Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول نهج التهجين في الموقع الفعال للكشف عن مستويات التعبير mRNA والأنماط المكانية للجينات المستهدفة في السائل الكوليسي.

Abstract

التهجين في الموقع (ISH) هو تقنية مفيدة للغاية لتقديم أنماط التوزيع الخلوي لجينات محددة (على سبيل المثال، مرنا وncRNA) في الأنسجة. دودة sipunculid Sipunculus nudus هو مورد مصائد الأسماك الحاسمة كما أن لديها قيم غذائية وطبية عالية. حاليا ، فإن البحوث على البيولوجيا الجزيئية من Nudus Sipunculus لا تزال في مهدها. الغرض من هذه المقالة هو تطوير طريقة حساسة لتوطين مرنا محددة في السائل الكوليسي سيبونكولوس. يتضمن البروتوكول خطوات مفصلة من ISH ، بما في ذلك antisense المسمى digoxigenin وإعداد الريبوسبر بالإحساس ، وجمع السوائل الكيوموإعداد القسم ، وتهجين الريبوسوم المحدد ، واحتضان الأجسام المضادة ، والتلوين وعلاجات ما بعد التلوين. يتم عرض النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من تجربة ناجحة باستخدام هذه الطريقة. وينبغي أن ينطبق البروتوكول على أنواع سيفونكولا الأخرى أيضا.

Introduction

ISH، وذلك باستخدام مسبار الحمض النووي المسمى للكشف عن الحمض النووي محددة أو تسلسل الحمض النووي الريبي من الفائدة، هو وسيلة مفيدة لوصف نمط التعبير المكاني للجينات المستهدفة في الأنسجة المحفوظة شكليا1،2،3. عادة ، يتم إنشاء تسلسل الهدف عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، ثم يستخدم كقالب لتوليف مسبار الحمض النووي الريبي المضاد / الإحساس المسمى بيوريدين-5-ثلاثي الفوسفات digoxigenin. يتم إصلاح العينات وpermeabilized قبل الحضانة مع الريبوسبر. بعد غسل قبالة التحقيق الزائد، يتم تصور التهجين من قبل الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة للأكسجين، وهو القلوية فوسفاتاز مترافق3،,4،,5،,6.

Sipunculus nudus (فيلوم سيبوناولا؛ النظام Sipunculida: Sipunculidae) هو دودة بحرية غير مجزأة، coelomate ومتناظرة ثنائيا7،8. Sipunculus nudus هو نوع عالمي موزعة على نطاق واسع في المياه الساحلية الاستوائية والمعتدلة. كما أنها مورد صيد بحري مهم في جنوب الصين بسبب قيمها الغذائية والطبية العالية9،10. ومع ذلك ، فإن Sipunculus nudus في البيولوجيا الجزيئية لا يزال في مراحله الأولى. لفهم الدور البيولوجي للجينات بشكل كامل ، فإن التحقيق في أنماط تعبير الجينات في قرار خلوي هو أمر مهم بشكل كبير. في الكائن غير النموذجي Sipunculus nudus، لم يتم بعد إنشاء طريقة ISH ، وهي طريقة مثالية للكشف عن أنماط تعبير الجينات. يحتوي السائل الكائي على عدة أنواع من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الحبيبية ، وخلايا الجر ، والخلايا العمودية ، والخلايا الجرثومية ، والكريات الحمراء ، وما إلى ذلك11. الجنس المزدوج / ماب-3 عامل النسخ ذات الصلة-1(dmrt1),تستخدم كجين تمثيلي في هذه الطريقة, هو منظم النسخ المحفوظة للغاية من تحديد الجنس والتمايز في معظم الأنواع التي تتراوح بين اللافقاريات إلى الثدييات12,,13. في مجموعة من الأنواع (أي الإباحية السوداء، وما إلى ذلك) 14, تم التعبير عن dmrt1 في خلايا سيرتولي, المحيطة الخلايا الانباتية, وظيفتها مماثلة لخلايا التروبهوبلاس سبونكولوس. لذلك ، افترضنا أن dmrt1 من Sipunculus nudus يتم التعبير عنه في الخلايا الغذائية من الحيوانات المنوية ، ونتيجة لطريقة ISH أكدت بوضوح الفرضية.

يصف هذا البروتوكول لأول مرة ISH ، مع تحقيقات antisense/sense ssense /sense ssense ، لتحديد أنماط تعبير مرنا في مسحة السائل الكوافي. يتم توفير ظروف التفاعل الأمثل ، والتي تسمح بتصور حساس للغاية للتعبير مرنا بدقة عالية. يمكن تطبيق طريقة ISH المطورة في أنواع سيباونكوليدا أكثر من Sipunculus nudus.

Protocol

وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان ورعاية الحيوان بجامعة هواتشياو على اجراء الحيوان .

1. ريبوسوبر التحضير

  1. تصميم التمهيدي
    1. افتح برنامج التمهيدي 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). نسخ تسلسل dmrt1 (GenBank: MK182259) في إطار التسلسل.
    2. تعيين طول التمهيدي (23-25 نقطة في الثانية)، درجة حرارة الذوبان (55-60 درجة مئوية)، ومحتوى G/C (40-60٪). انقر فوق اختيار التمهيديات.
      ملاحظة: الحد الأدنى من الحجم المطلوب للتحقيق الحمض النووي الريبي هو حوالي 500 bp. تحقيقات أطول عادة ما يكون أعلى خصوصية.
    3. إضافة T7 RNA البوليميراز مروّز تسلسل (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3, ) إلى واحدة من التمهيديات المختارة., يتم عرض تسلسل التمهيدي dmrt1 لـ ISH في الجدول 1.
      ملاحظة: للحصول على تحقيقات الإحساس، يقع T7 RNA polymerase المروج في نهاية 5 'من التمهيديات إلى الأمام. للتحقيقات antisense، يقع T7 RNA polymerase المروج في نهاية 5'-من التمهيديات العكسي.
  2. تضخيم PCR
    1. ضع أنابيب الميكروفوج على الجليد، وأعد مزيج التفاعل التالي (لرد فعل 50 ميكرولتر): 1x مزيج البوليميراز الحمض النووي للقواق، 1 ميكروغرام من cDNA (الذي يتم إعداده من 100 ميكرولتر من السائل الكيوم)، 1 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 1 ميكرومتر التمهيدي العكسي والمياه الخالية من nuclease.
    2. خلط تفاعل PCR عن طريق الأنابيب والطرد المركزي لفترة وجيزة.
    3. ضع أنبوب التفاعل في الدورالحراري الحراري ، وقم بتشغيل PCR باستخدام الشروط التالية: التسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين تليها 36 دورة من التنحني عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ق ، والظهر عند 55-60 درجة مئوية لمدة 30 ق ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ق والتمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقيقة.
      ملاحظة: يجب تحسين درجة حرارة الصلب وفقًا للالتمهيديات.
  3. تنقية منتجات PCR والتحقق من صحتها
    1. قم بتحميل 50 ميكرولتر من خليط PCR مباشرة على جل أغاروز 1٪. تشغيل هلام agarose في 150-180 V لمدة 10 دقيقة في 0.5x TBE. عزل شظايا الحمض النووي محددة من هلام أغاروز 1٪.
      ملاحظة: يجب أن يظهر الحمض النووي كشريط واحد وليس كمسحة.
    2. تنقية شظايا الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج هلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قياس المنتجات النقية عن طريق قياس الطيف الضوئي على طول موجة من 260 نانومتر.
    3. التحقق من صحة منتجات PCR عن طريق التسلسل.
      ملاحظة: (نقطة الإيقاف المؤقت) يمكن تخزين منتجات PCR المنقى عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
  4. تخليق الريبوسبر
    1. ضع أنابيب الميكروميج الخالية من RNase على الجليد ، وأضف ما يلي إلى أنبوب الميكروفوج (لرد فعل 10 ميكرون): 1x Digoxygenin RNA الوسم ميكس ، 1x النسخ الاحتياطي ، 0.5 ميكرولتر من مثبطات RNase ، 1 ميكرولتر من بوليمرات الحمض النووي الريبي T7 ، 1 ميكروغرام من منتج PCR والماء الخالي من RNase. خلط رد الفعل عن طريق الأنابيب والطرد المركزي لفترة وجيزة. احتضان لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية.
    2. إضافة 2 μL من DNase خالية من DNase I. مزيج التفاعل عن طريق الأنابيب والطرد المركزي لفترة وجيزة. احتضان لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    3. إضافة 2 μL 0.2 M EDTA (درجة الحموضة 8.0). خلط رد الفعل عن طريق الأنابيب والطرد المركزي لفترة وجيزة.
    4. أضف 2.5 ميكرولتر من 4 M LiCl و 75 ميكرولتر من الإيثانول المبرد مسبقًا إلى رد الفعل المذكور أعلاه. تخلط جيدا. يترك لمدة 30 دقيقة عند -70 درجة مئوية.
    5. الطرد المركزي عند 12,000 × غرام لمدة 10 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ديكانت الإيثانول. أضف 1 مل من الإيثانول المبرد مسبقًا بنسبة 70٪ (v/v) واغسل هطول الأمطار عن طريق الاختلاط بلطف.
    6. الطرد المركزي عند 12,000 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية. Decant الإيثانول 70٪ وتجفيف هطول الأمطار لفترة وجيزة بالقرب من مصباح الكحول. حل هطول الأمطار عن طريق إضافة 30 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase وتخلط بلطف.
    7. تحميل 2 μL من الحمض النووي الريبي توليفها على هلام أغاروز 1٪. تشغيل هلام agarose في 180 V لمدة 5-10 دقيقة في 0.5x TBE. قياس تركيز الحمض النووي الريبي المسمى باستخدام مطياف على طول موجة من 260 نانومتر.
      1. استخدم أنابيب المايكروفوج الخالية من RNase ونصائح التصفية لتجنب تلوث RNase.
        ملاحظة: (نقطة الإيقاف المؤقت) يمكن تخزين المسابير المسماة بالديأكسجينين عند -70 درجة مئوية لعدة أشهر.

2- جمع السوائل الكيومية

  1. إصلاح nudus S. على الجدول تشريح مع دبابيس. فتح الجسم من النودوس S. مع مقص الأوتوكلاف الصغيرة. عزل السائل الكيوم مع ماصة.
  2. جمع ونقل 1 مل السائل الكل الكل مع ماصة إلى شرائح المجهر متعدد الأبعاد المعالجة. تطبيق السائل coelomic بالتساوي مع طرف ماصة. الهواء الجاف الشرائح لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.

3- التهجين في الموقع

  1. اليوم الأول
    1. Rehydrate الشرائح في جرة تلطيخ الشريحة التي تحتوي على 100 مل من 1x ديثيل بيروكربونات معالجة الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (DEPC-PBS). Rehydrate 3 مرات مع 1x DEPC-PBS، 5 دقيقة لكل غسل مع الانفعالات لطيف.
    2. Permeabilize مسحة السائل الكوليسيوم عن طريق الهضم مع 10 ميكروغرام / مل بروتينات K في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة. احتضان الشرائح في 4٪ من البارافورمالديهايد (PFA) لمدة 20 دقيقة لوقف الهضم. غسل الشرائح في 1x DEPC-PBS مع الانفعالات لطيف لمدة 5 دقيقة 3 مرات.
    3. أضف 50 ميكرولتر من مزيج التهجين (HM) الذي يحتوي على مسبار الريبوز بالإحساس/التحسس المضاد على الشرائح وإضافة زلة غطاء.
    4. إضافة مربع الرطب المخزن المؤقت في المربع الرطب. وضع الشرائح في مربع الرطب وختم جيدا مع فيلم البارافين. تهجين بين عشية وضحاها (على الأقل 16 ساعة) في 60 درجة مئوية.
  2. اليوم الثاني
    1. سخني المخزن المؤقت للغسيل على حرارة 65 درجة مئوية. تزج الشريحة في جرة تلطيخ الشريحة التي تحتوي على المخزن المؤقت لغسل والسماح لها الوقوف حتى شرائح coverslip قبالة تلقائيا. يستغرق حوالي 5 دقيقة.
    2. اغسل مرتين بالسعة المؤقتة للغسيل عند درجة حرارة 65 درجة مئوية، و30 دقيقة لكل غسل مع تهيج لطيف. اغسل 2 مرات مع سترات المحلول ة المالحة والصوديوم (SSC) عند درجة حرارة 65 درجة مئوية، و30 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. يغسل مرتين مع حمض ماليك العازلة التي تحتوي على Tween 20 (MABT) في درجة حرارة الغرفة، 30 دقيقة لكل غسل مع الانفعالات لطيف.
    3. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 ساعة في المخزن المؤقت للحظر. احتضان الشرائح في 1 مل المضادة digoxigenin-AP فاب شظايا الشظايا المخفف في 1/5000 مع عازلة حظر في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. اليوم الثالث
    1. إزالة حل الأجسام المضادة وغسل الشرائح لفترة وجيزة في مابت. اغسل 4 مرات مع مابت في درجة حرارة الغرفة، 25 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف.
    2. احتضان الشرائح مع العازلة فوسفاتاز القلوية في درجة حرارة الغرفة 3 مرات، 5 دقيقة لكل غسل. إزالة العازلة فوسفاتازي القلوية، وإضافة 1 مل من 5-برومو-4-الكلورو-3-indolyl الفوسفات (BCIP)/نيترو الأزرق رباعي التروسيوم (NBT) محلول تلطيخ. إبقاء الشرائح في الظلام.
    3. مراقبة رد فعل اللون بشكل دوري تحت المجهر البصري. عندما يتم تطوير اللون بالكامل (وقت رد الفعل في نطاق 1-4 ساعة)، اغسل الشرائح مرتين مع MABT في درجة حرارة الغرفة، 5 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف.
    4. اغسل 2 مرة مع محلول التوقف في درجة حرارة الغرفة، 15 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. احتضان الشرائح في الميثانول لإزالة وصمة عار الزائدة، في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وفقا للون الخلفية، يمكن أن يتم غسل الميثانول 2 أو 3 مرات ويمكن تمديد وقت إزالة اللون.
    5. اغسل 2 مرات مع مابت في درجة حرارة الغرفة، 5 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. نقل الشرائح إلى ورقة تصفية جديدة. إضافة 50 ميكرولتر من الجلسرين. إضافة coverslips ومراقبة مجهرية.
      ملاحظة: يتم عرض تكوين الحل في الجدول 2.

النتائج

ويرد موجز للخطوات التي تنطوي عليها ISH في الشكل 1. تم تصنيع Antisense والريبوسبر اتى للdmrt1 من منتجات PCR تضخيمها من cDNAs السائل coelomic. وتم التحقق من صحة منتجات الـ PCR عن طريق التسلسل المباشر. تم تصنيع Riboprobes باستخدام تي 7 RNA البوليميراز وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة وتقرير سابق

Discussion

أظهرت الدراسات السابقة أن ISH مناسبة للكشف عن RNAs متعددة الهدف16،17،18. في هذا البروتوكول، وصفنا طريقة ISH عالية الدقة للكشف عن مرنا في السائل coelomic والتأكيد على ظروف التهجين الأمثل في سيبونكولوس nudus. أظهرت الإشارات الواضحة لـ dmrt1 التي ?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل صندوق العلماء الشباب التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31801034)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة فوجيان، الصين (2016J01161)، وصناديق البحث العلمي في جامعة هواتياو (15BS306) والصندوق المبتكر للدراسات العليا في البحث العلمي بجامعة هواتشياو.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseBiowest111860
Anti-digoxigenin-AP Fab fragmentsRoche11093274910
BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kitBeyotimeC3206
Bovine Serum AlbuminSigmaB2064
CentrifugeEppendorf5415R
Citric acidSinopharm Chemical Reagent Co.5949-29-1
Citric acid trisodiumSinopharm Chemical Reagent Co.4/3/6132
CoverslipsBeyotimeFCGF60
Deionized formamideAmresco12/7/1975
Diethyl pyrocarbonate, DEPCSigmaD5758Noxious substance
Digoxigenin (DIG) RNA Labeling MixRoche11277073910
DNase I, RNase-freeInvitrogen18047019
EDTASigma431788
Electrophoresis gel imagingBio-RadUniversal Hood III
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co.64-17-5
Gel extraction kitsOmegaD2500
Gel-electrophoresis apparatusBeijing Liuyi Instrument FactoryDYY-6C
GlycerolSinopharm Chemical Reagent Co.56-81-5
GlycineSigmaG5417
HeparinSigma8/1/9041
KClSinopharm Chemical Reagent Co.7447-40-7
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent Co.7778-77-0
LiClSigma203637
Maleic acidSinopharm Chemical Reagent Co.110-16-7
MethanolSinopharm Chemical Reagent Co.67-56-1Noxious substance
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co.7786-30-3
Na2HPO4Sinopharm Chemical Reagent Co.7558-79-4
NaClBiofountJT0001
NaOHSinopharm Chemical Reagent Co.1310-73-2Corrosive
Paraffin filmBemis Company, Inc.PM-996
Paraformaldehyde, PFASigma158127Noxious substance
PCR InstrumentLife TechnologyProflex
PinsDeli16
PipetteEppendorfplus G
Poly-D-lysine treated microscope slidesLiushengVER_A01
Proteinase KSigmaSRE0005
RNase free waterHyCloneSH30538. 02
RNase inhibitorRoche3335399001
S. nudus
Sheep serumBeyotimeC0265
Slide staining jarBeyotimeFG010
Slide storage boxBeyotimeFBX011
Small autoclaved scissorsShuanglusku_8330
SpectrophotometersThermo FisherNanoDrop 2000/2000c
T7 RNA polymerasesRoche10881767001
Taq DNA polymerase mix (2X)Thermo ScientificK1081
Tris HClSigmaRES3098T
tRNARoche10109517001
Tween-20SigmaP1379
Water bathZhengzhou Great Wall Scientific IndustrialHH-S2

References

  1. Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
  2. Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
  3. Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
  4. Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  5. Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
  6. Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
  7. Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
  8. Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
  9. Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
  10. Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
  11. Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
  12. Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
  13. Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
  14. Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
  15. Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
  16. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  17. Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
  18. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159 Digoxigenin Antisense Riboprobe Sense Riboprobe

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved