Ecocardia ad ultrasuoni ad alta frequenza per valutare la funzione cardiaca del pesce zebra

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per valutare la morfologia cardiaca e la funzione nel pesce zebra adulto utilizzando l'ecocardiografia ad alta frequenza. Il metodo consente la visualizzazione del cuore e la successiva quantificazione dei parametri funzionali, come la frequenza cardiaca (HR), l'uscita cardiaca (CO), il cambiamento dell'area frazionaria (FAC), la frazione di espulsione (EF) e la velocità di afflusso e deflusso del sangue.

Abstract

Il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un organismo modello molto popolare nella ricerca cardiovascolare, comprese le malattie cardiache umane, in gran parte a causa della sua trasparenza embrionale, della trattatibilità genetica e dell'amenità a studi rapidi e ad alto potenziale di sviluppo. Tuttavia, la perdita di trasparenza limita l'analisi della funzione cardiaca nella fase adulta, il che complica la modellazione delle condizioni cardiache legate all'età. Per superare tali limitazioni, l'ecocardiografia ad ultrasuoni ad alta frequenza nel pesce zebra sta emergendo come opzione praticabile. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per valutare la funzione cardiaca nel pesce zebra adulto mediante ecocardiografia non invasiva utilizzando ultrasuoni ad alta frequenza. Il metodo consente la visualizzazione e l'analisi della dimensione cardiaca del pesce zebra e la quantificazione di importanti parametri funzionali, tra cui la frequenza cardiaca, il volume dell'ictus, l'uscita cardiaca e la frazione di espulsione. In questo metodo, i pesci sono anestesizzati e tenuti sott'acqua e possono essere recuperati dopo la procedura. Sebbene gli ultrasuoni ad alta frequenza siano una tecnologia costosa, la stessa piattaforma di imaging può essere utilizzata per diverse specie (ad esempio, murine e pesci zebra) adattando diversi trasduttori. L'ecocardiografia del pesce zebra è un metodo robusto per la fenotipizzazione cardiaca, utile nella convalida e caratterizzazione dei modelli di malattia, in particolare le malattie ad esordio tardivo; schermi di droga; e studi di lesioni cardiache, recupero e capacità rigenerativa.

Introduzione

Il pesce zebra (Danio rerio) è un modello di vertebrato ben consolidato per gli studi sui processi di sviluppo e sulle malattie umane¹. I pesci zebra hanno un'elevata somiglianza genetica con l'uomo (70%), la trattatibilità genetica, l'elevata fecondità e la trasparenza ottica durante lo sviluppo embrionale, che consente l'analisi visiva diretta di organi e tessuti, compreso il cuore. Pur avendo un solo atrio e un ventricolo, il cuore di pesce zebra (Figura 1) è fisiologicamente simile ai cuori a quattro camere di mammiferi. È importante sottolineare che la frequenza cardiaca del pesce zebra, la morfologia dell'elettrocardiogramma e la forma potenziale di azione assomigliano a quelle degli esseri umani più delle specie murine². Queste caratteristiche hanno reso il pesce zebra un ottimo modello per la ricerca cardiovascolare e hanno fornito importanti approfondimenti sullo sviluppo cardiaco^3,4, rigenerazione⁵, e le condizioni patologiche^1,3,4, tra cui arteriosclerosi, cardiomiopatie, aritmie, malattie cardiache congenite, e amiloide luce catena cardiotossicità^1,4,6. La valutazione della funzione cardiaca è stata possibile durante lo stadio embrionale (1 giorno dopo la fecondazione) attraverso l'analisi video diretta utilizzando la microscopia video ad alta velocità^7,8. Tuttavia, i pesci zebra perdono la loro trasparenza oltre lo stadio embrionale, limitando le valutazioni funzionali dei normali cuori maturi e delle condizioni cardiache a esordio tardivo. Per superare questa limitazione, l'ecocardiografia è stata impiegata con successo come un'alternativa ad alta risoluzione, in tempo reale e non invasiva per valutare la funzione cardiaca del pesce zebra adulto^{9,10,11,12,13,14,15}.

Nel pesce zebra, il cuore si trova ventralmente nella cavità toracica immediatamente posteriore alle branchie con l'atrio situato dorsale al ventricolo. L'atrio raccoglie sangue venoso dal venoso sinusae e lo trasferisce al ventricolo dove viene ulteriormente pompato al bulbus arteriosus (Figura 1). Qui, descriviamo un protocollo fisiologico, sott'acqua, per valutare la funzione cardiaca nel pesce zebra adulto mediante ecocardiografia non invasiva utilizzando una sonda a ultrasuoni a matrice lineare con una frequenza centrale di 50 MHz per l'imaging in modalità B con una risoluzione di 30 m. Poiché le onde a ultrasuoni possono facilmente viaggiare attraverso l'acqua, mantenendo la vicinanza tra il pesce e la sonda di scansione sott'acqua fornisce una superficie di contatto sufficiente per il rilevamento del cuore senza bisogno di gel ad ultrasuoni ed è nel complesso meno stressante per il pesce. Anche se i sistemi di ecocardiografia alternativa del pesce zebra sono stati segnalati da diversi autori^9,12,13, qui presentiamo l'impostazione generale e più comunemente usata che si applica agli ultrasuoni ad alta frequenza negli animali.

Il metodo consente l'imaging ad alta risoluzione del cuore adulto di pesce zebra, tracciando le strutture cardiache e la quantificazione delle velocità di picco dalle misurazioni del flusso sanguigno di Doppler. Mostriamo una quantificazione affidabile in vivo di importanti parametri sistolici e diastolici, come la frazione di espulsione (EF), il cambiamento dell'area frazionaria (FAC), l'afflusso di sangue ventricolare e le velocità di deflusso, la frequenza cardiaca (HR) e l'uscita cardiaca (CO). Contribuiamo a stabilire una gamma affidabile di normali parametri funzionali e dimensionali cardiaci di pesce zebra adulto sani per consentire una valutazione più precisa degli stati patologici. Nel complesso, forniamo un metodo robusto per valutare la funzione cardiaca nel pesce zebra, che si è dimostrato estremamente utile per stabilire e convalidare i modelli di malattie cardiache del pesce zebra^6,16, lesioni cardiache e recupero^10,13, e rigenerazione^11,12, e può essere ulteriormente utilizzato per valutare potenziali farmaci.

Protocollo

Tutte le procedure relative al pesce zebra sono state approvate dal nostro Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e sono conformi all'USDA Animal Welfare Act.

1. Configurazione sperimentale

1. Impostazione della piattaforma per l'acquisizione di immagini
   1. Utilizzando piccole forbici o un bisturi fare un'incisione su una spugna nella posizione 12 ore per tenere il pesce durante la scansione. Posizionare la spugna in un contenitore di vetro (Figura 2A).
      NOTA: La posizione dell'incisione dovrebbe consentire spazio sufficiente per spostare il trasduttore e anche per mantenere il pesce sotto la linea d'acqua quando la piattaforma è inclinata per la scansione (Figura 2). L'incisione può variare a seconda delle dimensioni del pesce; tuttavia, per una dimensione e un peso standard, l'incisione dovrebbe essere di circa 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (lunghezza, larghezza e profondità, rispettivamente). Il contenitore di vetro deve essere profondo almeno 6 cm per evitare perdite d'acqua durante l'imaging del pesce.
   2. Apporre la scatola di vetro contenente la spugna sulla piattaforma ad ultrasuoni, ad esempio utilizzando nastro a due lati. Assicurarsi che la scatola di vetro sia al centro della piattaforma e saldamente attaccata (Figura 2B).
   3. Inclinare la piattaforma in avanti di circa 30 gradi utilizzando la manopola sul lato sinistro del supporto della piattaforma (Figura 2B). Riempire il quadrato di vetro con 200-250 mL di acqua del sistema ittico contenente 0,2 mg/mL di metanonero (MS222).
      NOTA: La tricaina può essere preparata come soluzione di stock da 4 mg/mL a Tris 40 mM pH 7 e ulteriormente diluita alla concentrazione desiderata nell'acqua del sistema ittico; 0,2 mg/mL è risultato essere la migliore concentrazione¹⁶. La soluzione di 4 mg/mL di brodo di tricaine può essere conservata per un lungo periodo di tempo a -20 gradi centigradi o a 4 gradi centigradi per un mese.
   4. Inserire il trasduttore all'interno del supporto del micromanipolatore sulla stazione ferroviaria di lavoro, ruotando la tacca del trasduttore verso l'operatore. Mantenere l'array parallelo al terreno con il lato di lavoro longitudinale rispetto allo stage (vedere Figura 2B). Lasciare spazio sufficiente (10 cm su entrambi i lati) affinché il sistema trasduttore-rotaia ora connesso si sposti lungo gli assi x e y.
   5. Accedere al software di controllo e scegliere Mouse (piccolo) Vascolare. Creare un nuovo studio e una nuova serie per ogni animale incluso nello studio. Trova il nuovo pulsante di studio situato nella parte inferiore sinistra dello schermo nella pagina del browser (la vista inizia in modalità B).

2. Manipolazione del pesce

NOTA: I pesci zebra utilizzati in questo studio erano maschi adulti di 11 mesi del ceppo di tipo selvatico AB/Tuebingen (AB/TU). I pesci zebra sono stati mantenuti in un sistema di acquario di flusso autonomo a 28 gradi centigradi in un ciclo di luce costante impostato come 14 h luce/10 h scuro. Il pesce zebra veniva nutrito due volte al giorno con gamberetti salamoia (Artemia nauplii) e fiocchi di cibo secco.

1. Utilizzando una rete da pesca, trasferire il pesce in un piccolo serbatoio contenente acqua di sistema con 0,2 mg/mL di tricaine. Attendere che il pesce sia completamente anetizzato (nessun movimento e nessuna risposta al tatto).
2. Utilizzando un cucchiaino di plastica, trasferire delicatamente e rapidamente il pesce nella scatola di vetro contenente la spugna nell'incisione precedentemente fatta con il lato ventrale del pesce rivolto verso l'alto.
   NOTA: Assicurarsi che la testa del pesce sia posizionata verso l'operatore (stessa direzione della tacca del trasduttore) e ad un livello leggermente superiore rispetto al resto del corpo per ottenere una migliore visualizzazione del cuore.
3. Abbassare delicatamente il trasduttore (mantenendo la sua posizione originale) utilizzando la maniglia sul sistema ferroviario, posizionandolo longitudinalmente e vicino al lato ventrale del pesce con la tacca del trasduttore rivolto verso l'operatore. Lasciare dal pesce una distanza di 2-3 mm (non più di 1 cm). Regolare la piattaforma rispetto al trasduttore utilizzando il micromanipolatore in tutti e 3 gli assi fino a quando il cuore di pesce viene visualizzato e quindi avviare l'acquisizione dell'immagine. L'angolo del trasduttore non deve essere modificato durante l'acquisizione dell'intera immagine (Figura 2C).
   NOTA: Finché c'è abbastanza prossimità (fino a 1 cm), l'acqua sopra il pesce fornirà una superficie di contatto tramite tensione superficiale liquida che consente la trasmissione delle onde ultrasoniche tra la sonda e il pesce. Pertanto, non è necessario spingere il trasduttore contro il pesce. Prova a completare questo passaggio e completa la scansione in meno di 3 minuti per prevenire la morte dei pesci o una diminuzione della frequenza cardiaca durante l'acquisizione dell'immagine. Se necessario, utilizzare un timer. Il cuore può essere trovato sul lato superiore dello schermo verso il lato sinistro dell'occhio, che può essere facilmente visualizzato se si sposta l'asse x tutta la strada a destra. Se c'è una continua difficoltà nel trovare il cuore in modalità B, passare alla modalità Doppler di colore, che permetterà di tracciare il flusso sanguigno (il rosso indica che il sangue scorre verso l'operatore) e localizzare il cuore.

3. Acquisizione di immagini

NOTA: vedere Tabella dei materiali per il sistema di imaging e il software di analisi delle immagini.

1. Modalità B Vista longitudinale
   1. Dopo aver localizzare il cuore, selezionare o rimanere in modalità B (che si trova nella parte inferiore sinistra del touchscreen dopo aver iniziato una nuova serie) e ridurre il campo al fine di ingrandire e avere uno sguardo più da vicino il cuore per la traccia più facile durante l'analisi.
   2. Per avere una visione più ravvicinata e chiara del cuore nell'acquisizione di immagini in modalità B, riduci il campo ingrandendo. Utilizzare il touchscreen per restringere manualmente il campo sugli assi x e y.
   3. Se necessario, migliorare la qualità/contrasto dell'immagine impostando l'intervallo dinamico su 45-50 dB. Vai ai controlli in modalità B nell'opzione Altri controlli e successivamente salva la modifica in Predefiniti modalità. Tocca Predefiniti modalità per selezionare l'impostazione di acquisizione dell'immagine ottimizzata ogni volta che prima di iniziare l'immagine di una nuova serie.
   4. Scattare tutte le immagini desiderate nel piano dell'asse lungo selezionando Salva immagine.
      NOTA: informazioni più dettagliate e risorse di formazione sull'acquisizione di immagini sono disponibili presso https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab e https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
2. Onda d'impulso vista longitudinale
   1. Passare a Doppler colore per il rilevamento del flusso sanguigno (selezionare il pulsante Colore) e l'acquisizione (trovato nella parte inferiore sinistra del touchscreen dopo aver avviato una nuova serie).
   2. Utilizzando il touch screen posizionare il quadrante sulla parte superiore della valvola atrioventricolare e localizzare l'afflusso, che si distinguerà per il segnale di colore rosso (Figura 3A). Ridurre il più possibile l'area del quadrante per aumentare la frequenza fotogrammi.
      NOTA: Abbassare la frequenza di ripetizione dell'impulso colore (Colore PRF) (intervallo di velocità) per garantire che il colore giallo possa essere visualizzato nel profilo di velocità dell'immagine Doppler colore. Questo aumenterà la gamma di velocità che possono essere viste e contribuirà a creare un mosaico di colore che permetterà di visualizzare più chiaramente le velocità di picco.
   3. Attivare la modalità Doppler (selezionare PW)per campionare la velocità dell'afflusso di sangue ventricolare. Posizionare il cancello del volume del campione al centro della valvola atrioventricolare (dove il segnale di colore rosso diventa più giallastro) per rilevare la velocità massima di flusso. Regolare l'angolo PW sullo schermo utilizzando le dita in modo che si allinei con la direzione dell'afflusso di sangue. Premere start o update per iniziare a campionare la velocità del sangue che scorre nel ventricolo.
      NOTA: Assicurarsi che la linea corretta dell'angolo sia parallela al flusso sanguigno per fornire risultati coerenti e riproducibili. Posizionando la linea corretta dell'angolo in modo che corrisponda alla direzione del flusso sanguigno, le velocità vengano catturate con precisione.
   4. Ripetere il passaggio 3.2.3 per determinare la velocità di deflusso posizionando il quadrante Color Doppler alla giunzione tra il ventricolo e il bulbus (valvola bulbuventricolare) e localizzare il flusso, che sarà distinto da un segnale di colore blu (Figura 3B). Posizionare il cancello del volume del campione subito prima della giunzione ventricola-bulbus e regolare la linea di correzione dell'angolo in modo che corrisponda alla direzione del flusso sanguigno.
      NOTA: Come accennato in precedenza, per ottenere valori di velocità precisi, assicurarsi che l'angolo PW sia allineato con il flusso sanguigno.
   5. Regolare la linea di base (barra), abbassandola o sollevandola nel pannello della velocità di flusso, al fine di rilevare e tracciare completamente i picchi del segnale (Figura 3C,D). Identificare i picchi di afflusso nel quadrante superiore/positivo (segnale verso la sonda) e i picchi di deflusso nel quadrante inferiore/negativo (segnale che si allontana dalla sonda).

4. Recupero del pesce

1. Non appena l'acquisizione dell'immagine è completa, utilizzando un cucchiaino, trasferire il pesce in un sistema regolare aerato acqua libera da tricaina e lasciare che il pesce recuperare (di solito prende 30 s a 2 minuti per riprendere il movimento delle branchie e nuotare).
2. Per aiutare il recupero, spruzzare ripetutamente l'acqua sulle branchie utilizzando una pipetta di trasferimento per promuovere l'aerazione del trasferimento di acqua e ossigeno.

5. Analisi delle immagini

1. Aprire il software di analisi delle immagini.
2. Selezionare un'immagine e fare clic sull'icona di elaborazione dell'immagine (Figura 4). Utilizzando la scala disponibile (Figura 4), regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine per consentire una chiara visualizzazione delle pareti ventricolare o del pattern del flusso sanguigno.
3. Utilizzando l'immagine in modalità B, aprire l'elenco a discesa dall'opzione PSLAX (asse lungo parasterna) sul pacchetto/misurazioni cardiache (Figura 4). Selezionare LV traccia e traccia la parete interna ventricolare in sistole e diastolo per ottenere l'area ventricolare (VA) in sistole (VA) e diastole (VAd), volume diastolico finale (EDV) e volume sistolico finale (ESV)(Figura 5A,B).
   NOTA: i valori del volume vengono estrapolati dalle ritracceture delle immagini 2D e potrebbero discostarsi dall'entità 3D. Per tutte le misurazioni, in media 3 cicli cardiaci rappresentativi per animale.
4. Si noti il volume del tratto e la frazione di espulsione che verranno calcolati e visualizzati automaticamente dal software.
   NOTA: il volume della corsa e la frazione di espulsione possono anche essere calcolati manualmente utilizzando le formule
   SV - EDV-ESV
   EF (EDV-ESV)/EDV
   dove SV è il volume della corsa, l'EDV è il volume diastolico finale, l'ESV è il volume sistolico finale ed EF è la frazione di espulsione
5. Calcolare la modifica frazionaria dell'area utilizzando la formula
   FAC = (VAd - VAs)/ VAd
   dove FAC è il cambio di area frazionaria, VAd è un'area ventricolare in diastole e i VI sono nell'area ventricolare in sistole.
6. Calcolare l'uscita cardiaca utilizzando la formula
   CO - HR x SV
   dove CO è uscita cardiaca, HR è frequenza cardiaca e SV è volume di ictus
7. Utilizzando l'immagine pulsed Wave Doppler Mode ( Modalità Doppler onda smortizzata), misurare la velocità del sangue del flusso di lavoro selezionando l'opzione Flusso MV sotto il pacchettocardiaco( Figura 4 ). Selezionare e o A rispettivamente per la diastoleinizialee la diastole tardiva e determinare le velocità di picco nel grafico ( Figura 3C).
8. Misurare la velocità del sangue in uscita selezionando Flusso AoV e determinare i picchi sul tracciamento (Figura 3D).
9. Misurare la frequenza cardiaca utilizzando 2 diverse metodologie per una valutazione più affidabile:
   1. Quando il cuore viene visualizzato sullo schermo durante l'acquisizione dell'immagine, contare i battiti entro 10 s e moltiplicarlo per 6.
   2. Utilizzando l'immagine Pulse Wave Doppler sul software Vevo LAB, scegliere il pulsante della frequenza cardiaca e gli intervalli di traccia tra 3 picchi di flusso aortico consecutivi (Figura 4 e Figura 6).
   3. Per esportare i dati in un foglio di calcolo dopo aver tracciato il LV e i picchi del flusso sanguigno, fare clic su report - esportazione - salva come excel.

Risultati

Il protocollo descritto consente la misurazione di importanti parametri cardiaci dimensionali e funzionali, analogamente alla tecnica utilizzata nell'ecocardiografia umana e animale. Le immagini In modalità B consentono di tracciare la parete interna ventricolare nella sistole e nella diastole (Figura 5) e di ottenere dati dimensionali, quali le dimensioni di camere e pareti, e dati funzionali, quali frequenza cardiaca, volume dell'ictus e uscita cardiaca, n...

Discussione

Descriviamo un metodo sistematico per l'imaging ecocardiografico e la valutazione della funzione cardiaca nel pesce zebra adulto. L'ecocardiografia è l'unico metodo disponibile non invasivo e più robusto per l'imaging cardiaco dei pesci adulti vivi e l'analisi funzionale, e sta diventando sempre più popolare nella ricerca cardiovascolare dei pesci zebra. La quantità di tempo necessaria è breve e consente studi ad alto valore di velocità effettiva e longitudinali. Tuttavia, vi è una notevole variazione nella metodo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double sided tape
Fish net
Glass container - 100 inch high
High frequency transducer	Fujifilm/VisualSonics	MX700	Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm
Plastic teaspoon
Scalpel or scissors
Small fish tanks
Sponge (kitchen sponge)
Transfer pipets (graduated 3 mL)	Samco Scientific	212
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Vevo 3100 Imaging system and imaging station	Fujifilm/VisualSonics
Vevo LAB sofware v 1.7.1	Fujifilm/VisualSonics