Échocardiographie à ultrasons à haute fréquence pour évaluer la fonction cardiaque des poissons zèbres

Résumé

Nous décrivons un protocole pour évaluer la morphologie et la fonction de coeur dans le poisson zèbre adulte utilisant l’échocardiographie à haute fréquence. La méthode permet la visualisation du cœur et la quantification ultérieure des paramètres fonctionnels, tels que la fréquence cardiaque (HR), le débit cardiaque (CO), le changement fractionnel de zone (FAC), la fraction éjection (EF), et les vitesses d’affluence et d’écoulement du sang.

Résumé

Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle très populaire dans la recherche cardiovasculaire, y compris les maladies cardiaques humaines, en grande partie en raison de sa transparence embryonnaire, la tractabilité génétique, et les commodités à des études rapides et à haut débit. Cependant, la perte de transparence limite l’analyse de la fonction cardiaque à l’étape adulte, ce qui complique la modélisation des affections cardiaques liées à l’âge. Pour surmonter ces limitations, l’échocardiographie à haute fréquence par ultrasons chez le poisson zèbre apparaît comme une option viable. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour évaluer la fonction cardiaque dans le poisson zèbre adulte par échocardiographie non-invasive utilisant l’ultrason de haute fréquence. La méthode permet la visualisation et l’analyse de la dimension cardiaque du poisson zèbre et la quantification d’importants paramètres fonctionnels, y compris la fréquence cardiaque, le volume des accidents vasculaires cérébraux, la sortie cardiaque et la fraction d’éjection. Dans cette méthode, les poissons sont anesthésiés et gardés sous l’eau et peuvent être récupérés après la procédure. Bien que l’échographie à haute fréquence soit une technologie coûteuse, la même plate-forme d’imagerie peut être utilisée pour différentes espèces (p. ex., poissons murins et zèbres) en adaptant différents transducteurs. L’échocardiographie des poissons zèbres est une méthode robuste pour le phénotypage cardiaque, utile dans la validation et la caractérisation des modèles de maladies, en particulier les maladies tardives; les écrans de drogue; et des études sur les lésions cardiaques, la récupération et la capacité régénératrice.

Introduction

Le poisson zèbre (Danio rerio) est un modèle vertébré bien établi pour les études des processus de développement et des maladies humaines¹. Les poissons zèbres ont une grande similitude génétique avec les humains (70%), la tractabilité génétique, la fécondité élevée et la transparence optique pendant le développement embryonnaire, ce qui permet une analyse visuelle directe des organes et des tissus, y compris le cœur. Bien qu’il n’ait qu’un atrium et un ventricule, le cœur du poisson zèbre(figure 1) est physiologiquement semblable aux cœurs à quatre chambres des mammifères. Fait important, la fréquence cardiaque des poissons zèbres, la morphologie de l’électrocardiogramme, et la forme potentielle d’action ressemblent à ceux des humains plus que les espèces murines². Ces caractéristiques ont fait du poisson zèbre un excellent modèle de recherche cardiovasculaire et ont fourni des aperçus majeurs sur le développement cardiaque^3,4, la régénération⁵, et les conditions pathologiques^1,3,4, y compris l’artériosclérose, cardiomyopathies, arythmies, maladies cardiaques congénitales, et la cardiotoxicité de la chaîne de lumière amyloïde^1,4,6. L’évaluation de la fonction cardiaque a été possible au cours de l’étape embryonnaire (1-jours après la fécondation) grâce à l’analyse vidéo directe à l’aide de la microscopie vidéo haute vitesse^7,8. Cependant, les poissons zèbres perdent leur transparence au-delà du stade embryonnaire, limitant les évaluations fonctionnelles des cœurs matures normaux et des affections cardiaques tardives. Pour surmonter cette limitation, l’échocardiographie a été utilisée avec succès comme une alternative d’imagerie à haute résolution, en temps réel, non invasive pour évaluer la fonction cardiaque des poissons zèbres adultes^{9,10,11,12,13,14,15}.

Chez les poissons zèbres, le cœur est situé ventrally dans la cavité thoracique immédiatement postérieure aux branchies avec l’atrium situé dorsale au ventricule. L’atrium recueille le sang veineux du sinus venosus et le transfère au ventricule où il est ensuite pompé au bulbus artériiosus(figure 1). Ici, nous décrivons un protocole physiologique, sous-marin, pour évaluer la fonction cardiaque chez le poisson zèbre adulte par échocardiographie non invasive à l’aide d’une sonde à ultrasons de tableau linéaire avec une fréquence centrale de 50 MHz pour l’imagerie en mode B à une résolution de 30 m. Étant donné que les ondes ultrasons peuvent facilement se déplacer dans l’eau, le maintien de la proximité entre le poisson et la sonde de balayage sous-marine fournit suffisamment de surface de contact pour la détection cardiaque sans besoin de gel ultrason et est globalement moins stressant pour le poisson. Bien que les systèmes alternatifs d’échocardiographie de poisson zèbre aient été rapportés par plusieurs auteurs^9,12,13, ici nous présentons la configuration générale et la plus couramment utilisée qui s’applique à l’ultrason de haute fréquence chez les animaux.

La méthode permet l’imagerie à haute résolution du cœur adulte du poisson zèbre, le traçage des structures cardiaques, et la quantification des vitesses de pointe des mesures de flux sanguin Doppler. Nous montrons la quantification in vivo fiable des paramètres systoliques et diastoliques importants, tels que la fraction d’éjection (EF), le changement fractionnel de secteur (FAC), l’afflux de sang ventriculaire et les vitesses d’écoulement, la fréquence cardiaque (HR), et la sortie cardiaque (CO). Nous contribuons à établir une gamme fiable de paramètres fonctionnels et dimensionnels adultes en bonne santé du poisson zèbre pour permettre une évaluation plus précise des états pathologiques. Dans l’ensemble, nous fournissons une méthode robuste pour évaluer la fonction cardiaque chez le poisson zèbre, qui s’est avéré extrêmement utile dans l’établissement et la validation des modèles de maladies cardiaques du poisson zèbre^6,16, les dommages cardiaques et la récupération^10,13, et la régénération^11,12, et peut être davantage utilisé pour évaluer les médicaments potentiels.

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Protocole

Toutes les procédures concernant le poisson zèbre ont été approuvées par notre Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux et sont conformes à la Loi sur le bien-être des animaux de l’USDA.

1. Mise en place expérimentale

1. Mise en place de la plate-forme d’acquisition d’images
   1. À l’aide de petits ciseaux ou d’un scalpel, faites une incision sur une éponge à la position de 12 heures pour tenir le poisson pendant la numérisation. Placer l’éponge dans un récipient en verre(figure 2A).
      REMARQUE : La position de l’incision devrait permettre suffisamment d’espace pour déplacer le transducteur et aussi pour garder le poisson souffler la ligne d’eau lorsque la plate-forme est inclinée pour le balayage(figure 2). L’incision peut varier en fonction de la taille du poisson; cependant, pour une taille et un poids standard, l’incision doit être d’environ 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (longueur, largeur et profondeur, respectivement). Le récipient en verre doit être d’au moins 6 cm de profondeur pour éviter les fuites d’eau pendant l’imagerie du poisson.
   2. Apposer la boîte en verre contenant l’éponge sur la plate-forme d’ultrason, par exemple à l’aide de ruban adhésif recto-verso. Assurez-vous que la boîte en verre est au centre de la plate-forme et fermement attachée (figure 2B).
   3. Inclinez la plate-forme vers l’avant vers l’avant à environ 30 degrés à l’aide du bouton sur le côté gauche du support de la plate-forme(figure 2B). Remplissez le carré de verre de 200 à 250 ml d’eau du système de poisson contenant 0,2 mg/mL tricaine méthanesulfonate (MS222).
      REMARQUE : Tricaine peut être préparée comme solution de stock de 4 mg/mL dans Tris 40 mM pH 7 et diluée à la concentration désirée dans l’eau du système de poisson ; 0,2 mg/mL s’est avéré être la meilleure concentration¹⁶. La solution de stock tricaine de 4 mg/mL peut être stockée pendant une longue période à -20 oC ou à 4 oC pendant un mois.
   4. Insérez le transducteur dans le support de micromanipulateur sur la gare en marche, en tournant l’encoche du transducteur vers l’opérateur. Gardez le tableau parallèle au sol avec le côté de travail longitudinal en ce qui concerne la scène (voir figure 2B). Laissez suffisamment d’espace (10 cm des deux côtés) pour que le système transducer-rail maintenant connecté se déplace le long des x- et y-axes.
   5. Connectez-vous au logiciel de contrôle et choisissez Mouse (Small) Vascular. Créez une nouvelle étude ainsi qu’une nouvelle série pour chaque animal inclus dans l’étude. Trouvez le nouveau bouton d’étude situé en bas à gauche de l’écran sur la page du navigateur (la vue commence en mode B).

2. Manipulation du poisson

REMARQUE : Le poisson zèbre utilisé dans cette étude était un mâle adulte de 11 mois de la souche de type sauvage AB/Tuebingen (AB/TU). Les poissons zèbres ont été maintenus dans un système d’aquarium autonome à 28 oC dans un cycle de lumière constant réglé comme 14 h de lumière/10 h sombre. Les poissons zèbres étaient nourris deux fois par jour avec des crevettes saumâtres(Artemia nauplii) et des flocons d’aliments secs.

1. À l’aide d’un filet à poissons, transférer le poisson dans un petit réservoir contenant de l’eau du système avec 0,2 mg/mL tricaine. Attendez que le poisson soit entièrement anesthésié (pas de mouvement et pas de réponse au toucher).
2. À l’aide d’une cuillère à café en plastique, transférer délicatement et rapidement le poisson dans la boîte en verre contenant l’éponge dans l’incision précédemment faite avec le côté ventral du poisson face vers le haut.
   REMARQUE : Assurez-vous que la tête du poisson est positionnée vers l’opérateur (même direction que l’encoche du transducteur) et à un niveau légèrement plus élevé que le reste du corps pour obtenir une meilleure visualisation cardiaque.
3. Abaissez doucement le transducteur (en gardant sa position d’origine) à l’aide de la poignée du système ferroviaire, en le plaçant longitudienment et près du côté ventral du poisson avec l’encoche du transducteur face à l’opérateur. Laisser le dégagement de 2 à 3 mm (pas plus de 1 cm) du poisson. Ajuster la plate-forme en ce qui concerne le transducteur à l’aide du micromanipulateur dans les 3 axes jusqu’à ce que le cœur du poisson soit visualisé, puis commencer l’acquisition d’image. L’angle du transducteur ne doit pas être modifié pendant toute l’acquisition d’image(figure 2C).
   REMARQUE : Tant qu’il y a suffisamment de proximité (jusqu’à 1 cm), l’eau au-dessus du poisson fournira une surface de contact par tension de surface liquide qui permet la transmission des ondes échographiques entre la sonde et le poisson. Par conséquent, il n’est pas nécessaire de pousser le transducteur contre le poisson. Essayez de terminer cette étape et terminer l’analyse en moins de 3 minutes pour prévenir la mort des poissons ou une diminution de la fréquence cardiaque lors de l’acquisition d’une image. Si nécessaire, utilisez une minuterie. Le cœur peut être trouvé sur le côté supérieur de l’écran vers le côté gauche de l’œil, qui peut être facilement visualisé si vous déplacez l’axe x tout le chemin vers la droite. S’il y a difficulté à trouver le cœur en mode B, passez au mode Doppler de couleur, ce qui permettra de suivre le flux sanguin (rouge indique que le sang coule vers l’opérateur) et de localiser le cœur.

3. Acquisition d’images

REMARQUE : Voir tableau des matériaux pour le système d’imagerie et le logiciel d’analyse d’images.

1. Vue longitudinale B-Mode
   1. Après avoir localisé le cœur, sélectionnez ou restez en mode B (trouvé en bas à gauche de l’écran tactile après avoir lancé une nouvelle série) et réduisez le champ afin de zoomer et d’examiner de plus près le cœur pour faciliter le traçage pendant l’analyse.
   2. Afin d’avoir une vue plus étroite et plus claire du cœur dans l’acquisition d’images B-Mode, réduisez le champ en zoomant. Utilisez l’écran tactile pour rétrécir manuellement le champ sur les x- et y-axes.
   3. Si nécessaire, améliorez la qualité/contraste de l’image en définissant la plage dynamique à 45-50 dB. Rendez-vous aux commandes en mode B dans l’option Plus de contrôles et enregistrez par la suite la modification de Mode Presets. Appuyez sur Mode Presets pour sélectionner le paramètre d’acquisition d’image optimisé à chaque fois avant de commencer à imaginer une nouvelle série.
   4. Prenez autant d’images que vous le souhaitez dans le plan à long axe en sélectionnant Save Image.
      REMARQUE : Des informations et des ressources de formation plus détaillées sur l’acquisition d’images peuvent être trouvées à https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab et https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
2. Vague longitudinale de pulse de vue
   1. Passez à Color Doppler pour la détection du flux sanguin (sélect bouton couleur) et l’acquisition (trouvé en bas à gauche de l’écran tactile après avoir lancé une nouvelle série).
   2. À l’aide de l’écran tactile positionner le quadrant au-dessus de la valve atrioventriculaire et de localisé l’afflux, qui se distinguera par le signal de couleur rouge(figure 3A). Réduisez la zone de quadrant autant que possible pour augmenter le taux d’image.
      REMARQUE : Abaissez la fréquence de répétition d’impulsions de couleur (color PRF) (plage de vitesse) pour s’assurer que la couleur jaune peut être vue dans le profil de vitesse de l’image de Color Doppler. Cela augmentera la gamme de vitesses qui peuvent être vus et aidera à créer une mosaïque de couleur qui permettra de visualiser plus clairement les vitesses maximales.
   3. Activer l’onde d’impulsion (sélectionner PW) Mode Doppler pour échantillonner la vitesse d’afflux de sang ventriculaire. Placez la porte de volume de l’échantillon au centre de la valve atrioventriculaire (où le signal de couleur rouge devient plus jaunâtre) pour détecter la vitesse maximale d’écoulement. Ajustez l’angle PW sur l’écran à l’aide de vos doigts afin qu’il s’aligne avec la direction de l’afflux de sang. Appuyez sur le démarrage ou la mise à jour pour commencer à échantillonner la vitesse du sang qui coule dans le ventricule.
      REMARQUE : Assurez-vous que la ligne correcte de l’angle est parallèle au flux sanguin afin de fournir des résultats cohérents et reproductibles. Placer la ligne correcte de l’angle de sorte qu’il correspond à la direction du flux sanguin s’assurera que les vitesses sont saisies avec précision.
   4. Répétez l’étape 3.2.3 pour déterminer la vitesse de sortie en plaçant le quadrant Color Doppler à la jonction entre le ventricule et le bulbus (valve bulbuventriculaire) et localiser le débit, qui se distinguera par un signal de couleur bleue(figure 3B). Placez la porte de volume de l’échantillon juste avant la jonction ventricule-bulbus et ajustez la ligne de correction d’angle pour correspondre à la direction du flux sanguin.
      REMARQUE : Comme mentionné précédemment, pour obtenir des valeurs de vitesse précises, assurez-vous que l’angle DE est aligné avec le flux sanguin.
   5. Ajuster la ligne de base (barre), l’abaisser ou l’élever dans le panneau de vitesse de débit, afin de détecter et de tracer complètement les pics de signal(figure 3C,D). Identifier les pics d’afflux dans le quadrant supérieur/positif (signal allant vers la sonde) et les pics d’écoulement dans le quadrant inférieur/négatif (signal s’éloignant de la sonde).

4. Récupération du poisson

1. Dès que l’acquisition d’image est terminée, à l’aide d’une cuillère à café, transférer le poisson dans l’eau aérée système régulière exempt de tricaine et laisser le poisson récupérer (prend généralement 30 s à 2 min pour reprendre le mouvement branchial et la natation).
2. Pour aider à la récupération, gicler de l’eau à plusieurs reprises sur les branchies à l’aide d’une pipette de transfert pour favoriser l’aération de l’eau et le transfert d’oxygène.

5. Analyse d’image

1. Ouvrez le logiciel d’analyse d’image.
2. Sélectionnez une image et cliquez sur l’icône de traitement d’image(figure 4). À l’aide de l’échelle disponible(figure 4), ajustez la luminosité et le contraste de l’image pour permettre une visualisation claire des parois ventriculaires ou du modèle de flux sanguin.
3. À l’aide de l’image en mode B, ouvrez la liste d’abandon de l’option PSLAX (axe long parasternal) sur le paquet/mesures cardiaques(figure 4). Sélectionnez la trace de LV et tracez le mur intérieur ventriculaire à la systole et au diastole pour obtenir la zone ventriculaire (VA) en systole (VA) et en diastole (VAd), fin du volume diastolique (EDV) et volume systolique fin (ESV)(figure 5A,B).
   REMARQUE : Les valeurs de volume sont extrapolées à partir de tracés d’images 2D et peuvent s’écarter de l’entité 3D. Pour toutes les mesures, en moyenne au moins 3 cycles cardiaques représentatifs par animal.
4. Notez le volume de course et la fraction d’éjection qui seront automatiquement calculés et affichés par le logiciel.
   REMARQUE : Le volume de l’AVC et la fraction d’éjection peuvent également être calculés manuellement à l’aide des formules
   SV ET EDV-ESV
   EF (EDV-ESV)/EDV
   où le SV est le volume de course, EDV est le volume diastolique fin, ESV est le volume systolique fin, et EF est fraction d’éjection
5. Calculer le changement de zone fractionnaire à l’aide de la formule
   AEC (VAd - VAs)/ VAd
   là où l’AEC est un changement de zone fractionnaire, le VAd est une zone ventriculaire dans la diastole, et les VA sont la zone ventriculaire dans la systole.
6. Calculer la sortie cardiaque à l’aide de la formule
   CO et HR x SV
   où le CO est la sortie cardiaque, les RH sont la fréquence cardiaque, et SV est volume d’AVC
7. À l’aide de l’image Pulsed Wave Doppler Mode, mesurez la vitesse du sang d’entrée en sélectionnant l’option MV Flow dans le cadre du paquet cardiaque(figure 4). Sélectionnez E ou A pour la diastole précoce et la diastole tardive, respectivement, et déterminez les vitesses maximales du graphique(figure 3C).
8. Mesurer la vitesse du sang sortant en sélectionnant le flux AoV et déterminer les pics sur le tracé(figure 3D).
9. Mesurer la fréquence cardiaque à l’aide de 2 méthodologies différentes pour une évaluation plus fiable :
   1. Lorsque le cœur est visualisé à l’écran lors de l’acquisition d’une image, comptez les battements dans les 10 s et multipliez-le par 6.
   2. À l’aide de l’image Pulse Wave Doppler sur le logiciel Vevo LAB, choisissez le bouton de fréquence cardiaque et tracez les intervalles entre 3 pics de débit aortique consécutifs(figure 4 et figure 6).
   3. Pour exporter des données vers une feuille de calcul après avoir tracé le LV et les pics de la circulation sanguine, cliquez sur le rapport 'exportation 'save as 'excel.

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Résultats

Le protocole décrit permet de mesurer les paramètres cardiaques dimensionnels et fonctionnels importants, analogues à la technique utilisée dans l’échocardiographie humaine et animale. Les images en mode B permettent de retracer la paroi interne ventriculaire dans la systole et la diastole(figure 5) et d’obtenir des données dimensionnelles, telles que les dimensions de la chambre et des murs, et des données fonctionnelles, telles que la fréquence ...

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Discussion

Nous décrivons une méthode systématique pour l’imagerie échocardiographique et l’évaluation de la fonction cardiaque dans le poisson zèbre adulte. L’échocardiographie est la seule méthode non invasive et la plus robuste disponible pour l’imagerie cardiaque et l’analyse fonctionnelle des poissons adultes vivants, et elle est de plus en plus populaire dans la recherche cardiovasculaire des poissons zèbres. Le temps nécessaire est court et permet des études longitudinales et à haut débit. Cependant, i...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double sided tape
Fish net
Glass container - 100 inch high
High frequency transducer	Fujifilm/VisualSonics	MX700	Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm
Plastic teaspoon
Scalpel or scissors
Small fish tanks
Sponge (kitchen sponge)
Transfer pipets (graduated 3 mL)	Samco Scientific	212
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Vevo 3100 Imaging system and imaging station	Fujifilm/VisualSonics
Vevo LAB sofware v 1.7.1	Fujifilm/VisualSonics