На месте Гибридизация для Sipunculus nudus Coelomic жидкости

Резюме

Этот протокол описывает эффективный подход к гибридизации на месте для определения уровней экспрессии мРНК и пространственных моделей генов-мишеней в коеломной жидкости Sipunculus nudus.

Аннотация

На месте гибридизация (ISH) является очень информативным методом представления клеточных моделей распределения конкретных генов (например, мРНК и ncRNA) в тканях. Сипункулидный червь Sipunculus nudus является важнейшим рыбным ресурсом, поскольку он имеет высокие питательные и лекарственные значения. В настоящее время исследования молекулярной биологии Sipunculus nudus все еще находятся в зачаточном состоянии. Целью данной статьи является разработка чувствительного метода локализации специфической мРНК в сипункулусе нудуса-келомической жидкости. Протокол включает в себя подробные шаги ISH, в том числе digoxigenin помечены антисмысл и смысл riboprobe подготовки, coelomic сбора жидкости и подготовки секции, конкретные гибридизации рибозонда, инкубации антител, окраски и пост-окраски лечения. Доказаны репрезентативные результаты успешного эксперимента с использованием этого метода. Протокол должен быть применим и к другим видам Сипункулы.

Введение

ISH, используя помеченные нуклеиновой кислоты зонд для обнаружения конкретной ДНК или РНК последовательность интересов, является полезным методом для описания пространственной экспрессии картины генов-мишеней в морфологически сохраненных^{тканей 1,2,3}. Как правило, целевая последовательность генерируется полимеразной цепной реакцией (ПЦР), а затем используется в качестве шаблона для синтеза антисмыслового/чувстве РНК-зонда, помеченного дигоксигенином моридином-5'-трифосфатом. Образцы фиксируются и пронизаны перед инкубации с помощью рибозаза. После смыва избыточного зонда, гибридизация визуализируется иммуногистохимией с помощью антидигоксигенина антитела, которое щелочной фосфатазы-конъюгированных^3,4,5,6.

Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; заказ Sipunculida: Sipunculidae) является unsegmented, coelomate и двусторонним симметричным морским червем^7,8. Sipunculus nudus является космополитическим видом, широко распространенным в тропических и умеренных прибрежных водах. Он также является важным морским промысловым ресурсом на юге Китая из-за его высокой питательной и целебной ценности^9,,10. Тем не менее, Sipunculus nudus в молекулярной биологии все еще находится в зачаточном состоянии. Чтобы в полной мере понять биологическую роль генов, большой интерес представляет исследование моделей экспрессии генов в клеточном разрешении. В немодельном организме Sipunculus nudusметод ISH, который является идеальным методом обнаружения моделей экспрессии генов, до сих пор не установлен. Его кельомная жидкость содержит несколько типов клеток, в том числе гранулоциты, клетки урны, пузырькулярные клетки, зародышевые клетки, эритроциты и т.д.^11. Двойной секс / mab-3 связанных транскрипции фактор-1(dmrt1), используется в качестве репрезентативного гена в этом методе, является весьма сохранены транскрипции регулятора определения пола и дифференциации в большинстве видов, начиная от беспозвоночных для млекопитающих^12,13. В целом ряде видов (нат., черный порги и т.д.) ¹⁴, dmrt1 был выражен в клетках Sertoli, окружающих зародышевые клетки, функция которых похожа на трофобластные клетки Sipunculus nudus. Поэтому мы предположили, что dmrt1 из Sipunculus nudus выражается в трофобластных клетках сперматозiii,-и результат метода ISH четко подтвердил гипотезу.

Этот протокол впервые описывает ISH, с digoxigenin помечены антисмысл / смысл мРНК зондов, чтобы определить мРНК экспрессии моделей в его coelomic мазка жидкости. Обеспечиваются оптимальные условия реакции, которые позволяют очень чувствительновую визуализацию экспрессии мРНК в высоком разрешении. Разработанный метод ISH потенциально может быть применен в более sipunculida видов, кроме Sipunculus nudus.

протокол

Процедура животных была одобрена Комитетом по уходу за животными и благополучию Университета Хуацяо.

1. Препарат Рибозонда

1. Дизайн праймера
   1. Откройте программу Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Копируйте последовательность dmrt1 (GenBank: MK182259) в окне последовательности.
   2. Установите длину грунтовки (23-25 bp), температуру плавления (55-60 градусов по Цельсию) и содержание G/C (40-60%). Нажмите Выберите праймеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный размер, необходимый для ЗОНДа РНК составляет около 500 bp. Более длинные зонды обычно имеют более высокую специфичность.
   3. Добавьте последовательность промотора t7 РНК-полимераза (5^, -TAATACGACTActActATAGGG-3^),к одному из выбранных праймеров. Последовательности праймеров dmrt1 для ISH отображаются в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для зондов чувств, промоутер Полимераза T7 РНК расположен в 5'end форвардных грунтовок. Для антисмысловых зондов, t7 РНК-полимераза промоутер расположен на 5'-конец обратного грунтовки.
2. Усиление ПЦР
   1. Поместите микрофуге трубки на лед, и подготовить следующую смесь реакции (для 50 мл реакции): 1x Taq ДНК полимеразы смесь, 1 мкг кДНК (которая готовится из 100 кЛ coelomic жидкости), 1 ММ вперед грунтовки, 1 ММ реверсивной грунтовки и нуклеаза воды.
   2. Смешайте реакцию ПЦР путем краткого типопетирования и центрифуги.
   3. Поместите реакционную трубку в тепловой цикл, и запустить ПЦР, используя следующие условия: начальная денатурация при 95 градусов по Цельсию в течение 2 мин, а затем 36 циклов денатурации при 95 градусах по Цельсию в течение 30 с, аннулирование при 55-60 c для 30 с, расширение на 72 градусов по Цельсию на 30 с и окончательное расширение на 72 градусов по Цельсию в течение 7 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Температура аннулирования должна быть оптимизирована в соответствии с грунтовки.
3. Очистка и проверка пЦР
   1. Загрузите смесь ПЦР на 50 л пЦР непосредственно на 1% агарозный гель. Выполнить гель агарозы на 150-180 V в течение 10 минут в 0,5x TBE. Изолировать конкретные фрагменты ДНК из 1% агарозного геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК должна отображаться как одна полоса, а не как мазок.
   2. Очистите фрагменты ДНК с помощью комплекта для извлечения геля в соответствии с протоколом производителя. Количественно очищенные продукты с помощью спектрофотометрии на длине волны 260 нм.
   3. Проверьте подлинность продуктов ПЦР путем секвенирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (Точка паузы) Очищенные продукты ПЦР могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
4. Синтез рибозонда
   1. Поместите RNase-бесплатные микрофугевые трубки на льду, и добавьте следующее к микрофуговой трубке (для реакции 10 л): 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x транскрипционный буфер, 0,5 злингинговых ингибиторов RNase, 1 Зл полимеразы РНК T7, 1 мкг продукта ПЦР и безробиливая rNase. Смешайте реакцию путем пипетки и центрифуги кратко. Инкубировать в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия.
   2. Добавьте 2 Зла без RNase DNase I. Смешайте реакцию трубацией и центрифугой кратко. Инкубировать в течение 15 мин при 37 градусах Цельсия.
   3. Добавьте 2 л 0,2 М ЭДТА (pH 8.0). Смешайте реакцию путем пипетки и центрифуги кратко.
   4. Добавьте к вышеуказанной реакции 2,5 л из 4 М ЛиКлал и 75 л прешилового этанола. Хорошо перемешать. Оставьте на 30 мин при -70 градусов по Цельсию.
   5. Центрифуга при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Декант этанол. Добавьте 1 мл прешилационного 70% этанола (v/v) и вымойте осадки, аккуратно перемешивая.
   6. Центрифуга при 12 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Decant 70% этанол и высушите осадки кратко около светильника спирта. Растворите осадки, добавив 30 кЛ безрычания воды и аккуратно перемешайте.
   7. Загрузите 2 Зл синтезированной РНК на 1% агарозный гель. Выполнить гель агарозы на 180 V в течение 5-10 мин в 0,5x TBE. Измерьте концентрацию маркированной РНК с помощью спектрофотометра на длине волны 260 нм.
      1. Используйте RNase-бесплатные микрофуги трубки и фильтр советы, чтобы избежать загрязнения RNase.
         ПРИМЕЧАНИЕ: (Пауза точки) Digoxygenin помечены зонды могут храниться при -70 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.

2. Коллекция coelomic жидкости

1. Зафиксните S. nudus на таблице вскрытия с булавками. Откройте корпус S. nudus с небольшими автоклавными ножницами. Изолировать коеломную жидкость пипеткой.
2. Соберите и перенесите 1 мл коеломической жидкости с пипеткой на поли-D-лизина обработанных слайдов микроскопа. Нанесите coelomic жидкости равномерно с кончиком пипетки. Воздушно-сухие горки для 1 ч при 37 градусах Цельсия.

3. На месте гибридизации

1. День 1
   1. Регидратировать слайды в слайд окрашивания банку, содержащую 100 мл 1x диэтил пиробунабоната обработаны фосфат буферного солей (DEPC-PBS). Регидратировать 3 раза с 1x DEPC-PBS, 5 мин на промывку с нежным возбуждением.
   2. Пермяки мазок коеломической жидкости путем пищеварения с 10 мкг/мл протеиназы K при комнатной температуре в течение 5 мин. Инкубировать слайды в 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин, чтобы остановить пищеварение. Вымойте слайды в 1x DEPC-PBS с нежным возбуждением в течение 5 мин 3 раза.
   3. Добавьте 50 зл гибридизации смеси (HM), содержащий смысл / антисмысл рибозонд на слайдах и добавить крышку скольжения.
   4. Добавьте буфер мокрой коробки во влажную коробку. Положите слайды в мокрой коробке и печать хорошо с парафина пленки. Гибридизировать ночь (не менее 16 ч) при 60 градусах Цельсия.
2. День 2
   1. Разогреть буфер для мытья при температуре 65 градусов по Цельсию. Погрузите слайд в слайдок окрашивания банку, содержащую мыть буфер и дайте ему стоять, пока coverslip соскальзывает автоматически. Это занимает около 5 минут.
   2. Вымойте 2 раза с мытьем буфера при 65 градусов по Цельсию, 30 минут на мытье с нежным возбуждением. Вымойте 2 раза с 0,2x солевым натриевым цитратом (SSC) при 65 градусах Цельсия, 30 мин на промывку с нежным возбуждением. Вымойте 2 раза с мужской кислотой буфера, содержащего Tween 20 (MABT) при комнатной температуре, 30 минут на мыть ежевый с нежным возбуждением.
   3. Инкубировать слайды при комнатной температуре 3-4 ч в блокирующем буфере. Инкубировать слайды в 1 мл анти-digoxigenin-AP Fab фрагменты раствора разбавленного на 1/5000 с блокирующим буфером на 4 градуса Цельсия в одночасье.
3. День 3
   1. Удалите раствор антитела и кратко вымойте слайды в MABT. Вымойте 4 раза с MABT при комнатной температуре, 25 мин за стирку с нежным возбуждением.
   2. Инкубировать слайды щелочным буфером фосфатазы при комнатной температуре 3 раза, 5 мин на стирку. Удалите щелочный фосфатазный буфер и добавьте 1 мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP)/нитро синий тетразолий (NBT) окрашивающий раствор. Держите слайды в темноте.
   3. Периодически наблюдайте за цветовой реакцией под оптическим микроскопом. Когда цвет полностью развит (время реакции в диапазоне 1-4 ч), промойте горки 2 раза с MABT при комнатной температуре, 5 мин на промывку с нежным возбуждением.
   4. Вымойте 2 раза стоп-раствором при комнатной температуре, 15 мин на промывку с нежным возбуждением. Инкубировать горки в метаноле, чтобы удалить избыток пятна, при комнатной температуре в течение 30 минут. В зависимости от цвета фона, метанол мыть можно сделать 2 или 3 раза и время деколонации может быть продлен.
   5. Вымойте 2 раза с MABT при комнатной температуре, 5 мин за стирку с нежным возбуждением. Перенесите слайды на свежую фильтровальную бумагу. Добавьте 50 л глицерола. Добавить крышки и наблюдать микроскопически.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав решения показан в таблице 2.

Результаты

Краткое изложение шагов, связанных с ISH, иллюстрируется на рисунке 1. Антисмысловые и соответствующие рибозонды для dmrt1 были синтезированы из продуктов ПЦР, усиленных из кДНС, кокломических жидкостей. Подлинность продуктов ПЦР была проверена путем прямого секвенир?...

Обсуждение

Предыдущие исследования показали, что ISH подходит для обнаружения нескольких целевых РНК^16,,17,,18. В этом протоколе мы описали метод ISH высокого разрешения для обнаружения мРНК в коеломической жидкости и акцента на оптимизированные услов...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Biowest	111860
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments	Roche	11093274910
BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit	Beyotime	C3206
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Citric acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.	5949-29-1
Citric acid trisodium	Sinopharm Chemical Reagent Co.	4/3/6132
Coverslips	Beyotime	FCGF60
Deionized formamide	Amresco	12/7/1975
Diethyl pyrocarbonate, DEPC	Sigma	D5758	Noxious substance
Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix	Roche	11277073910
DNase I, RNase-free	Invitrogen	18047019
EDTA	Sigma	431788
Electrophoresis gel imaging	Bio-Rad	Universal Hood III
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	64-17-5
Gel extraction kits	Omega	D2500
Gel-electrophoresis apparatus	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	56-81-5
Glycine	Sigma	G5417
Heparin	Sigma	8/1/9041
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7447-40-7
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7778-77-0
LiCl	Sigma	203637
Maleic acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.	110-16-7
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	67-56-1	Noxious substance
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7786-30-3
Na2HPO4	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7558-79-4
NaCl	Biofount	JT0001
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent Co.	1310-73-2	Corrosive
Paraffin film	Bemis Company, Inc.	PM-996
Paraformaldehyde, PFA	Sigma	158127	Noxious substance
PCR Instrument	Life Technology	Proflex
Pins	Deli	16
Pipette	Eppendorf	plus G
Poly-D-lysine treated microscope slides	Liusheng	VER_A01
Proteinase K	Sigma	SRE0005
RNase free water	HyClone	SH30538. 02
RNase inhibitor	Roche	3335399001
S. nudus
Sheep serum	Beyotime	C0265
Slide staining jar	Beyotime	FG010
Slide storage box	Beyotime	FBX011
Small autoclaved scissors	Shuanglu	sku_8330
Spectrophotometers	Thermo Fisher	NanoDrop 2000/2000c
T7 RNA polymerases	Roche	10881767001
Taq DNA polymerase mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Tris HCl	Sigma	RES3098T
tRNA	Roche	10109517001
Tween-20	Sigma	P1379
Water bath	Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial	HH-S2