Hibridación in situ para Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Resumen

Este protocolo describe un enfoque eficaz de hibridación in situ para detectar los niveles de expresión de ARNm y los patrones espaciales de los genes diana en el líquido celómico Sipunculus nudus.

Resumen

La hibridación in situ (ISH) es una técnica muy informativa para presentar patrones de distribución celular de genes específicos (por ejemplo, ARNm y NCRNA) en los tejidos. El gusano sipunculid Sipunculus nudus es un recurso pesquero crucial, ya que tiene altos valores nutricionales y medicinales. Actualmente, la investigación sobre la biología molecular de Sipunculus nudus todavía está en su infancia. El propósito de este artículo es desarrollar un método sensible para localizar un ARNm específico en sipunculus nudus líquido celómico. El protocolo incluye pasos detallados de la ISH, incluyendo la preparación de ribosondas con nombre digoxigenina y de sentido, la recolección de fluidos celómicos y la preparación de secciones, la hibridación ribosondas específicas, la incubación de anticuerpos, la coloración y los tratamientos posteriores a la coloración. Se muestran los resultados representativos obtenidos de un experimento exitoso con este método. El protocolo también debe ser aplicable a otras especies de Sipuncula.

Introducción

Ish, utilizando una sonda de ácido nucleico etiquetada para detectar la secuencia específica de ADN o ARN de interés, es un método útil para describir el patrón de expresión espacial de genes diana en tejidos morfológicamente preservados^1,2,3. Normalmente, la secuencia diana es generada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y luego se utiliza como plantilla para sintetizar la sonda de ARN antisentido/sentido etiquetada con digoxigenina uridina-5'-trifosfato. Las muestras se fijan y permeabilizan antes de la incubación con ribosondas. Después de lavar el exceso de sonda, la hibridación es visualizada por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-digoxigenina, que es fosfatasa alcalina conjugada^3,4,5,6.

Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; order Sipunculida: Sipunculidae) es un gusano marino no segmentado, coelomate y bilateralmente simétrico^7,8. Sipunculus nudus es una especie cosmopolita ampliamente distribuida en aguas costeras tropicales y templadas. También es un importante recurso pesquero marino en el sur de China debido a sus altos valores nutricionales y medicinales^9,,10. Sin embargo, Sipunculus nudus en biología molecular todavía está en su infancia. Para entender plenamente el papel biológico de los genes, la investigación de los patrones de expresión de genes a una resolución celular es de gran interés. En el organismo no modelo Sipunculus nudus, el método ISH, que es un método ideal para detectar los patrones de expresión de genes, aún no se ha establecido. Su líquido celómico contiene varios tipos de células, incluyendo granulocitos, células de urna, células vesiculares, células germinales, eritrocitos, etc^11. El doble factor de transcripción relacionado con el sexo/mab-3(dmrt1),utilizado como gen representativo en este método, es un regulador transcripcional altamente conservado de la determinación y diferenciación del sexo en la mayoría de las especies que van desde invertebrados hasta mamíferos^12,,13. En una gama de especies (es decir, porgy negro, etc.) ¹⁴, dmrt1 se expresó en las células sertoli, rodeando las células germinales, cuya función es similar a las células trofoblastos de Sipunculus nudus. Por lo tanto, hipotetizaron que dmrt1 de Sipunculus nudus se expresa en células trofoblastos de espermatozoides, y el resultado del método ISH confirmó claramente la hipótesis.

Este protocolo describe por primera vez la ISH, con sondas de ARNm antisentido/sentido con etiqueta digoxigenina, para determinar los patrones de expresión de ARNm en su frotis de fluido coelómico. Se proporcionan las condiciones óptimas de reacción, que permiten una visualización muy sensible de la expresión de ARNm a alta resolución. El método ISM desarrollado podría aplicarse potencialmente en más especies de Sipunculida distintas de Sipunculus nudus.

Protocolo

El procedimiento animal fue aprobado por el Comité de Cuidado y Bienestar Animal de la Universidad de Huaqiao.

1. Preparación de ribosondas

1. Diseño de imprimación
   1. Abra el programa Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copie la secuencia dmrt1 (GenBank: MK182259) en la ventana de secuencia.
   2. Ajuste la longitud de imprimación (23-25 bp), la temperatura de fusión (55-60 oC) y el contenido de G/C (40-60%). Haga clic en Seleccionar imprimaciones.
      NOTA: El tamaño mínimo requerido para la sonda de ARN es de aproximadamente 500 bp. Las sondas más largas normalmente tienen mayor especificidad.
   3. Agregue la secuencia promotora de la polimerasa de ARN T7 (5^, -TAATACGACTCACTATAGGG-3^,) a una de las imprimaciones seleccionadas. Las secuencias de imprimación dmrt1 para ISH se muestran en la Tabla 1.
      NOTA: Para las sondas de detección, el promotor de la polimerasa de ARN T7 se encuentra en el extremo de 5' de las imprimaciones delanteras. Para las sondas antisentido, el promotor de la polimerasa de ARN T7 se encuentra en el extremo 5 de las imprimaciones inversas.
2. Amplificación de PCR
   1. Colocar los tubos de microfúctil sobre hielo y preparar la siguiente mezcla de reacción (para una reacción de 50 l): 1 mezcla de ADN polimerasa Taq, 1 g de ADNc (que se prepara a partir de 100 ml de líquido celómico), imprimación delantera de 1 m, imprimación inversa de 1 m y agua libre de nucleasas.
   2. Mezcle brevemente la reacción de PCR pipeteando y centrífuga.
   3. Colocar el tubo de reacción en un ciclor térmico, y ejecutar el PCR utilizando las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 oC durante 2 min seguida de 36 ciclos de desnaturalización a 95 oC durante 30 s, recocido a 55-60 oC para 30 s, extensión a 72 oC para 30 s y una extensión final a 72 oC durante 7 min.
      NOTA: La temperatura de recocido debe optimizarse de acuerdo con las imprimaciones.
3. Purificación y verificación de productos PCR
   1. Cargue la mezcla de PCR de 50 ml directamente sobre un gel de agarosa del 1%. Ejecute el gel de agarosa a 150-180 V durante 10 min en 0.5x TBE. Aísle los fragmentos específicos de ADN del gel de agarosa del 1%.
      NOTA: El ADN debe aparecer como una sola banda y no como un frotis.
   2. Purificar los fragmentos de ADN utilizando un kit de extracción de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuantificar los productos purificados mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 260 nm.
   3. Verifique la autenticidad de los productos PCR por secuenciación.
      NOTA: (Punto de pausa) Los productos de PCR purificados se pueden almacenar a -20 oC durante varios meses.
4. Síntesis de ribosondas
   1. Coloque los tubos de microfúgelos libres de RNase sobre hielo y añada lo siguiente al tubo de microfúge (para una reacción de 10 l): 1 x mezcla de etiquetado de ARN Digoxygenin, 1 tampón de transcripción de 1x, 0,5 l de inhibidores de la RNase, 1 l de polimerasas de ARN T7, 1 g de producto de PCR y agua libre de rnalos. Mezcle brevemente la reacción pipeteando y centrífuga. Incubar durante 2 h a 37oC.
   2. Añadir 2 l de DNase I libre de RNase. Mezclar brevemente la reacción pipeteando y centrífuga. Incubar durante 15 min a 37oC.
   3. Añadir 2 sL 0,2 M EDTA (pH 8.0). Mezcle brevemente la reacción pipeteando y centrífuga.
   4. Añadir 2,5 ml de LiCl de 4 M y 75 ml de etanol preenfriado a la reacción anterior. Mezcla bien. Dejar actuar durante 30 min a -70oC.
   5. Centrífuga a 12.000 x g durante 10 min a 4oC. Decantar el etanol. Añadir 1 ml de etanol preenfriado al 70% (v/v) y lavar la precipitación mezclando suavemente.
   6. Centrífuga a 12.000 x g durante 5 min a 4oC. Decantar el 70% de etanol y secar la precipitación brevemente cerca de una lámpara de alcohol. Disuelve la precipitación añadiendo 30 ml de agua libre de RNase y mezcle suavemente.
   7. Cargar 2 ml de ARN sintetizado en un gel de agarosa del 1%. Ejecute el gel de agarosa a 180 V durante 5-10 min en 0.5x TBE. Mida la concentración del ARN etiquetado utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm.
      1. Utilice tubos de microfusión libres de RNase y puntas de filtro para evitar la contaminación de RNase.
         NOTA: (Punto de pausa) Las sondas etiquetadas con digoxigenina se pueden almacenar a -70 oC durante varios meses.

2. Recolección de fluidos coelómicos

1. Fije el S. nudus en la mesa de disección con alfileres. Abra el cuerpo del S. nudus con pequeñas tijeras autoclave. Aísle el líquido celómico con una pipeta.
2. Recoger y transferir 1 ml de líquido coelómico con una pipeta a diapositivas de microscopio tratadas con poli-D-lisina. Aplique el líquido celómico uniformemente con una punta de pipeta. Seque los portaobjetos durante 1 h a 37oC.

3. Hibridación in situ

1. Día 1
   1. Rehidrata los portaobjetos en un frasco de tinción deslizante que contiene 100 ml de 1 x solución salina tamponada con fosfato tratado con pirocarbonato de dietil (DEPC-PBS). Rehidratar 3 veces con 1x DEPC-PBS, 5 min por lavado con agitación suave.
   2. Permeabilizar el frotis de líquido celómico por digestión con 10 g/ml de proteinasa K a temperatura ambiente durante 5 min. Incubar los portaobjetos en 4% paraformaldehído (PFA) durante 20 minutos para detener la digestión. Lave los portaobjetos en 1x DEPC-PBS con agitación suave durante 5 min 3 veces.
   3. Añadir 50 l de mezcla de hibridación (HM) que contiene la ribosondas sentido/antisentido en las diapositivas y añadir un resbalón de cubierta.
   4. Agregue el tampón de la caja húmeda a la caja húmeda. Coloque las diapositivas en la caja húmeda y selle bien con película de parafina. Hibridación durante la noche (al menos 16 h) a 60oC.
2. Día 2
   1. Precalentar el tampón de lavado a 65 oC. Sumerja la diapositiva en el frasco de tinción de la diapositiva que contiene el tampón de lavado y déjelo reposar hasta que el cubreobjetos se deslice automáticamente. Se tarda unos 5 minutos.
   2. Lavar 2 veces con tampón de lavado a 65oC, 30 min por lavado con agitación suave. Lavar 2 veces con un citrato de solución salina-sodio (SSC) a 65oC, 30 min por lavado con una agitación suave. Lavar 2 veces con tampón de ácido maleico que contiene Tween 20 (MABT) a temperatura ambiente, 30 min por lavado con agitación suave.
   3. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 3-4 h en el tampón de bloqueo. Incubar las diapositivas en 1 ml de solución de fragmentos antidigoxigenina-AP Fab diluido a 1/5000 con el tampón de bloqueo a 4oC durante la noche.
3. Día 3
   1. Retire la solución de anticuerpos y lave los portaobjetos brevemente en MABT. Lavar 4 veces con MABT a temperatura ambiente, 25 minutos por lavado con agitación suave.
   2. Incubar los portaobjetos con tampón de fosfatasa alcalina a temperatura ambiente 3 veces, 5 min por lavado. Retire el tampón de fosfatasa alcalina y agregue 1 ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolyl fosfato (BCIP)/nitro azul tetrazolium (NBT) solución de tinción. Mantenga las diapositivas en la oscuridad.
   3. Observe la reacción del color periódicamente bajo un microscopio óptico. Cuando el color esté completamente desarrollado (tiempo de reacción en el rango de 1-4 h), lave los portaobjetos 2 veces con MABT a temperatura ambiente, 5 min por lavado con agitación suave.
   4. Lavar 2 veces con solución de parada a temperatura ambiente, 15 minutos por lavado con agitación suave. Incubar los portaobjetos en metanol para eliminar el exceso de manchas, a temperatura ambiente durante 30 min. De acuerdo con el color de fondo, el lavado de metanol se puede hacer 2 o 3 veces y el tiempo de decoloración se puede extender.
   5. Lavar 2 veces con MABT a temperatura ambiente, 5 min por lavado con agitación suave. Transfiera las diapositivas a un papel de filtro nuevo. Añadir 50 s de glicerol. Agregue los labios de las cubiertas y observe microscópicamente.
      NOTA: La composición de la solución se muestra en la Tabla 2.

Resultados

En la Figura 1se ilustra un resumen de los pasos implicados en la ISH. Las ribosondas de sentido antisentido y correspondientes para dmrt1 se sintetizaron a partir de productos PCR amplificados a partir de los cDNA de fluido celómico. La autenticidad de los productos de ITP se verificó mediante la secuenciación directa. Las ribosondas se sintetizaron utilizando polimerasas de ARN T7 de acuerdo con los protocolos del fabricante y un informe anterior⁴ con al...

Discusión

Estudios anteriores mostraron que la ISH es adecuada para detectar múltiples ARN objetivo^16,17,18. En este protocolo, describimos un método ISH de alta resolución para detectar el ARNm en fluido celómico y enfatizar las condiciones de hibridación optimizadas en Sipunculus nudus. Las señales obvias de dmrt1 que observamos demostraron la aplicación exitosa de este protocolo en la detección de la expresió...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Biowest	111860
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments	Roche	11093274910
BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit	Beyotime	C3206
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Citric acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.	5949-29-1
Citric acid trisodium	Sinopharm Chemical Reagent Co.	4/3/6132
Coverslips	Beyotime	FCGF60
Deionized formamide	Amresco	12/7/1975
Diethyl pyrocarbonate, DEPC	Sigma	D5758	Noxious substance
Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix	Roche	11277073910
DNase I, RNase-free	Invitrogen	18047019
EDTA	Sigma	431788
Electrophoresis gel imaging	Bio-Rad	Universal Hood III
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	64-17-5
Gel extraction kits	Omega	D2500
Gel-electrophoresis apparatus	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	56-81-5
Glycine	Sigma	G5417
Heparin	Sigma	8/1/9041
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7447-40-7
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7778-77-0
LiCl	Sigma	203637
Maleic acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.	110-16-7
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	67-56-1	Noxious substance
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7786-30-3
Na2HPO4	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7558-79-4
NaCl	Biofount	JT0001
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent Co.	1310-73-2	Corrosive
Paraffin film	Bemis Company, Inc.	PM-996
Paraformaldehyde, PFA	Sigma	158127	Noxious substance
PCR Instrument	Life Technology	Proflex
Pins	Deli	16
Pipette	Eppendorf	plus G
Poly-D-lysine treated microscope slides	Liusheng	VER_A01
Proteinase K	Sigma	SRE0005
RNase free water	HyClone	SH30538. 02
RNase inhibitor	Roche	3335399001
S. nudus
Sheep serum	Beyotime	C0265
Slide staining jar	Beyotime	FG010
Slide storage box	Beyotime	FBX011
Small autoclaved scissors	Shuanglu	sku_8330
Spectrophotometers	Thermo Fisher	NanoDrop 2000/2000c
T7 RNA polymerases	Roche	10881767001
Taq DNA polymerase mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Tris HCl	Sigma	RES3098T
tRNA	Roche	10109517001
Tween-20	Sigma	P1379
Water bath	Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial	HH-S2