ゼブラフィッシュ心臓機能を評価する高周波超音波心エコー検査

要約

高周波心エコーを用いて成体ゼブラフィッシュの心臓形態と機能を評価するプロトコルについて述べている。この方法は、心拍数(HR)、心拍出量(CO)、分画領域変化(FAC)、放出分率(EF)、および血液流入および流出速度などの機能的パラメータの心臓およびその後の定量化を可視化することを可能にする。

要約

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、ヒトの心疾患を含む心血管研究において非常に人気のあるモデル生物となっており、その主な原因は、その胚の透明性、遺伝的な難解性、および迅速で高いスループットの研究へのアメニティに起因する。しかし、透明性の喪失は成人期の心臓機能分析を制限し、年齢に関連する心臓病のモデリングを複雑にする。このような制限を克服するために、ゼブラフィッシュにおける高周波超音波心エコー検査が実行可能な選択肢として浮上している。ここでは、高周波超音波を用いた非侵襲性心エコー検査により成体ゼブラフィッシュの心機能を評価するための詳細なプロトコルを提示する。この方法により、ゼブラフィッシュの心臓次元の可視化と分析、心拍数、脳卒中量、心拍出量、放出分率などの重要な機能パラメータの定量化が可能になります。この方法では、魚は麻酔を受けて水中に保たれ、処置後に回収することができる。高周波超音波は高価な技術ですが、同じイメージングプラットフォームは、異なるトランスデューサを適応させることによって、異なる種(例えば、マウスとゼブラフィッシュ)に使用することができます。ゼブラフィッシュ心エコー検査は、心臓のフェノタイピングのための堅牢な方法です, 疾患モデルの検証と特性評価に有用です, 特に遅発性疾患;薬物スクリーン;心臓の損傷、回復、および再生能力の研究。

概要

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、発達過程とヒト疾患の研究のための確立された脊椎動物モデル^である1.ゼブラフィッシュは、ヒト(70%)と高い遺伝的類似性を有し、遺伝的な難解性、高い胎児性、および胚発生中の光学的透明性を有し、心臓を含む器官および組織の直接的な視覚分析を可能にする。アトリウムと1つの心室を有するだけにもかかわらず、ゼブラフィッシュの心臓(図1)は哺乳類の四張心と生理学的に類似している。重要なのは、ゼブラフィッシュの心拍数、心電図形態、及び作用電位形状は、マウス種²よりもヒトのものに似ている。これらの特徴は、ゼブラフィッシュを心血管研究のための優れたモデルにし、^,心臓発達^3、4、4再生^5、および動脈硬化症、心筋症^、不整脈、先天性心疾患、アミロイド軽鎖心毒性1、4、6を⁶含む病理学^{的状態31,41、3、4}に関する主要な洞察^を提供してきた。⁴高速ビデオ顕微鏡^7,8を用いた直接ビデオ分析を通じて、胚期(受精後1日間)の間^に8心機能の評価が可能であった。しかし、ゼブラフィッシュは胚性期を超えて透明性を失い、正常な成熟した心臓および遅発性心状態の機能的評価を制限する。この制限を克服するために、心エコー検査は、成体ゼブラフィッシュ心拍^,機能^,,,99、10、11、12、13、14、15^,15を評価する高解像度、リアルタイム、非侵襲的イメージング代替手段としてうまく採用されている^,10。^11121314

ゼブラフィッシュでは、心臓は心室に後ろ側に位置するアトリウムを持つエラの直ちに後部の胸腔に腹腔に位置する。心房は静脈内の血液を静脈内静脈から採取し、心室に移し、そこでさらに球根動脈に送り込まれる(図1)。ここでは、30μmの解像度でBモードイメージングのための50MHzの中心周波数を有する線形アレイ超音波プローブを用いた非侵襲的心エコー検査により、成人ゼブラフィッシュの心機能を評価する生理学的、水中のプロトコルについて述べた。超音波は簡単に水を通過することができるので、魚と水中の走査プローブの間に近接保つことは、超音波ゲルを必要としない心臓検出のための十分な接触面を提供し、全体的に魚にとってストレスが少ない。代替ゼブラフィッシュ心エコーシステムは、いくつかの著者によって報告されました^99,12,,13,ここでは、動物の高周波超音波に適用される一般的かつ最も一般的に使用されるセットアップを提示します.

この方法により、成体ゼブラフィッシュ心臓の高解像度イメージング、心臓構造のトレース、ドップラー血流測定からのピーク速度の定量が可能になります。我々は、駆出率(EF)、分面積変化(FAC)、心室血流および流出速度、心拍数(HR)、心拍出量(CO)などの重要な収縮期および拡張期のパラメータを生体内で確実に定量化することを示す。病理状態をより正確に評価できるように、正常な健康な成体ゼブラフィッシュ心臓機能および次元パラメータの信頼できる範囲の確立に貢献する。全体として、ゼブラフィッシュの心機能を評価するための堅牢な方法を提供し、ゼブラフィッシュ心疾患モデル^66、16、16心臓損傷および回復^10、13、および再生^11、12の確立および検証に¹¹非常に有用であることが証明されており^、12潜在的な薬物を評価するためにさらに使用することができる。¹³

プロトコル

ゼブラフィッシュに関するすべての手続きは、当社の制度的動物管理および使用委員会によって承認され、USDA動物福祉法に準拠しています。

1. 実験的なセットアップ

1. 画像取得用プラットフォームの設定
   1. 小さいはさみやメスを使用すると、スキャン中に魚を保持するために12時の位置でスポンジの切開を行います。スポンジをガラス容器に入れます(図2A)。
      注:切開の位置は、トランスデューサを移動するのに十分なスペースを可能にし、また、プラットフォームがスキャンのために傾いているときに魚が水線をふさぐ保つようにする必要があります(図2)。切開は魚の大きさによって異なる場合があります。ただし、標準のサイズと重量の場合、切開は約 2.5 cm x 0.7 cm x 0.5 cm (それぞれ長さ、幅、深さ) にする必要があります。ガラス容器は、魚を撮影しながら水漏れを避けるために、少なくとも6センチの深さでなければなりません。
   2. 例えば両面テープを使用して、超音波プラットフォーム上のスポンジを含むガラスボックスを貼付します。ガラスボックスがプラットフォームの中央にあり、しっかりと取り付けられていることを確認します(図2B)。
   3. プラットフォームホルダーの左側にあるノブを使用して、プラットフォームを約30°前方に傾けます(図2B)。0.2 mg/mL トリカインメタンスルホン酸(MS222)を含む魚系水の200〜250 mLでガラスの正方形を充填します。
      注:トリケーヌは、Tris 40 mM pH 7の4mg / mLストック溶液として調製し、さらに魚のシステム水の所望の濃度に希釈することができます。0.2 mg/mL は、最高濃度¹⁶であることが判明しました。4 mg/mL トリケーヌストック溶液は、-20°Cまたは4°Cで1ヶ月間長期間保存することができます。
   4. 作業用レールのマイクロマニピュレータホルダー内にトランスデューサを挿入し、トランスデューサのノッチをオペレータに向けます。ステージに対して作業側の縦方向で、アレイを地面に平行に保ちます(図 2Bを参照)。X軸とy軸に沿って移動するために、現在接続されているトランスデューサレールシステムのための十分なスペース(両側に10 cm)を残します。
   5. コントロールソフトウェアにログインし、マウス(小)血管を選択します。新しいスタディと、研究に含まれる各動物の新しいシリーズを作成します。ブラウザページの画面の左下にある新しいスタディボタンを見つけます(ビューはBモードで開始されます)。

2. 魚の取り扱い

注:この研究で使用されたゼブラフィッシュは、野生型株AB / Tuebingen(AB / TU)の成人、11ヶ月の男性でした。ゼブラフィッシュは、14時間光/10時間暗く設定された一定の光サイクルで28°Cの独立型フロースルー水槽システムに維持された。ゼブラフィッシュは、ブラインエビ(アルテミア・ナウプリ)とドライフードフレークで1日2回飼育されました。

1. 魚網を使用して、0.2 mg /mLトリカインでシステム水を含む小さなタンクに魚を移します。魚が完全に麻酔されるまで待ちます(動きがなく、タッチに反応しません)。
2. プラスチックティースプーンを使用して、スポンジを含むガラス箱に魚を優しく素早く移し、以前に作られた切開部に魚の腹側を上に向けます。
   注:魚の頭部がオペレータ(トランスデューサのノッチと同じ方向)に向かって、より良い心臓の視覚化を達成するために体の残りの部分と比較してわずかに高いレベルに配置されていることを確認してください。
3. レールシステムのハンドルを使用してトランスデューサを穏やかに下げ(元の位置を保つ)、オペレータに向いたトランスデューサのノッチで魚の腹側に近づけます。魚から2〜3mm(1cm以下)のクリアランスを残します。魚の心臓が視覚化されるまで、すべての3軸のマイクロマニピュレータを使用してトランスデューサに対してプラットフォームを調整し、画像の取得を開始します。画像取得中にトランスデューサの角度を変更しないでください (図 2C)。
   注:十分な近接性(最大1cm)がある限り、魚の上の水は、プローブと魚の間の超音波の伝達を可能にする液体表面張力を介して接触面を提供します。したがって、トランスデューサを魚に押し付ける必要はありません。このステップを完了し、画像取得中に魚の死や心拍数の低下を防ぐために3分未満でスキャンを完了してみてください。必要に応じて、タイマーを使用します。心臓は、画面の上側から眼の左側に向かって見つけることができ、X軸を右に動かすと簡単に視覚化できます。Bモードで心臓を見つけるのに継続的な困難がある場合は、血流を追跡し(赤はオペレータに向かって流れる血液を示す)、心臓を見つけることを可能にする色ドップラーモードに切り替えます。

3. 画像の取得

注: イメージング システムおよびイメージ解析ソフトウェアの資料表を参照してください。

1. 縦方向ビュー B モード
   1. 心臓をローカライズした後、Bモード(新しいシリーズを開始した後、タッチスクリーンの左下に見られる)を選択または滞在し、ズームインし、分析中に簡単にトレースするために心臓を詳しく見るためにフィールドを減らします。
   2. Bモード画像取得で心臓をより明確に見るために、ズームインして視野を縮小します。タッチスクリーンを使用して、x 軸と y 軸の両方で手動でフィールドを絞り込みます。
   3. 必要に応じて、ダイナミックレンジを45~50dBに設定して、画像の品質/コントラストを高めます。[その他のコントロール] オプションの B モード コントロールに移動し、その後変更をモード プリセットに保存します。[モードプリセット]をタップすると、新しいシリーズをイメージする前に、毎回最適化された画像取得設定を選択できます。
   4. [イメージを保存]を選択して、長軸平面に必要な数の画像を撮影します。
      注: 画像取得に関する詳細な情報とトレーニングリソースについては、https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-labおよびhttps://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
2. 縦方向ビューパルス波
   1. 血流検出用のカラードップラー(カラーボタンを選択)と取得(新しいシリーズを開始した後、タッチスクリーンの左下にある)に切り替えます。
   2. タッチスクリーンを使用して、房領域を房室弁の上に配置し、赤色信号によって区別される流入を局地化する(図3A)。フレームレートを上げるには、可能な限り四分の一領域を小さくします。
      注: カラードップラー画像の速度プロファイルに黄色の色が表示されるように、カラーパルス繰り返し周波数(Color PRF)(速度範囲)を下げます。これにより、見ることができる速度の範囲が増加し、ピーク速度をより明確に視覚化できる色のモザイクを作成するのに役立ちます。
   3. 脈波を有効にする(PWを選択) ドップラー モードをサンプル心室血流速度に.サンプルの容積ゲートを房室弁の中心(赤い色の信号がより黄色くなる場所)に置き、最大流速を検出します。指で PW の角度を調整し、血流の方向に合うようにします。開始または更新を押して、心室に流れ込む血液の速度のサンプリングを開始します。
      注: 一貫した再現性のある結果を得るために、角度正しい線が血流に平行であることを確認してください。血流の方向に合うように角度を正しい線に配置することで、速度が正確に捉えられるようにします。
   4. ステップ 3.2.3 を繰り返して、色ドップラー象限を心室と球根(球根弁)の接合部に配置して流出速度を決定し、青色の信号で区別される流れを局地化します(図3B)。サンプルの体積ゲートを心室球根接合の直前に配置し、血流の方向に合わせて角度補正線を調整します。
      注: 前述のように、正確な速度値を得るために、PW の角度が血流に合っていることを確認してください。
   5. 信号のピークを完全に検出してトレースするために、ベースライン(バー)を調整し、流速パネルで低くしたり上げたりします(図3C,D)。上部/正の象限の流入ピーク(プローブに向かう信号)と下/負の象限(プローブから離れる信号)の流出ピークを特定します。

4. 魚の回復

1. 画像取得が完了するとすぐに、ティースプーンを使用して、トリケーヌのない通常のシステム通気水に魚を転送し、魚を回復させます(通常、ギルの動きと水泳を再開するために30〜2分かかります)。
2. 回復を助けるために、水と酸素移動の通過を促進するために移管ピペットを使用してエラの上に繰り返し水を噴出。

5. 画像解析

1. 画像解析ソフトウェアを開きます。
2. 画像を選択し、画像処理アイコン(図4)をクリックします。利用可能なスケール(図4)を使用して、画像の明るさとコントラストを調整して、心室壁または血流パターンを明確に視覚化できるようにします。
3. Bモードイメージを使用して、心臓パッケージ/測定のPSLAX(パラスターン長軸)オプションからドロップダウンリストを開きます(図4)。LVトレースを選択し、収縮期および拡張期の心室内壁を追跡して、収縮期(VA)および拡張期(VAd)、拡張期末容積(EDV)、およびエンドシストリック体積(ESV)で心室領域(VA)を得る(図5A,B)。
   注: ボリューム値は 2D イメージ トレースから外挿され、3D エンティティから逸脱する可能性があります。すべての測定について、動物1匹につき少なくとも3つの代表的な心周期を平均する。
4. ソフトウェアによって自動的に計算および表示されるストロークボリュームと射出率に注意してください。
   注:ストロークの体積、および射出率も、数式を使用して手動で計算することができます
   SV = EDV-ESV
   EF = (EDV-ESV)/EDV
   SVはストロークボリューム、EDVは末端拡張期ボリューム、ESVはエンドシストリックボリューム、EFは射出率です
5. 数式を使用して小数部領域の変更を計算する
   FAC = (VAd - VA)/ VAd
   FACは分数面積変化、VAdはダイストールの心室領域、VAは収縮期の心室領域である。
6. 式を使用して心拍出量を計算する
   CO = HR x SV
   COは心拍出量、HRは心拍数、SVはストロークボリューム
7. パルス波ドップラーモード画像を使用して、心臓パッケージの下にあるMVフローオプションを選択して流入血液速度を測定する(図4)。初期のダイストールと後期のダイストールに対してEまたはAをそれぞれ選択し、グラフ上のピーク速度を決定する(図3C)。
8. AoVフローを選択して流出血液速度を測定し、トレースのピークを決定する(図3D)。
9. より信頼性の高い評価のために2つの異なる方法論を使用して心拍数を測定します。
   1. 画像取得中に心臓が画面上に可視化されたら、10s以内の拍動を数え、6を掛けます。
   2. Vevo LABソフトウェアのパルス波ドップラー画像を使用して、3連続大動脈フローピーク間の心拍数ボタンとトレース間隔を選択します(図4および図6)。
   3. LVと血流のピークをトレースした後、スプレッドシートにデータをエクスポートするには、レポート | エクスポート| | excel として保存をクリックします。

結果

記載されたプロトコルは、ヒトおよび動物の心エコー検査に用いられる技術に類似した、重要な心次元および機能的パラメータの測定を可能にする。Bモード画像は、収縮期および拡張期(図5)における心室内壁の追跡およびチャンバーおよび壁寸法などの次元データの取得、心拍数、脳卒中量、心拍出量などの機能データ、ならびに心室収縮率な...

ディスカッション

我々は、成体ゼブラフィッシュにおける心エコー画像と心機能評価の体系的な方法を説明する。心エコー検査は、生きた成魚の心臓イメージングおよび機能分析のための唯一の非侵襲的かつ最も堅牢な方法であり、ゼブラフィッシュ心血管研究でますます人気が高まっています。必要な時間は短く、ハイスループットと縦方向の研究が可能です。しかし、採用された方法論とデータ分析には?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double sided tape
Fish net
Glass container - 100 inch high
High frequency transducer	Fujifilm/VisualSonics	MX700	Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm
Plastic teaspoon
Scalpel or scissors
Small fish tanks
Sponge (kitchen sponge)
Transfer pipets (graduated 3 mL)	Samco Scientific	212
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Vevo 3100 Imaging system and imaging station	Fujifilm/VisualSonics
Vevo LAB sofware v 1.7.1	Fujifilm/VisualSonics