Zebrafish Kardiyak Fonksiyondeğerlendirmek için Yüksek Frekanslı Ultrason Ekokardiyografi

Özet

Erişkin zebra balıklarında yüksek frekanslı ekokardiyografi kullanarak kalp morfolojisini ve işlevini değerlendirmek için bir protokol tanımladık. Bu yöntem kalbin görüntülenmesine ve kalp hızı (HR), kardiyak debi (CO), fraksiyonel alan değişimi (FAC), ejeksiyon fraksiyonu (EF) ve kan giriş ve çıkış hızları gibi fonksiyonel parametrelerin daha sonra ölçülmesine olanak sağlar.

Özet

Zebra balığı(Danio rerio)kardiyovasküler araştırmalarda çok popüler bir model organizma haline gelmiştir, insan kalp hastalıkları da dahil olmak üzere, büyük ölçüde embriyonik şeffaflık nedeniyle, genetik straktör, ve hızlı, yüksek iş yapma çalışmaları için uygunluk. Ancak, şeffaflık kaybı yetişkin aşamasında kalp fonksiyon analizi sınırlar, hangi yaşa bağlı kalp koşullarının modelleme karmaşıklaştırır. Bu tür sınırlamaları aşmak için, zebra balığında yüksek frekanslı ultrason ekokardiyografi uygun bir seçenek olarak ortaya çıkmaktadır. Burada erişkin zebra balıklarında kardiyak fonksiyonu yüksek frekanslı ultrason kullanarak non-invaziv ekokardiyografi ile değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sayılmaktadır. Bu yöntem zebrabalığı kalp boyutunun görüntülenmesi ve analizini ve kalp hızı, inme hacmi, kardiyak çıkış ve ejeksiyon fraksiyonu gibi önemli fonksiyonel parametrelerin ölçülmesine olanak sağlar. Bu yöntemde balıklar anestezi edilir ve su altında tutulur ve işlemden sonra geri kazanılabilir. Yüksek frekanslı ultrason pahalı bir teknoloji olmasına rağmen, aynı görüntüleme platformu farklı türler için kullanılabilir (örneğin, murine ve zebrabalığı) farklı dönüştürücüler adapte ederek. Zebrabalığı ekokardiyografisi, özellikle geç başlangıçlı hastalıklar olmak üzere hastalık modellerinin doğrulanmasında ve karakterizasyonunda yararlı olan kardiyak fenotipleme için sağlam bir yöntemdir; uyuşturucu ekranları; ve kalp hasarı, iyileşme ve rejeneratif kapasite çalışmaları.

Giriş

Zebra balığı(Danio rerio)gelişimsel süreçler ve insan hastalıkları çalışmaları için iyi kurulmuş omurgalı modeli^1. Zebra balıkları insanlara göre yüksek genetik benzerliğe sahiptir (%70), genetik sistemlenebilirlik, yüksek fecundity, ve embriyonik gelişim sırasında optik şeffaflık, hangi organ ve dokuların doğrudan görsel analizi sağlar, kalp de dahil olmak üzere. Sadece bir atriyum ve bir ventrikülolmasına rağmen, zebra balığı kalbi(Şekil 1)fizyolojik olarak memeli dört odalı kalplere benzer. Daha da önemlisi, zebrabalığı kalp hızı, elektrokardiyogram morfolojisi ve eylem potansiyeli şekli insanların daha fazla murine^türleri2 benzer. Bu özellikler zebra balığı kardiyovasküler araştırma için mükemmel bir model yaptık ve kardiyak gelişim içine önemli anlayışlar sağlamıştır^3,4, rejenerasyon⁵, ve patolojik koşullar^1,3,4, arterioskleroz dahil, kardiyomiyopatiler, aritmiler, konjenital kalp hastalıkları, ve amiloid Hafif zincir kardiyotoksisite^1,4,6. Kardiyak fonksiyonun değerlendirilmesi embriyonik evre de (1 gün sonrası döllenme) yüksek hızlı video mikroskopi^7,8kullanarak doğrudan video analizi ile mümkün olmuştur. Ancak, zebra balığı normal olgun kalplerin fonksiyonel değerlendirmelerini ve geç başlangıçlı kalp koşullarını sınırlayarak embriyonik evrenin ötesinde saydamlığını kaybederler. Bu sınırlamayı aşmak için, ekokardiyografi yetişkin zebrabalığı kalp fonksiyonu^,9,10^{,11,12,13,14,15}değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı, noninvaziv görüntüleme alternatifi olarak başarıyla kullanılmıştır.¹⁰

Zebra balığında kalp, ventriküle kadar bulunan atriyum ile solungaçların hemen posterior torasik kavitede ventrally bulunur. Atriyum sinüs venöz venöz venöz venöz venöz kan toplar ve daha bulbus arteriosus pompalanır ventrikül aktarır (Şekil 1). Burada, 30 μm çözünürlükte B-mod görüntüleme için 50 MHz'lik merkez frekansı olan doğrusal dizili ultrason probu kullanılarak erişkin zebrabalıklarında kardiyak fonksiyonu nanvaziv olmayan ekokardiyografi ile değerlendirmek için fizyolojik, sualtı protokolünü tanımlıyoruz. Ultrason dalgaları kolayca su ile seyahat edebilirsiniz bu yana, balık ve tarama sonda su altında arasında yakın tutmak ultrason jel gerek kalmadan kalp tespiti için yeterli temas yüzeyi sağlar ve balık için genel olarak daha az stresli. Alternatif zebra balığı ekokardiyografi sistemleri çeşitli yazarlar tarafından rapor olmasına rağmen^9,12,13, Burada hayvanlarda yüksek frekanslı ultrason için geçerlidir genel ve en sık kullanılan kurulum salıyoruz.

Bu yöntem, yetişkin zebrabalığı kalbinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine, kardiyak yapıların izlenmesine ve Doppler kan akımı ölçümlerinden pik hızların ölçülmesine olanak sağlar. Ejeksiyon fraksiyonu (EF), fraksiyonel alan değişimi (FAC), ventriküler kan giriş ve çıkış hızları, kalp hızı (HR) ve kardiyak debi (CO) gibi önemli sistolik ve diyastolik parametrelerin in vivo nicel olarak güvenilir olarak ölçülmesini göstermekteyiz. Patolojik durumların daha hassas bir şekilde değerlendirilmesine olanak sağlamak için güvenilir bir dizi normal sağlıklı yetişkin zebrabalığı kardiyak fonksiyonel ve boyutsal parametrelerin oluşturulmasına katkıda bulunuyoruz. Genel olarak, zebra balığı kalp fonksiyonlarını değerlendirmek için sağlam bir yöntem saðlamak için sağlam bir yöntem saðlamak, zebrafish kalp hastalığı modelleri kurulması ve doğrulanmasında son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır^6,16, kalp yaralanması ve kurtarma^10,13, ve rejenerasyon 11^,12, ve daha fazla potansiyel ilaçları değerlendirmek için kullanılabilir.¹²

Protokol

Zebra balığı ile ilgili tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve USDA Hayvan Refahı Yasası'na uygun olarak uygulanmaktadır.

1. Deneysel kurulum

1. Görüntü edinimi için platform ayarlama
   1. Küçük makas veya neşter kullanarak tarama sırasında balık tutmak için saat 12 konumunda bir sünger üzerinde bir kesi yapmak. Süngeri cam bir kapta yerleştirin (Şekil 2A).
      NOT: Kesinin konumu transdüseri hareket ettirmek için yeterli alan sağlayacak ve ayrıca platform tarama için eğildiğinde balığın su hattını körüklemesini sağlayacaktır(Şekil 2). Kesi balığın büyüklüğüne bağlı olarak değişebilir; ancak, standart bir boyut ve ağırlık için, kesi yaklaşık 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (uzunluk, genişlik ve derinlik, sırasıyla) olmalıdır. Cam kap balık görüntüleme sırasında su sızıntısı önlemek için en az 6 cm derinliğinde olmalıdır.
   2. Örneğin çift taraflı bant kullanarak ultrason platformunda sünger içeren cam kutuyu yapıştırın. Cam kutunun platformun merkezinde olduğundan ve sıkıca bağlı olduğundan emin olun (Şekil 2B).
   3. Platform tutucunun sol tarafındaki ahzıtçıyı kullanarak platformu yaklaşık 30° öne doğru yatırın(Şekil 2B). Cam kareyi 0.2 mg/mL trikotin metansülfonat (MS222) içeren 200-250 mL balık sistemi suyu ile doldurunuz.
      NOT: Tris 40 mM pH 7'de 4 mg/mL stok çözeltisi olarak triain hazırlanabilir ve balık sistemi suyunda istenilen konsantrasyona seyreltilebilir; 0.2 mg/mL en iyi konsantrasyon¹⁶olarak bulunmuştur. 4 mg/mL trikotin etek çözeltisi -20 °C'de veya 4 °C'de bir ay süreyle uzun süre saklanabilir.
   4. Transdüseri çalışan tren istasyonuna mikromanipülatör tutucunun içine takın ve transdüserin çifeniyi operatöre doğru çevirin. Diziyi, çalışma tarafı ile zemine paralel olarak, sahneye göre uzunlamasına tutun (Bkz. Şekil 2B). X- ve y-eksenleri boyunca hareket etmek için artık bağlı transdüser raylı sistem için yeterli oda (her iki tarafta 10 cm) bırakın.
   5. Kontrol yazılımına giriş yapın ve Fare (Küçük) Vasküler'iseçin. Çalışmaya dahil edilen her hayvan için yeni bir çalışmanın yanı sıra yeni bir seri oluşturun. Tarayıcı sayfasında ekranın sol alt tarafında bulunan yeni çalışma düğmesini bulun (görünüm B modunda başlar).

2. Balık Taşıma

NOT: Bu çalışmada kullanılan zebra balıkları yetişkin, 11 aylık yabani tip ab/Tuebingen (AB/TU) erkektir. Zebra balıkları 28 °C'de tek başına akış lı akvaryum sisteminde 14 saat açık/10 h karanlık olarak ayarlanmış sabit bir ışık döngüsünde muhafaza edildi. Zebra balığı salamura karides(Artemia nauplii)ve kuru gıda gevreği ile günde iki kez beslendi.

1. Balık ağı kullanarak, balığı 0,2 mg/mL tricaine ile sistem suyu içeren küçük bir tanka aktarın. Balık tamamen anestezi (hiçbir hareket ve dokunmaya yanıt) kadar bekleyin.
2. Plastik bir çay kaşığı kullanarak, yavaşça ve hızlı bir şekilde yukarı bakan balık ventral tarafı ile daha önce yapılmış kesi içine sünger içeren cam kutuiçine balık aktarın.
   NOT: Daha iyi kalp görselleştirmesi elde etmek için balığın başının operatöre (transdüserin çentikle aynı yönde) ve vücudun geri kalanına göre biraz daha yüksek bir seviyede konumlandırıldığından emin olun.
3. Raylı sistemdeki sapı kullanarak transdüseri (orijinal konumunu koruyarak) yavaşça düşürün, uzunlamasına yerleştirin ve işleticinin çentikiyle balığın ventral tarafına yakın hale getirin. Balıktan 2-3 mm (en fazla 1 cm) açıklık bırakın. Platform, balık kalbi görselleşene kadar 3 eksendeki mikromanipülatörü kullanarak dönüştürücüye göre ayarlayın ve görüntü edinimi başlatın. Transdüserin açısı tüm görüntü edinimi sırasında değiştirilmemelidir (Şekil 2C).
   NOT: Yeterli yakınlık olduğu sürece (1 cm'ye kadar), balığın üzerindeki su, ultrason dalgalarının sonda ile balık arasında iletilmesini sağlayan sıvı yüzey gerilimi ile temas yüzeyi sağlayacaktır. Bu nedenle transdüseri balıklara doğru itmeye gerek yoktur. Bu adımı tamamlamak ve balık ölümü veya görüntü edinimi sırasında kalp hızının bir azalma önlemek için az 3 dakika içinde tarak bitirmek deneyin. Gerekirse, bir zamanlayıcı kullanın. Kalp, ekranın üst kısmında gözün sol tarafına doğru bulunabilir ve x eksenini sağa doğru hareket ettirili olarak kolayca görüntülenebilir. B modundayken kalbi bulmakta zorluk devam ederse, kan akışının izlenmesine (kırmızı, operatörün doğru akan kan akıtmasını gösterir) ve kalbin yerinin bulunmasına olanak sağlayacak renkli Doppler moduna geçin.

3. Görüntü edinimi

NOT: Görüntüleme sistemi ve görüntü analiz yazılımı için Malzeme Tablosu'na bakınız.

1. Uzunlamasına Görünüm B-Modu
   1. Kalbi lokalize ettikten sonra, B-Modu'nu seçin veya kalın (yeni bir seri başlattıktan sonra dokunmatik ekranın sol alt tarafında bulunan) ve yakınlaştırmak ve analiz sırasında daha kolay izleme için kalbe daha yakından bakmak için alanı küçültün.
   2. B-Mode görüntü ediniminde kalbin daha yakın ve net bir görünümünü elde etmek için, yakınlaştırarak alanı küçültün. Hem x hem de y eksenlerinde alanı el ile daraltmak için dokunmatik ekranı kullanın.
   3. Gerekirse, dinamik aralığı 45-50 dB'ye ayarlayarak görüntünün kalitesini/kontrastını artırın. Daha Fazla Denetim seçeneğindeki B modu denetimlerine gidin ve daha sonra değişikliği Mode Hazır Ayarlar'akaydedin. Yeni bir seri resmine başlamadan önce her seferinde en iyi duruma getirilmiş görüntü edinme ayarını seçmek için Mod Hazır Ayarları'na dokunun.
   4. Görüntü Kaydet'iseçerek uzun eksen düzleminde istediğiniz kadar görüntü alın.
      NOT: Görüntü edinimi ile ilgili daha ayrıntılı bilgi ve eğitim kaynaklarını https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab ve https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
2. Uzunlamasına Görüş Darbe Dalgası
   1. Kan akışı algılama (Renk düğmesini seçin) ve satın alma (yeni bir seri başlattıktan sonra dokunmatik ekranın sol alt tarafında bulunan) için Color Doppler'a geçin.
   2. Dokunmatik ekran kullanarak atriyoventriküler valf üstüne çeyrek konumlandırmak ve kırmızı renk sinyali ile ayırt edilecektir giriş lokalize(Şekil 3A). Kare hızını artırmak için mümkün olduğunca çeyrek alanını azaltın.
      NOT: Renk Doppler görüntüsünün hız profilinde sarı rengin görülebilmesini sağlamak için Renk darbesi tekrarlama frekansını (Color PRF) (hız aralığı) düşürün. Bu görülebilir hızaralığı artacak ve daha net pik hızları görselleştirmek için izin verecek renk bir mozaik oluşturmak için yardımcı olacaktır.
   3. Ventriküler kan giriş hızını örneklemek için nabız dalgasını (seçip PW)Doppler Mode'u etkinleştirin. Maksimum akış hızını algılamak için örnek hacim kapısını atriyoventriküler valfin (kırmızı renk sinyalinin daha sarımsı olduğu yerde) merkezine yerleştirin. Parmaklarınızı kullanarak ekrandaki PW açısını kan girişinin yönüyle aynı hizaya uyacak şekilde ayarlayın. Ventriküle akan kanın hızını örneklemeye başlamak için başlat veya güncelleyin.
      NOT: Tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için açı doğru çizginin kan akışına paralel olduğundan emin olun. Açının doğru çizgiye kan akışının yönüne uygun hale yerleştirilmesi, hızların doğru bir şekilde yakalanmasını sağlayacaktır.
   4. Ventrikül ve bulbus (bülbül valf) arasındaki kavşakta Color Doppler quadrant yerleştirerek çıkış hızını belirlemek için adım 3.2.3 tekrarlayın ve mavi bir renk sinyali ile ayırt edilecektir akışı, lokalize (Şekil 3B). Örnek hacim kapısını ventrikül-bulbus kavşağından hemen önce yerleştirin ve açı düzeltme çizgisini kan akışının yönüyle eşleşecek şekilde ayarlayın.
      NOT: Daha önce de belirtildiği gibi, doğru hız değerleri elde etmek için, PW açısı kan akışı ile hizalanmış olduğundan emin olun.
   5. Sinyal tepelerini tamamen tespit etmek ve izlemek için taban çizgisini (çubuk) ayarlayın, akış hızı panelinde düşürün veya yükseltin(Şekil 3C,D). Üst/pozitif kadranda (sondaya doğru giden sinyal) giriş tepelerini ve alt/negatif çeyreğindeki çıkış tepelerini (probdan uzağa giden sinyal) tanımlayın.

4. Balık kurtarma

1. En kısa sürede görüntü edinimi tamamlandığında, bir çay kaşığı kullanarak, düzenli sistem atlanan su tricaine ücretsiz balık transferi ve balık kurtarmak sağlar (genellikle solungaç hareketi ve yüzme devam etmek için 30 s 2 dk sürer).
2. Kurtarma yardımcı olmak için, su ve oksijen transferi havalandırma teşvik etmek için bir transfer pipet kullanarak solungaçları üzerinde tekrar tekrar su fışkırtmak.

5. Görüntü analizi

1. Görüntü analizi yazılımını açın.
2. Bir resim seçin ve resim işleme simgesine tıklayın (Şekil 4). Mevcut ölçeği(Şekil 4)kullanarak, ventriküler duvarların veya kan akış deseninin net bir şekilde görüntülenmesi için görüntünün parlaklığını ve kontrastını ayarlayın.
3. B modu görüntüsünü kullanarak, kardiyak paket/ölçümlerdeki PSLAX (parasternal uzun eksen) seçeneğinden açılır listeyi açın(Şekil 4). Systole (VAs) ve diastole (VAd), end diyastolik hacim (EDV) ve sonu sistolik hacim (ESV)(Şekil 5A,B)ve son sistolik hacim elde etmek için sistriküler iç duvar izlemek ve sistriküler iç duvar izlemek seçin.
   NOT: Ses değerleri 2B görüntü izlemelerinden tahmin edilir ve 3B varlıktan sapabilir. Tüm ölçümler için, hayvan başına ortalama en az 3 temsili kardiyak döngüleri.
4. Yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanacak ve görüntülenecek kontur hacmine ve çıkarma kısmına dikkat edin.
   NOT: Kontur hacmi ve fırlatma fraksiyonu formüller kullanılarak el ile hesaplanabilir
   SV = EDV-ESV
   EF = (EDV-ESV)/EDV
   SV inme hacmi, EDV son diyastolik hacim, ESV sonu sistolik hacim ve EF ejeksiyon fraksiyonu
5. Formülü kullanarak kesirli alan değişikliğini hesaplama
   FAC = (VAd - VAs)/ VAd
   FAC kesirli alan değişikliği olduğu yerde, VAd diastole ventriküler alan, ve VAs sisstole ventriküler alandır.
6. Formülü kullanarak kardiyak debi hesaplama
   CO = İk x SV
   CO kardiyak debi, HR kalp hızı ve SV inme hacmi
7. Darbeli Dalga Doppler Modu görüntüsünü kullanarak, kardiyak paketin altındaki MV Akış seçeneğini seçerek giriş kan hızını ölçün(Şekil 4). Sırasıyla erken diyastole ve geç diyastole için E veya A'yı seçin ve grafikteki pik hızları belirleyin(Şekil 3C).
8. AoV Akışını seçerek çıkış kan hızını ölçün ve izlemedeki zirveleri belirleyin (Şekil 3D).
9. Daha güvenilir bir değerlendirme için 2 farklı metodoloji kullanarak kalp hızını ölçün:
   1. Görüntü edinimi sırasında kalp ekranda görüntülendiğinde, 10'lu s içindeki atışları sayın ve 6 ile çarp.
   2. Vevo LAB yazılımındaki Pulse Wave Doppler görüntüsünü kullanarak, kalp atış hızı düğmesini ve ardışık 3 aort akış tepe noktası arasındaki izleme aralıklarını seçin(Şekil 4 ve Şekil 6).
   3. LV ve kan akışının zirveleri takip ettikten sonra bir elektronik tabloya veri aktarmak için, rapor | ihracat | olarak kaydedin | exceltıklayın.

Sonuçlar

Açıklanan protokol, insan ve hayvan ekokardiyografisinde kullanılan tekniğe benzer şekilde önemli kardiyak boyutlu ve fonksiyonel parametrelerin ölçülmesine olanak sağlar. B-Mode görüntüleri, ventriküler iç duvarın siston ve diyastole(Şekil 5)olarak izlenmesine ve oda ve duvar boyutları gibi boyutsal verilerin ve kalp hızı, inme hacmi ve kardiyak debi gibi fonksiyonel verilerin yanı sıra kesirli alan değişimi ve ejeksiyon fraksiyonu gi...

Tartışmalar

Erişkin zebra balıklarında ekokardiyografik görüntüleme ve kardiyak fonksiyonun değerlendirilmesi için sistematik bir yöntem tanımladık. Ekokardiyografi canlı erişkin balık kardiyak görüntüleme ve fonksiyonel analiz için mevcut tek non-invaziv ve en sağlam yöntemdir, ve zebrabalığı kardiyovasküler araştırmalarda giderek daha popüler hale gelmektedir. İhtiyaç duyulan süre kısadır ve yüksek iş ve boylamsal çalışmalara olanak sağlar. Ancak, kullanılan metodoloji ve veri analizinde öne...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double sided tape
Fish net
Glass container - 100 inch high
High frequency transducer	Fujifilm/VisualSonics	MX700	Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm
Plastic teaspoon
Scalpel or scissors
Small fish tanks
Sponge (kitchen sponge)
Transfer pipets (graduated 3 mL)	Samco Scientific	212
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Vevo 3100 Imaging system and imaging station	Fujifilm/VisualSonics
Vevo LAB sofware v 1.7.1	Fujifilm/VisualSonics