En este método, los peces son anestesiados y mantenidos bajo el agua y pueden ser recuperados después del procedimiento. Aunque el ultrasonido de alta frecuencia es una tecnología costosa, la misma plataforma de imágenes se puede utilizar para diferentes especies (por ejemplo, murino y pez cebra) mediante la adaptación de diferentes transductores. La ecocardiografía de pez cebra es un método robusto para el fenotipado cardíaco, útil en la validación y caracterización de modelos de enfermedades, especialmente enfermedades de aparición tardía; pruebas de drogas; y estudios de lesiones cardíacas, recuperación y capacidad regenerativa.

Introducción

El pez cebra (Danio rerio) es un modelo de vertebrado bien establecido para estudios de procesos de desarrollo y enfermedades humanas¹. Los peces cebra tienen una alta similitud genética con los seres humanos (70%), la traibilidad genética, la alta fecundidad y la transparencia óptica durante el desarrollo embrionario, lo que permite el análisis visual directo de órganos y tejidos, incluido el corazón. A pesar de tener una sola aurícula y un ventrículo, el corazón del pez cebra(Figura 1)es fisiológicamente similar a los corazones de cuatro cámaras de los mamíferos. Es importante destacar que la frecuencia cardíaca del pez cebra, la morfología del electrocardiograma y la forma potencial de acción se asemejan más a las de los humanos más que a las especies de murinos^2. Estas características han hecho del pez cebra un excelente modelo para la investigación cardiovascular y han proporcionado información importante sobre el desarrollo cardíaco^3,4, regeneración⁵, y condiciones patológicas^1,3,4, incluyendo arteriosclerosis, cardiomiopatías, arritmias, enfermedades cardíacas congénitas, y cardiotoxicidad de la cadena de luz amiloide^1,4,6. La evaluación de la función cardíaca ha sido posible durante la etapa embrionaria (1 días después de la fertilización) a través del análisis de vídeo directo utilizando microscopía de vídeo de alta velocidad^7,,8. Sin embargo, el pez cebra pierde su transparencia más allá de la etapa embrionaria, limitando las evaluaciones funcionales de los corazones maduros normales y las condiciones cardíacas de aparición tardía. Para superar esta limitación, la ecocardiografía se ha empleado con éxito como una alternativa de imagen no invasiva, en tiempo real y de alta resolución para evaluar la función cardíaca de pez cebra adulto^{9,10,11,12,13,14,15}.

En el pez cebra, el corazón se encuentra ventralmente en la cavidad torácica inmediatamente posterior a las branquias con la aurícula situada dorsal al ventrículo. La aurícula recoge sangre venosa del venoso sinusal y la transfiere al ventrículo donde se bombea aún más al bulbo arterioso(Figura 1). Aquí, describimos un protocolo fisiológico, submarino, para evaluar la función cardíaca en el pez cebra adulto por ecocardiografía no invasiva utilizando una sonda de ultrasonido de matriz lineal con una frecuencia central de 50 MHz para imágenes en modo B a una resolución de 30 m. Dado que las ondas de ultrasonido pueden viajar fácilmente a través del agua, mantener una proximidad cercana entre el pez y la sonda de exploración bajo el agua proporciona suficiente superficie de contacto para la detección del corazón sin necesidad de gel de ultrasonido y en general es menos estresante para los peces. Aunque varios autores^99,12,,13,aquí presentamos la configuración general y más utilizada que se aplica al ultrasonido de alta frecuencia en animales.

El método permite imágenes de alta resolución del corazón adulto del pez cebra, el rastreo de estructuras cardíacas y la cuantificación de las velocidades máximas de las mediciones del flujo sanguíneo de Doppler. Mostramos una cuantificación in vivo fiable de parámetros sistólicos y diastólicos importantes, como la fracción de eyección (EF), el cambio de área fraccionaria (FAC), las velocidades de entrada y salida de sangre ventricular, la frecuencia cardíaca (HR) y la salida cardíaca (CO). Contribuimos a establecer una gama fiable de parámetros funcionales y dimensionales cardíacos normales de pez cebra adulto sano para permitir una evaluación más precisa de los estados patológicos. En general, proporcionamos un método robusto para evaluar la función cardíaca en el pez cebra, que ha demostrado ser extremadamente útil en el establecimiento y validación de los modelos de enfermedades del corazón del pez cebra^6,16, lesión cardíaca y recuperación^10,13,y regeneración^11,12, y se puede utilizar más para evaluar fármacos potenciales.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con el pez cebra fueron aprobados por nuestro Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y cumplen con la Ley de Bienestar Animal del USDA.

1. Configuración experimental

1. Configuración de la plataforma para la adquisición de imágenes
   1. Usando tijeras pequeñas o un bisturí hacer una incisión en una esponja en la posición de las 12 en punto para sostener el pez durante el escaneo. Coloque la esponja en un recipiente de vidrio(Figura 2A).
      NOTA: La posición de la incisión debe permitir suficiente espacio para mover el transductor y también para mantener a los peces debajo de la línea de agua cuando la plataforma está inclinada para escanear(Figura 2). La incisión puede variar dependiendo del tamaño del pez; sin embargo, para un tamaño y peso estándar, la incisión debe ser de aproximadamente 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (longitud, anchura y profundidad, respectivamente). El recipiente de vidrio debe tener al menos 6 cm de profundidad para evitar fugas de agua mientras se toma imágenes de los peces.
   2. Fije la caja de vidrio que contiene la esponja en la plataforma de ultrasonido, por ejemplo utilizando cinta adhesiva de doble cara. Asegúrese de que la caja de vidrio esté en el centro de la plataforma y firmemente unida(Figura 2B).
   3. Incline la plataforma hacia adelante unos 30o utilizando la perilla en el lado izquierdo del soporte de la plataforma(Figura 2B). Llenar el cuadrado de vidrio con 200-250 ml de agua del sistema de peces que contenga 0,2 mg/ml de metanoconfionato de tricaína (MS222).
      NOTA: La tricaína se puede preparar como una solución de 4 mg/ml en Tris 40 mM pH 7 y diluirse aún más a la concentración deseada en el agua del sistema de peces; 0,2 mg/ml se encontró que es la mejor concentración¹⁶. La solución de 4 mg/ml de tricaína se puede almacenar durante un largo período de tiempo a -20 oC o a 4 oC durante un mes.
   4. Inserte el transductor dentro del soporte del micromanipulador en la estación del tren de trabajo, girando la muesca del transductor hacia el operador. Mantenga la matriz paralela al suelo con el lado de trabajo longitudinal con respecto a la etapa (véase la figura 2B). Deje suficiente espacio (10 cm en ambos lados) para que el sistema de transductor-carril ahora conectado se mueva a lo largo de los ejes X e Y.
   5. Inicie sesión en el software de control y elija Ratón (pequeño) Vascular. Crear un nuevo estudio, así como una nueva serie para cada animal incluido en el estudio. Busque el nuevo botón de estudio situado en la parte inferior izquierda de la pantalla en la página del navegador (la vista comienza en modo B).

2. Manejo del pescado

NOTA: El pez cebra utilizado en este estudio eran machos adultos de 11 meses de edad de la cepa de tipo salvaje AB/Tuebingen (AB/TU). El pez cebra se mantuvo en un sistema de acuario de flujo independiente a 28 oC en un ciclo de luz constante establecido como 14 h de luz/10 h de oscuridad. Los peces cebra se alimentaban dos veces al día con camarones de salmuera (Artemia nauplii) y escamas de alimentos secos.

1. Usando una red de peces, transfiera el pescado a un pequeño tanque que contenga agua del sistema con 0,2 mg/ml de tricaína. Espere hasta que el pez esté completamente anestesiado (sin movimiento y sin respuesta al tacto).
2. Usando una cucharadita de plástico, transfiera suavemente y rápidamente el pescado a la caja de vidrio que contiene la esponja en la incisión previamente hecha con el lado ventral del pez hacia arriba.
   NOTA: Asegúrese de que la cabeza del pez esté colocada hacia el operador (la misma dirección que la muesca del transductor) y a un nivel ligeramente superior en comparación con el resto del cuerpo para lograr una mejor visualización del corazón.
3. Baje suavemente el transductor (manteniendo su posición original) utilizando la manija del sistema de rieles, colocándolo longitudinalmente y cerca del lado ventral del pez con la muesca del transductor frente al operador. Dejar 2-3 mm (no más de 1 cm) de distancia del pescado. Ajuste la plataforma con respecto al transductor utilizando el micromanipulador en los 3 ejes hasta que se visualice el corazón del pez y luego inicie la adquisición de la imagen. El ángulo del transductor no debe cambiarse durante toda la adquisición de la imagen(Figura 2C).
   NOTA: Mientras haya suficiente proximidad (hasta 1 cm), el agua en la parte superior del pez proporcionará una superficie de contacto a través de la tensión superficial líquida que permite la transmisión de las ondas de ultrasonido entre la sonda y el pescado. Por lo tanto, no hay necesidad de empujar el transductor contra los peces. Intente completar este paso y termine el escaneo en menos de 3 minutos para evitar la muerte de peces o una disminución de la frecuencia cardíaca durante la adquisición de la imagen. Si es necesario, utilice un temporizador. El corazón se puede encontrar en la parte superior de la pantalla hacia el lado izquierdo del ojo, que se puede visualizar fácilmente si se mueve el eje X todo el camino hacia la derecha. Si hay dificultad continua para encontrar el corazón mientras está en modo B, cambie al modo Doppler de color, que permitirá rastrear el flujo sanguíneo (el rojo indica que la sangre fluye hacia el operador) y localizar el corazón.

3. Adquisición de imágenes

NOTA: Consulte Tabla de materiales para el sistema de imágenes y el software de análisis de imágenes.

1. Vista longitudinal Modo B
   1. Después de localizar el corazón, seleccione o permanezca en modo B (que se encuentra en la parte inferior izquierda de la pantalla táctil después de haber iniciado una nueva serie) y reduzca el campo con el fin de acercar y echar un vistazo más de cerca al corazón para un seguimiento más fácil durante el análisis.
   2. Para tener una vista más cercana y clara del corazón en la adquisición de imágenes en modo B, reduzca el campo haciendo zoom. Utilice la pantalla táctil para estrechar manualmente el campo en los ejes X e Y.
   3. Si es necesario, mejore la calidad/contraste de la imagen estableciendo el rango dinámico en 45-50 dB. Vaya a los controles de modo B en la opción Más controles y, posteriormente, guarde el cambio en Ajustes preestablecidosde modo . Toque Ajustes preestablecidos de modo para seleccionar la configuración de adquisición de imágenes optimizada cada vez antes de empezar a crear una imagen de una nueva serie.
   4. Tome tantas imágenes como desee en el plano del eje largo seleccionando Guardar imagen.
      NOTA: Puede encontrar información más detallada y recursos de capacitación sobre la adquisición de imágenes en https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab y https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
2. Onda de pulso de vista longitudinal
   1. Cambie a Color Doppler para la detección del flujo sanguíneo (seleccione el botón Color) y la adquisición (que se encuentra en la parte inferior izquierda de la pantalla táctil después de haber iniciado una nueva serie).
   2. Usando la pantalla táctil posicionar el cuadrante en la parte superior de la válvula auriculoventricular y localizar la entrada, que se distinguirá por la señal de color rojo(Figura 3A). Reduzca el área del cuadrante tanto como sea posible para aumentar la velocidad de fotogramas.
      NOTA: Reduzca la frecuencia de repetición de pulsos de color (Color PRF) (rango de velocidad) para garantizar que el color amarillo se pueda ver en el perfil de velocidad de la imagen Color Doppler. Esto aumentará el rango de velocidades que se pueden ver y ayudará a crear un mosaico de color que permitirá visualizar más claramente las velocidades máximas.
   3. Active la onda de pulso (seleccione PW) Modo Doppler para muestrear la velocidad de entrada de sangre ventricular. Coloque la compuerta de volumen de muestra en el centro de la válvula auriculoventricular (donde la señal de color rojo se vuelve más amarillenta) para detectar la velocidad máxima de flujo. Ajuste el ángulo PW en la pantalla con los dedos para que se alinee con la dirección del flujo de sangre. Pulse start o update para comenzar a tomar muestras de la velocidad de la sangre que fluye hacia el ventrículo.
      NOTA: Asegúrese de que la línea correcta del ángulo es paralela al flujo sanguíneo para proporcionar resultados consistentes y reproducibles. Colocar la línea correcta del ángulo para que coincida con la dirección del flujo sanguíneo garantizará que las velocidades se capturen con precisión.
   4. Repita el paso 3.2.3 para determinar la velocidad de salida colocando el cuadrante Color Doppler en la unión entre el ventrículo y el bulbo (válvula bulbuventricular) y localice el flujo, que se distinguirá por una señal de color azul(Figura 3B). Coloque la compuerta de volumen de la muestra justo antes de la unión ventrículo-bulbo y ajuste la línea de corrección del ángulo para que coincida con la dirección del flujo sanguíneo.
      NOTA: Como se mencionó anteriormente, para lograr valores de velocidad precisos, asegúrese de que el ángulo PW esté alineado con el flujo sanguíneo.
   5. Ajustar la línea de base (barra), bajarla o elevarla en el panel de velocidad de flujo, con el fin de detectar y rastrear completamente los picos de la señal(Figura 3C,D). Identifique los picos de entrada en el cuadrante superior/positivo (señal que va hacia la sonda) y los picos de salida en el cuadrante inferior/negativo (señal que se aleja de la sonda).

4. Recuperación de peces

1. Tan pronto como la adquisición de la imagen se haya completado, usando una cucharadita, transfiera el pescado al sistema regular aireado el agua libre de tricaína y deje que los peces se recuperen (generalmente toma de 30 s a 2 minutos para reanudar el movimiento de las branquias y nadar).
2. Para ayudar a la recuperación, chorro de agua repetidamente sobre las branquias utilizando una pipeta de transferencia para promover la aireación del agua y la transferencia de oxígeno.

5. Análisis de imágenes

1. Abra el software de análisis de imágenes.
2. Seleccione una imagen y haga clic en el icono de procesamiento de imágenes(Figura 4). Usando la escala disponible(Figura 4),ajuste el brillo y el contraste de la imagen para permitir una visualización clara de las paredes ventriculares o el patrón de flujo sanguíneo.
3. Con la imagen en modo B, abra la lista desplegable de la opción PSLAX (eje largo parasternal) en el paquete cardíaco/medidas(Figura 4). Seleccione el seguimiento del VI y trace la pared interna ventricular en la sístole y la diástole para obtener el área ventricular (VA) en la sistole (VA) y la diástole (VAd), el volumen diastólico final (EDV) y el volumen sistólico final (ESV)(Figura 5A,B).
   NOTA: Los valores de volumen se extrapolan de los trazados de imágenes 2D y pueden desviarse de la entidad 3D. Para todas las mediciones, promedio de al menos 3 ciclos cardíacos representativos por animal.
4. Tenga en cuenta el volumen de trazo y la fracción de eyección que el software calculará y mostrará automáticamente.
   NOTA: El volumen de trazo y la fracción de eyección también se pueden calcular manualmente utilizando las fórmulas
   SV - EDV-ESV
   EF (EDV-ESV)/EDV
   donde SV es volumen de carrera, EDV es volumen diastólico final, ESV es volumen sistólico final y EF es fracción de eyección
5. Calcular el cambio de área fraccionaria utilizando la fórmula
   FAC = (VAd - VAs)/ VAd
   donde fac es un cambio de área fraccionaria, El VAd es el área ventricular en la diástole, y los VA es el área ventricular en la sístole.
6. Calcular la salida cardiaca utilizando la fórmula
   CO - HR x SV
   donde el CO es la salida cardíaca, el HR es la frecuencia cardíaca y el SV es el volumen del accidente cerebrovascular
7. Usando la imagen del modo Doppler de onda pulsada, mida la velocidad de la sangre de entrada seleccionando la opción MV Flow bajo el paquete cardíaco(Figura 4). Seleccione E o A para la diástole temprana y la diástole tardía, respectivamente, y determine las velocidades máximas en el gráfico(Figura 3C).
8. Mida la velocidad de la sangre del flujo de salida seleccionando Flujo de AoV y determine los picos en el trazado(Figura 3D).
9. Mida la frecuencia cardíaca utilizando 2 metodologías diferentes para una evaluación más confiable:
   1. Cuando el corazón se visualiza en la pantalla durante la adquisición de la imagen, cuente los latidos dentro de 10 s y multiplíquelo por 6.
   2. Usando la imagen pulse Wave Doppler en el software Vevo LAB, elija el botón de frecuencia cardíaca y los intervalos de traza entre 3 picos de flujo aórtico consecutivos(Figura 4 y Figura 6).
   3. Para exportar los datos a una hoja de cálculo después de haber rastreado el LV y los picos del flujo sanguíneo, haga clic en el informe de la exportaciónde la ruta de la hoja de cálculo , y de la entrada a la venta.

Resultados

El protocolo descrito permite la medición de parámetros dimensionales y funcionales cardíacos importantes, análogos a la técnica utilizada en la ecocardiografía humana y animal. Las imágenes en modo B permiten rastrear la pared interna ventricular en la sístole y la diástole(Figura 5) y obtener datos dimensionales, como dimensiones de cámara y pared, y datos funcionales, como la frecuencia cardíaca, el volumen de carrera y la salida cardíaca, así...

Discusión

Describimos un método sistemático para la toma de imágenes ecocardiográficas y la evaluación de la función cardíaca en peces cebra adultos. La ecocardiografía es el único método no invasivo y más robusto disponible para las imágenes cardíacas y el análisis funcional de peces adultos vivos, y se está volviendo cada vez más popular en la investigación cardiovascular del pez cebra. La cantidad de tiempo necesario es corta y permite estudios longitudinales y de alto rendimiento. Sin embargo, hay una variaci?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double sided tape
Fish net
Glass container - 100 inch high
High frequency transducer	Fujifilm/VisualSonics	MX700	Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm
Plastic teaspoon
Scalpel or scissors
Small fish tanks
Sponge (kitchen sponge)
Transfer pipets (graduated 3 mL)	Samco Scientific	212
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Vevo 3100 Imaging system and imaging station	Fujifilm/VisualSonics
Vevo LAB sofware v 1.7.1	Fujifilm/VisualSonics