אולטרסאונד בתדירות גבוהה אקו קרדיוגרפיה כדי להעריך Zebrafish תפקוד הלב

Summary

אנו מתארים פרוטוקול להערכת מורפולוגיה לב ותפקוד של בוגרים בדגים באמצעות אקו בתדר גבוה. השיטה מאפשרת ויזואליזציה של הלב והקוונפיקציה הבאים של פרמטרים פונקציונליים, כגון קצב הלב (HR), פלט לב (CO), שינוי באזור החלקי (FAC), הוצאה לפליטה (EF), וזרימה ומהירויות זרימה.

Abstract

הדגים (danio rerio) הפך לאורגניזם מודל פופולרי מאוד במחקר לב וכלי דם, כולל מחלות לב האדם, בעיקר בשל השקיפות העובריות שלה, מעקב גנטי, ו הנועם כדי מהיר, תפוקה גבוהה לימודים. עם זאת, הפסד של שקיפות מגביל ניתוח תפקודי לב בשלב המבוגר, אשר מסבך את הדוגמנות של מצבי לב הקשורים לגיל. כדי להתגבר על מגבלות כאלה, אולטרסאונד בתדר גבוה האקו בדגים הוא מתגלה כאופציה מעשית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי להעריך את תפקוד הלב ב דג זברה מבוגרים על ידי האקו לא פולשנית באמצעות אולטרסאונד בתדר גבוה. השיטה מאפשרת הדמיה וניתוח של מימד לב הדגים וככמת של פרמטרים פונקציונליים חשובים, כולל קצב הלב, עוצמת שבץ, פלט לב, ושבריר פליטה. בשיטה זו, הדג מורדם ונשמר מתחת למים וניתן לשחזר לאחר ההליך. למרות שאולטרסאונד בתדר גבוה היא טכנולוגיה יקרה, אותה פלטפורמת הדמיה ניתן להשתמש עבור מינים שונים (למשל, מורצין ו zebrafish) על ידי התאמת התמרה שונים. האקו הוא שיטה איתנה עבור פנוטיפים לב, שימושי באימות ואפיון של דגמי מחלות, בעיקר מחלות מאוחרות; מסכי התרופות; ומחקרים של פציעת לב, החלמה ויכולת התחדשות.

Introduction

הדגים (danio rerio) הוא מודל בעלי חוליות מבוסס היטב למחקרים של תהליכים התפתחותיים ומחלות אדם¹. Zebrafish יש דמיון גנטי גבוה לבני אדם (70%), היכולת הגנטית, פוריות גבוהה, ושקיפות אופטית במהלך פיתוח עובריים, אשר מאפשר ניתוח חזותי ישיר של איברים ורקמות, כולל הלב. למרות שיש רק אטריום אחד וחדר השינה אחד, לב דג זברה (איור 1) הוא דומה באופן מבחינה פיזיולוגית לבבות ארבעה הצ. חשוב מכך, קצב פעימות הלב, מורפולוגיה חשמלית וצורה פוטנציאלית לפעולה דומים לאלה של בני האדם יותר מאשר מינים^{מורניים 2}. תכונות אלה הפכו דג זברה מודל מצוין עבור מחקר לב וכלי דם סיפקו תובנות מרכזיות להתפתחות הלב^3,4, התחדשות⁵, התנאים הפתולוגית^1,3,4, כולל טרשת עורקים, cardiomyopathies, הפרעות בקצב הלב, מחלות לב מולדות, ו-עמילואיד שרשרת האור קרדיולוגית^1,4,6. הערכה של תפקוד לב אפשרי במהלך השלב העובריים (1-ימים הפריה פוסט) באמצעות ניתוח וידאו ישירה באמצעות מיקרוסקופ וידאו במהירות גבוהה^7,8. עם זאת, דגים מאבדים את השקיפות שלהם מעבר לשלב העובריים, הגבלת הערכות פונקציונליות של לבבות בוגרים נורמליים ומצבי לב התפרצות מאוחרת. כדי להתגבר על מגבלה זו, אקו קרדיוגרפיה מועסק בהצלחה כמו ברזולוציה גבוהה, בזמן אמת חלופה הדמיה לא פולשנית כדי להעריך את פונקציית הלב הבוגרת דג זברה^{9,10,11,12,13,14,15}.

ב-zebrafish, הלב ממוקם ventrally בחלל החזה מיד אחורי הזימים עם האטריום ממוקם על החדר. האטריום אוספת דם ורידי מתוך venosus הסינוס ומעבירה אותו אל החדר שבו הוא נשאב עוד יותר בולבוס הריוסוס (איור 1). כאן, אנו מתארים פיסיולוגי, מתחת למים, פרוטוקול להערכת תפקוד לב בוגרים דג זברה על-ידי אקו שאינו פולשני באמצעות מערך ליניארי בדיקה אולטרסאונד עם תדר מרכז של 50 MHz עבור הדמיה במצב B ברזולוציה של 30 μm. מאז גלי אולטרסאונד יכול בקלות לנסוע דרך המים, שמירה על קירבה בין הדג ואת בדיקה סריקה מתחת למים מספק מספיק משטח מגע לאיתור לב ללא צורך ג'ל אולטרסאונד והוא הכולל פחות מלחיץ את הדג. למרות שמערכות האקו-לב החלופיות דווחו על-ידי מספר סופרים^9,12,13, כאן אנו מציגים את ההתקנה הכללית והנפוצה ביותר החלה על אולטרסאונד בתדר גבוה בבעלי חיים.

השיטה מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה של לב דג זברה מבוגרים, מעקב אחר מבנים לב, ו כימות של מהירויות שיא מדידות זרימת דם דופלר. אנו מראים אמין בvivo פיקציה של הפרמטרים הסיסטולי החשוב הדיאסטולי, כגון שבריר הפליטה (EF), שינוי באזור החלקי (FAC), תזרים הזרימה החדרית ומהירויות זרימה, קצב הלב (HR), ופלט לב (CO). אנו תורמים להקמת מגוון אמין של רגיל מבוגר בריא הפרמטרים של לב פונקציונלי ומימדי לאפשר הערכה מדויקת יותר של מדינות הפתולוגית. בסך הכל, אנו מספקים שיטה איתנה כדי להעריך את תפקוד הלב ב-דג זברה, אשר הוכיחה שימושי מאוד בהקמת ואימות דג זברה מחלת לב מודלים^6,16, פגיעה בהלב והתאוששות^10,13, ו התחדשות^11,12, וניתן להשתמש בנוסף כדי להעריך תרופות פוטנציאליות.

Protocol

כל ההליכים הכרוכים בדגים אושרו על ידי הוועדה המוסדית שלנו לטיפול בבעלי חיים ובהתאם לחוק הרווחה של משרד החקלאות.

1. הגדרת ניסיוני

1. הגדרת הפלטפורמה לרכישת תמונה
   1. באמצעות מספריים קטנים או אזמל לעשות חתך על ספוג בעמדה 12 השעה להחזיק את הדג במהלך הסריקה. מניחים את הספוג במיכל זכוכית (איור 2א).
      הערה: המיקום של החתך צריך לאפשר מקום מספיק כדי להזיז מתמר וגם לשמור על הדג לשאוג את קו המים כאשר הפלטפורמה מוטה לסריקה (איור 2). החתך יכול להשתנות בהתאם לגודל הדג; עם זאת, עבור גודל ומשקל סטנדרטיים, החתך צריך להיות כ 2.5 ס"מ x 0.7 ס"מ x 0.5 ס"מ (אורך, רוחב, עומק, בהתאמה). מיכל הזכוכית צריך להיות לפחות 6 ס מ עמוק כדי למנוע דליפת מים בעת הדמיה הדג.
   2. לצרף את תיבת הזכוכית המכילה את הספוג על פלטפורמת אולטרסאונד, למשל באמצעות קלטת דו צדדית. ודאו שתיבת הזכוכית נמצאת במרכז הרציף ומחוברת בחוזקה (איור 2ב').
   3. להטות את הפלטפורמה קדימה על 30 ° באמצעות כפתור בצד שמאל של מחזיק הפלטפורמה (איור 2B). ממלאים את ריבוע זכוכית עם 200-250 mL של מים מערכת דגים המכיל 0.2 mg/mL tricaine מתיונין (MS222).
      הערה: Tricaine יכול להיות מוכן כמו 4 mg/mL פתרון המניה ב Tris 40 mM pH 7 ו מדולל עוד לריכוז הרצוי במים מערכת דגים; 0.2 mg/mL נמצא הריכוז הטוב ביותר¹⁶. הפתרון של מלאי mg/mL tricaine יכול להיות מאוחסן לתקופה ארוכה של זמן ב-20 ° c או ב -4 ° c לחודש אחד.
   4. הכנס את המחתמר בתוך מחזיק המיקרומניפולציה בתחנת הרכבת הפועלת, והפנה את חריץ התמר לכיוון המפעיל. שמרו על המערך במקביל לקרקע עם האורך הצדדי הפועל ביחס לשלב (ראו איור 2ב). השאירו מספיק מקום (10 ס מ משני הצדדים) עבור מערכת הרכבת מתמר המחובר כעת לנוע לאורך צירי x ו-y.
   5. היכנס לתוכנת הבקרה ובחר בעכבר (קטן) כלי דם. צור מחקר חדש, כמו גם סדרה חדשה עבור כל חיה הכלולה במחקר. מצא את לחצן המחקר החדש הממוקם בצד השמאלי התחתון של המסך בדף הדפדפן (התצוגה מתחילה ב-מצב B).

2. טיפול בדגים

הערה: Zebrafish השתמשו במחקר זה היו מבוגרים, 11 חודשים בן זכרים של זן סוג פראי AB/Tuebingen (AB/TU). דג zebrafish שמרו במערכת האקווריום של זרימה עצמאית ב -28 ° c במחזור אור קבוע שנקבע כ-14 שעות אור/10 h כהה. Zebrafish ניזונו פעמיים ביום עם שרימפס ממלח (ארטמיה זוחלים) ופתיתי מזון יבש.

1. באמצעות רשת דגים, להעביר את הדג לתוך מיכל קטן המכיל מים מערכת עם 0.2 mg/mL tricaine. המתן עד שהדג מורדם לחלוטין (אין תנועה ואין תגובה למגע).
2. באמצעות כפית פלסטיק, בעדינות ובמהירות להעביר את הדג לתוך תיבת זכוכית המכילה את הספוג לתוך החתך בעבר עשה עם הצד הגחוני של הדג פונה כלפי מעלה.
   הערה: ודא שראשו של הדג מוצב כלפי המפעיל (אותו כיוון של המיתמר) וברמה גבוהה במקצת בהשוואה לשאר חלקי הגוף כדי להשיג הדמיית לב טובה יותר.
3. בעדינות להנמיך את מתמר (שמירה על המיקום המקורי שלו) באמצעות ידית על מערכת המעקה, הצבת אותו longitudinally וקרוב לצד הגחוני של הדג עם חריץ של התמר מול המפעיל. השאירו 2-3 מ"מ (לא יותר מאשר 1 ס מ) אישור מן הדג. כוונן את הפלטפורמה ביחס לתמר באמצעות המיקרומניפולציה בכל 3 הצירים עד שהלב הדג מדמיין ולאחר מכן התחל את רכישת התמונה. אין לשנות את זווית התמר במהלך רכישת התמונה כולה (איור 2ג).
   הערה: כל עוד יש מספיק קירבה (עד 1 ס מ), המים על גבי הדג יספק משטח מגע דרך מתח משטח נוזלי המאפשר שידור של גלי אולטרסאונד בין המקדח לבין הדג. לכן, אין צורך לדחוף את התמר נגד הדג. נסה להשלים שלב זה ולסיים את הסריקה בתוך פחות מ 3 דקות כדי למנוע מוות דגים או ירידה של קצב הלב במהלך רכישת תמונה. במידת הצורך, השתמש בשעון עצר. את הלב ניתן למצוא בצד העליון של המסך לכיוון צד שמאל של העין, אשר ניתן לדמיין בקלות אם הזזת ציר ה-x כל הדרך ימינה. אם יש קושי המשך למצוא את הלב בעוד במצב ב-B, לעבור צבע דופלר מצב, אשר יאפשר לעקוב אחר זרימת הדם (אדום מציין דם זורם לעבר המפעיל) ואיתור הלב.

3. רכישת תמונה

הערה: ראו טבלת חומרים לתוכנה למערכות דימות ולניתוח תמונה.

1. האורך והצג B-מצב
   1. לאחר לוקליזציה של הלב, לבחור או להישאר ב-B-Mode (נמצא בצד השמאלי התחתון של מסך המגע לאחר שיזם סדרה חדשה) ולהקטין את השדה כדי להתקרב ולהסתכל מקרוב על הלב לאיתור קל יותר במהלך הניתוח.
   2. כדי לקבל תצוגה מקרוב וברורה יותר של הלב ברכישת תמונה במצב B, להקטין את השדה על ידי התקרבות. השתמש במסך המגע כדי לצמצם ידנית את השדה בשני צירי ה-x ו-y.
   3. במקרה הצורך, שיפור האיכות/הניגודיות של התמונה על-ידי הגדרת הטווח הדינמי ל-45-50 dB. עבור אל הפקדים במצב B באפשרות ' פקדים נוספים ' ולאחר מכן שמור את השינוי בהגדרות קבועות מראש של מצב. הקש על ' הגדרות מוגדרות מראש של מצב ' כדי לבחור את ההגדרה המוטבת של רכישת תמונות בכל פעם לפני התחלת התמונה של סידרה חדשה.
   4. קח כמה תמונות שתרצה במישור הציר הארוך על-ידי בחירה באפשרות ' שמור תמונה'.
      הערה: ניתן למצוא מידע מפורט יותר ומשאבי הדרכה ברכישת תמונות ב- https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab ו- https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
2. האורך השקפה הדופק גל
   1. מעבר ל דופלר צבע לאיתור זרימת הדם (לבחור צבע לחצן) ורכישה (נמצא בצד השמאלי התחתון של מסך המגע לאחר שיזם סדרה חדשה).
   2. השימוש במסך המגע ממקם את הרביע על גבי שסתום הלוח הפנימי וממקם את הזרימה הנכנס, שתהיה מזוהה על-ידי אות הצבע האדום (איור 3א). הפחת את אזור הרביע ככל האפשר כדי להגדיל את קצב המסגרות.
      הערה: הנמך את צבע הדופק-חזרה-תדר (צבע PRF) (טווח מהירות) כדי להבטיח צבע צהוב ניתן לראות פרופיל מהירות של התמונה דופלר צבע. זה יגדיל את טווח המהירויות שניתן לראות ויסייע ליצור פסיפס של צבע שיאפשר להמחיש באופן ברור יותר את המהירויות שיא.
   3. הפעל את גל הדופק (בחר Pw) במצב דופלר כדי לדגום מהירות זרימה של דם חדרית. הצב את שער נפח המדגם במרכז השסתום הלוח (שבו אות הצבע האדום הופך צהבהב יותר) כדי לזהות את מהירות הזרימה המקסימלית. כוונן את זווית ה-PW על המסך באמצעות אצבעותיך, כך שהוא מיושר עם כיוון הזרימה של הדם. לחץ להתחיל או לעדכן כדי להתחיל לבדוק את המהירות של הדם הזורם לתוך החדר.
      הערה: ודא שהקו הנכון של הזווית מקביל לזרימת הדם כדי לספק תוצאות עקביות ומקבילות. הצבת קו הזווית הנכונה כך שהוא תואם את כיוון זרימת הדם תבטיח כי המהירויות נלכדים במדויק.
   4. חזור על השלב 3.2.3 כדי לקבוע את מהירות יוצאת הדרך על ידי הצבת הרביע דופלר צבע בצומת בין החדר לבין בולבוס (שסתום בורגול) ולהתאים את הזרימה, אשר יהיה מכובד על ידי אות צבע כחול (איור 3ב). הצב את שער נפח הדגימה ממש לפני צומת החדר-בולבוס וכוונן את קו תיקון הזווית כדי להתאים לכיוון זרימת הדם.
      הערה: כפי שהוזכר קודם לכן, כדי להשיג ערכי מהירות מדויקים, ודא שזווית ה-PW מיושרת עם זרימת הדם.
   5. כוונן את קו הבסיס (סרגל), מוריד או מעלה אותו בלוח מהירות הזרימה, כדי לאתר ולעקוב לחלוטין את פסגות האותות (איור 3ג, ד). זהה את הפסגות של הזרימה הנכנסת ברביע העליון/חיובי (האות הולך לכיוון הבדיקה) ואת הפסגות הזרימה ברביע הנמוך/שלילי (האות מתרחק מהמקדח).

4. התאוששות מדגים

1. ברגע הרכישה התמונה הושלמה, באמצעות כפית, להעביר את הדג לתוך מים מערכת רגילה לשימוש חינם של tricaine ולתת את הדג להתאושש (בדרך כלל לוקח 30 s כדי 2 דקות כדי לחדש את התנועה גיל ושחייה).
2. כדי לעזור להחלמה, להשפריץ מים שוב ושוב על הזימים באמצעות פיפטה העברה כדי לקדם את האוורור של המים והעברת החמצן.

5. ניתוח תמונה

1. פתח את תוכנת ניתוח התמונה.
2. בחרו תמונה ולחצו על סמל עיבוד התמונה (איור 4). באמצעות קנה המידה הזמין (איור 4), להתאים את הבהירות ואת הניגודיות של התמונה כדי לאפשר ויזואליזציה ברורה של קירות חדרית או דפוס זרימת הדם.
3. באמצעות התמונה במצב B, פתח את הרשימה הנפתחת מתוך האפשרות PSLAX (ציר ארוך) בחבילת הלב/מדידות (איור 4). לבחור מעקב LV ולעקוב הקיר הפנימי חדרית ב סיסטולה ו דיאמאנס כדי להשיג את האזור החדרית (VA) ב סיסטולה (VAs) ו דיאמד (vad), סוף נפח דיאסטולי (edv), והקצה הסיסטולי האמצעי (esv) (איור 5A, B).
   הערה: ערכי אמצעי האחסון מורכים מעקבות תמונה דו-ממדית ועלולים לסטות מהישות התלת-ממדית. עבור כל המדידות, ממוצע לפחות 3 מחזורי לב מייצגים לכל חיה.
4. שים לב לעוצמת הקו ולשבר הפליטה שיחושבו באופן אוטומטי ויוצג על-ידי התוכנה.
   הערה: ניתן לחשב באופן ידני את עוצמת הקו ושבריר הפליטה באמצעות הנוסחאות
   SV = EDV-ESV
   EF = (EDV-ESV)/EDV
   כאשר SV הוא נפח קו, EDV הוא סוף הנפח דיאסטולי, ESV הוא אמצעי אחסון סיסטולי הקצה, ו-EF הוא שבר הוצאה
5. חישוב שינוי אזור השבר באמצעות הנוסחה
   FAC = (VAd-VAs)/VAd
   כאשר FAC הוא שינוי אזור חלקי, VAd הוא אזור חדרית ב דיאמאנס, ו VAs הוא אזור חדרית ב systole.
6. חישוב תפוקת הלב באמצעות הנוסחה
   CO = HR x-SV
   כאשר CO הוא פלט לב, HR הוא קצב הלב, ו-SV הוא נפח קו
7. באמצעות התמונה במצב הדופלר פעמו גל, למדוד את מהירות הדם הנכנס על ידי בחירת אפשרות הזרמת MV תחת חבילת הלב (איור 4). בחר E או A לקבלת דיאמטוגרפיה מוקדמת ומאוחרת, בהתאמה, וקבע את מהירויות השיא בגרף (איור 3ג).
8. למדוד את מהירות הדם היוצאת על ידי בחירת זרימת Aov ולקבוע את הפסגות על העקיבה (איור 3ד).
9. למדוד את קצב הלב באמצעות 2 מתודולוגיות שונות להערכה אמינה יותר:
   1. כאשר הלב הוא מדמיין על המסך במהלך רכישת תמונה, לספור את פעימות בתוך 10 s ולהכפיל אותו על ידי 6.
   2. באמצעות תמונת דופלר גל הדופק על תוכנת Vevo LAB, בחר את לחצן קצב הלב ומרווחי המעקב בין 3 פסגות זרימת אבי העורקים ברציפות (איור 4 ואיור 6).
   3. כדי לייצא נתונים לגיליון אלקטרוני לאחר שאיתרת את ה-LV ואת הפסגות של זרימת הדם, לחץ על הדוח | ייצוא | שמור בתור | excel.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר מאפשר מדידה של פרמטרים חשובים של לב מימדי ופונקציונלי, מקבילה לטכניקה המשמשת האקו אדם ובעלי חיים. התמונות במצב B לאפשר מעקב של הקיר הפנימי חדרית ב סיסטולה ו דיאמטים (איור 5) וקבלת נתונים ממדיים, כגון מידות קאמרית וקיר, ונתונים פונקציונליים...

Discussion

אנו מתארים שיטה שיטתית לדימות אקו-קרדיוגרפי והערכה של תפקוד לב בדגי מבוגרים. אקוקרדיוגרפיה היא השיטה היחידה שאינה פולשנית ואיתנה ביותר עבור הדמיה למבוגרים בלבד דגים לב וניתוח פונקציונלי, והוא הופך פופולרי יותר ויותר במחקר וכלי דם בדגים דג זברה. כמות הזמן הנדרשת היא קצרה ומאפשר לימודי תפו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double sided tape
Fish net
Glass container - 100 inch high
High frequency transducer	Fujifilm/VisualSonics	MX700	Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm
Plastic teaspoon
Scalpel or scissors
Small fish tanks
Sponge (kitchen sponge)
Transfer pipets (graduated 3 mL)	Samco Scientific	212
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Vevo 3100 Imaging system and imaging station	Fujifilm/VisualSonics
Vevo LAB sofware v 1.7.1	Fujifilm/VisualSonics