Hybridation in situ pour Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Résumé

Ce protocole décrit une approche efficace d’hybridation in situ pour détecter les niveaux d’expression de l’ARNm et les modèles spatiaux des gènes cibles dans le liquide coélomique sipunculus nudus.

Résumé

L’hybridation in situ (ISH) est une technique très informative pour présenter des modèles de distribution cellulaire de gènes spécifiques (p. ex. l’ARNm et l’ARN) dans les tissus. Le ver sipunculide Sipunculus nudus est une ressource de pêche cruciale car il a des valeurs nutritionnelles et médicinales élevées. Actuellement, la recherche sur la biologie moléculaire de Sipunculus nudus n’en est encore qu’à ses balbutiements. Le but de cet article est de développer une méthode sensible pour localiser l’ARNm spécifique dans sipunculus nudus liquide coélomique. Le protocole comprend des étapes détaillées de l’ISH, y compris l’antisense étiqueté digoxigenin et la préparation des riboprobes sens, la collecte de liquide coélomique et la préparation de section, l’hybridation spécifique de riboprobe, l’incubation d’anticorps, la coloration et les traitements de post-coloration. Les résultats représentatifs obtenus à partir d’une expérience réussie utilisant cette méthode sont démontrés. Le protocole devrait également s’appliquer à d’autres espèces de Sipuncula.

Introduction

ISH, à l’aide d’une sonde d’acide nucléique étiquetée pour détecter la séquence spécifique d’ADN ou d’ARN d’intérêt, est une méthode utile pour décrire le modèle d’expression spatiale des gènes cibles dans les tissus morphologiquement conservés^1,2,3. Normalement, la séquence cible est générée par la réaction en chaîne de polymérase (PCR), puis utilisée comme modèle pour synthétiser la sonde antisense/sens de l’ARN étiquetée avec de l’uridine-5'-triphosphate digoxigenin. Les échantillons sont fixes et perméabilisés avant l’incubation avec des riboprobe. Après avoir lavé l’excès de sonde, l’hybridation est visualisée par immunohistochimie à l’aide d’un anticorps anti-digoxygenine, qui est alcalin phosphatase-conjugué^3,4,5,6.

Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; ordre Sipunculida: Sipunculidae) est un ver marin non mécublé, coelomate et bilatéralement symétrique^7,8. Sipunculus nudus est une espèce cosmopolite largement répandue dans les eaux côtières tropicales et tempérées. Il s’agit également d’une ressource importante de pêche marine dans le sud de la Chine en raison de ses valeurs nutritionnelles et médicinales élevées^9,10. Cependant, Sipunculus nudus en biologie moléculaire n’en est qu’à ses balbutiements. Pour bien comprendre le rôle biologique des gènes, l’étude des modèles d’expression des gènes à une résolution cellulaire est d’un grand intérêt. Dans l’organisme non-modèle Sipunculus nudus, la méthode ISH, qui est une méthode idéale pour détecter les modèles d’expression des gènes, n’a pas encore été établie. Son liquide coélomique contient plusieurs types de cellules, y compris les granulocytes, les cellules urne, les cellules vésiculaires, les cellules germinales, les érythrocytes,^etc. Le double sexe/mab-3 facteur de transcription connexe-1 (dmrt1), utilisé comme gène représentatif dans cette méthode, est un régulateur transcriptionnel fortement conservé de la détermination du sexe et de la différenciation chez la plupart des espèces allant des invertébrés aux mammifères^12,13. Dans une gamme d’espèces (c.-à-d. porgy noir, etc.) ¹⁴, dmrt1 a été exprimé dans les cellules Sertoli, entourant les cellules germinales, dont la fonction est similaire aux cellules trophoblastiques de Sipunculus nudus. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que dmrt1 de Sipunculus nudus est exprimé dans les cellules trophoblastiques de spermatozeugmata, et le résultat de la méthode ISH a clairement confirmé l’hypothèse.

Ce protocole décrit pour la première fois ISH, avec des sondes anti-arna anti-ense/sens étiquetées digoxigenin, pour déterminer les modèles d’expression de l’ARNm dans son frottis de fluide coélomique. Les conditions de réaction optimales sont fournies, qui permettent une visualisation très sensible de l’expression de l’ARNm à haute résolution. La méthode ISH développée pourrait être potentiellement appliquée chez plus d’espèces de Sipunculida autres que sipunculus nudus.

Protocole

La procédure animale a été approuvée par le Comité de soins et de bien-être des animaux de l’Université huaqiao.

1. Préparation de Riboprobe

1. Conception d’apprêt
   1. Ouvrez le programme Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copiez la séquence dmrt1 (GenBank : MK182259) dans la fenêtre de séquence.
   2. Définir la longueur de l’apprêt (23-25 bp), la température de fonte (55-60 oC) et le contenu G/C (40-60%). Cliquez sur Pick Primers.
      REMARQUE : La taille minimale requise pour la sonde ARN est d’environ 500 bp. Les sondes plus longues ont normalement une spécificité plus élevée.
   3. Ajoutez la séquence de promoteur de polymérase T7 RNA (5^, -TAATACGACTCACTATAGGG-3^,) à l’une des amorces sélectionnées. Les séquences d’amorce dmrt1 pour ISH sont indiquées dans le tableau 1.
      REMARQUE : Pour les sondes sens, le promoteur de polymérase à ARN T7 est situé à l’extrémité 5' des amorces avant. Pour les sondes antisense, le promoteur de polymérase T7 ARN est situé à l’extrémité 5'-extrémité des amorces inversées.
2. Amplification PCR
   1. Placez les tubes de microfuge sur la glace et préparez le mélange de réaction suivant (pour une réaction de 50 L) : 1x mélange de polymérase à l’ADN Taq, 1 g d’ADN (qui est préparé à partir de 100 l de liquide coélomique), 1 m d’apprêt avant, 1 m d’apprêt inversé et eau sans nucléase.
   2. Mélanger brièvement la réaction PCR par tuyauterie et centrifugeuse.
   3. Placez le tube de réaction dans un cycle thermique, et exécutez le PCR en utilisant les conditions suivantes : dénaturation initiale à 95 oC pendant 2 min suivie de 36 cycles de dénurescence à 95 oC pour 30 s, annealing à 55-60 oC pour 30 s, extension à 72 oC pour 30 s et une extension finale à 72 oC pour 7 min.
      REMARQUE : La température d’annealing doit être optimisée selon les amorces.
3. Purification et vérification des produits PCR
   1. Chargez le mélange de 50 L de PCR directement sur un gel d’agarose de 1 %. Exécuter le gel agarose à 150-180 V pendant 10 min en 0.5x TBE. Isolez les fragments d’ADN spécifiques du gel d’agarose de 1 %.
      REMARQUE : L’ADN doit apparaître comme une seule bande et non comme un frottis.
   2. Purifier les fragments d’ADN à l’aide d’un kit d’extraction de gel selon le protocole du fabricant. Quantifier les produits purifiés par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 260 nm.
   3. Vérifier l’authenticité des produits PCR par séquençage.
      REMARQUE : (Point de pause) Les produits PCR purifiés peuvent être stockés à -20 oC pendant plusieurs mois.
4. Synthèse Riboprobe
   1. Placez les tubes de microfuge sans RNase sur la glace et ajoutez ce qui suit au tube de microfuge (pour une réaction de 10 L) : 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x tampon de transcription, 0,5 L d’inhibiteurs de RNase, 1 L de polymérasés de l’ARN T7, 1 g de produit PCR et de l’eau sans RNase. Mélanger brièvement la réaction par tuyauterie et centrifugeuse. Incuber pendant 2 h à 37 oC.
   2. Ajouter 2 L de DNase I. sans RNase. Mélanger brièvement la réaction par tuyauterie et centrifugeuse. Incuber pendant 15 min à 37 oC.
   3. Ajouter 2 L 0,2 M EDTA (pH 8.0). Mélanger brièvement la réaction par tuyauterie et centrifugeuse.
   4. Ajouter 2,5 l de 4 M LiCl et 75 l’éthanol préchilled à la réaction ci-dessus. Bien mélanger. Laisser reposer 30 min à -70 oC.
   5. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Décant l’éthanol. Ajouter 1 ml d’éthanol précpiné à 70 % (v/v) et laver les précipitations en mélangeant doucement.
   6. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 5 min à 4 oC. Décanter l’éthanol de 70 % et sécher brièvement les précipitations près d’une lampe à alcool. Dissoudre les précipitations en ajoutant 30 L d’eau sans RNase et mélanger délicatement.
   7. Chargez 2 L d’ARN synthétisé sur un gel d’agarose de 1 %. Exécuter le gel agarose à 180 V pendant 5-10 min en 0.5x TBE. Mesurer la concentration de l’ARN étiqueté à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 260 nm.
      1. Utilisez des microfuges sans RNase et des conseils de filtre pour éviter la contamination par les RNase.
         REMARQUE : (point de pause) Les sondes étiquetées digoxygenine peuvent être stockées à -70 oC pendant plusieurs mois.

2. Collecte de fluides coélomiciques

1. Fixer les nudus S. sur la table de dissection avec des épingles. Ouvrez le corps des S. nudus avec de petits ciseaux autoclaved. Isoler le liquide coélomique avec une pipette.
2. Recueillir et transférer 1 mL de liquide coélomique à l’égard d’une pipette sur des lames de microscope traitées en polyD-lysine. Appliquer le liquide coélomique uniformément à l’égard d’une pointe de pipette. Sécher les lames à l’air pendant 1 h à 37 oC.

3. Hybridation in situ

1. Jour 1
   1. Réhydrabiliser les lames dans un bocal à coloration de la glissière contenant 100 ml de pyrocarbonate de diéthyle 1x traité de phosphate salin tamponné (DEPC-PBS). Réhydra 3 fois avec 1x DEPC-PBS, 5 min par lavage avec une agitation douce.
   2. Perméabiliser le frottis de liquide coélomique par digestion avec 10 g/mL proteinase K à température ambiante pendant 5 min. Incuber les glissières dans 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 20 minutes pour arrêter la digestion. Laver les diapositives en 1x DEPC-PBS avec une agitation douce pendant 5 min 3 fois.
   3. Ajouter 50 L de mélange d’hybridation (HM) contenant le sens/ riboprobe antisense sur les diapositives et ajouter un slip de couverture.
   4. Ajouter le tampon de boîte humide dans la boîte humide. Mettez les diapositives dans la boîte humide et scellez bien avec le film de paraffine. Hybrider la nuit (au moins 16 h) à 60 oC.
2. Jour 2
   1. Préchauffer le tampon de lavage à 65 oC. Immerger la glissière dans le pot de coloration de la diapositive contenant le tampon de lavage et laisser reposer jusqu’à ce que le coverlip glisse automatiquement. Il faut environ 5 min.
   2. Laver 2 fois avec un tampon de lavage à 65 oC, 30 min par lavage avec une agitation douce. Laver 2 fois avec un citrate salin-sodium (SSC) de 0,2x à 65 oC, 30 min par lavage avec une douce agitation. Laver 2 fois avec tampon d’acide mâle contenant Tween 20 (MABT) à température ambiante, 30 min par lavage avec une agitation douce.
   3. Incuber les toboggans à température ambiante pendant 3 à 4 h dans le tampon de blocage. Incuber les diapositives dans 1 mL anti-digoxigenin-AP Fab fragments solution diluée à 1/5000 avec le tampon de blocage à 4 oC pendant la nuit.
3. Jour 3
   1. Retirez la solution d’anticorps et lavez brièvement les diapositives dans LE MABT. Laver 4 fois avec LE MABT à température ambiante, 25 min par lavage avec une agitation douce.
   2. Incuber les lames avec tampon alcalin de phosphatase à température ambiante 3 fois, 5 min par lavage. Retirez le tampon alcalin phosphatase et ajoutez 1 ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)/nitro bleu tétrazolium (NBT) solution de colorant. Gardez les diapositives dans l’obscurité.
   3. Observez la réaction de couleur périodiquement sous un microscope optique. Lorsque la couleur est entièrement développée (temps de réaction dans la gamme de 1-4 h), laver les diapositives 2 fois avec MABT à température ambiante, 5 min par lavage avec une agitation douce.
   4. Laver 2 fois avec la solution d’arrêt à température ambiante, 15 min par lavage avec l’agitation douce. Incuber les lames dans le méthanol pour enlever l’excès de tache, à température ambiante pendant 30 min. Selon la couleur de fond, le lavage de méthanol peut être fait 2 ou 3 fois et le temps de décoloration peut être prolongé.
   5. Laver 2 fois avec MABT à température ambiante, 5 min par lavage avec une agitation douce. Transférer les diapositives sur un papier filtre frais. Ajouter 50 L de glycérol. Ajouter les coverlips et observer microscopiquement.
      REMARQUE : La composition de la solution est présentée dans le tableau 2.

Résultats

Un résumé des étapes de l’ISH est illustré dans la figure 1. Les riboprobes de sens et correspondants pour dmrt1 ont été synthétisés des produits de PCR amplifiés des cDNA fluides coelomic. L’authenticité des produits PCR a été vérifiée par séquençage direct. Riboprobes ont été synthétisés à l’aide de polymérases T7 ARN selon les protocoles du fabricant et un rapport précédent⁴ avec quelques modifications mineures. Les signaux re...

Discussion

Des études antérieures ont montré que l’ISH est adapté pour détecter plusieurs ARN cibles^16,17,18. Dans ce protocole, nous avons décrit une méthode ISH haute résolution pour détecter l’ARNm dans le fluide coélomique et mettre l’accent sur les conditions d’hybridation optimisées dans sipunculus nudus. Les signaux évidents de dmrt1 que nous avons observés ont démontré l’application réuss...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Biowest	111860
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments	Roche	11093274910
BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit	Beyotime	C3206
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Citric acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.	5949-29-1
Citric acid trisodium	Sinopharm Chemical Reagent Co.	4/3/6132
Coverslips	Beyotime	FCGF60
Deionized formamide	Amresco	12/7/1975
Diethyl pyrocarbonate, DEPC	Sigma	D5758	Noxious substance
Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix	Roche	11277073910
DNase I, RNase-free	Invitrogen	18047019
EDTA	Sigma	431788
Electrophoresis gel imaging	Bio-Rad	Universal Hood III
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	64-17-5
Gel extraction kits	Omega	D2500
Gel-electrophoresis apparatus	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	56-81-5
Glycine	Sigma	G5417
Heparin	Sigma	8/1/9041
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7447-40-7
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7778-77-0
LiCl	Sigma	203637
Maleic acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.	110-16-7
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	67-56-1	Noxious substance
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7786-30-3
Na2HPO4	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7558-79-4
NaCl	Biofount	JT0001
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent Co.	1310-73-2	Corrosive
Paraffin film	Bemis Company, Inc.	PM-996
Paraformaldehyde, PFA	Sigma	158127	Noxious substance
PCR Instrument	Life Technology	Proflex
Pins	Deli	16
Pipette	Eppendorf	plus G
Poly-D-lysine treated microscope slides	Liusheng	VER_A01
Proteinase K	Sigma	SRE0005
RNase free water	HyClone	SH30538. 02
RNase inhibitor	Roche	3335399001
S. nudus
Sheep serum	Beyotime	C0265
Slide staining jar	Beyotime	FG010
Slide storage box	Beyotime	FBX011
Small autoclaved scissors	Shuanglu	sku_8330
Spectrophotometers	Thermo Fisher	NanoDrop 2000/2000c
T7 RNA polymerases	Roche	10881767001
Taq DNA polymerase mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Tris HCl	Sigma	RES3098T
tRNA	Roche	10109517001
Tween-20	Sigma	P1379
Water bath	Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial	HH-S2