시분큘러스 누두스 Coelomic 유체에 대한 시투 혼성화

요약

이 프로토콜은 시분큘러스 누두스 coelomic 유체에서 표적 유전자의 mRNA 발현 수준 및 공간 패턴을 검출하는 situ 혼성화 접근법에 효과적인 설명한다.

초록

기업에서 혼성화(ISH)는 조직에서 특정 유전자(예를 들어, mRNA 및 ncRNA)의 세포 분포 패턴을 제시하는 매우 유익한 기술이다. 시펀큘리드 웜 시분큘러스 누두스는 영양및 약용 가치가 높기 때문에 중요한 어업 자원입니다. 현재, Sipunculus nudus의 분자 생물학에 대한 연구는 아직 초기 단계에 있습니다. 이 문서의 목적은 시분큘러스 누두스 coelomic 유체에서 특정 mRNA를 국소화하기 위한 민감한 방법을 개발하는 것이다. 이 프로토콜에는 디곡시제닌 표지된 안티센스 및 센스 리보프로브 제제, coelomic 유체 수집 및 섹션 준비, 특정 리보프로퍼 혼성화, 항체 배양, 착색 및 착색 후 처리를 포함한 ISH의 상세한 단계가 포함됩니다. 이 방법을 사용하여 성공적인 실험에서 얻은 대표적인 결과가 입증됩니다. 프로토콜뿐만 아니라 다른 시분큘라 종에 적용 할 수 있어야합니다.

서문

ISH는, 표지된 핵산 프로브를 이용하여 관심 있는 특정 DNA 또는 RNA 서열을 검출하고, 형태학적으로 보존된 조직^{1,,2,,3에서}표적 유전자의 공간 발현 패턴을 설명하는 유용한 방법이다. 일반적으로, 표적 서열은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성되고, 디곡시겐린 뇨딘-5'-삼인산염으로 표지된 안티센스/센스 RNA 프로브를 합성하기 위한 템플릿으로 사용된다. 샘플은 리보프로브로 배양하기 전에 고정되고 투과됩니다. 과잉 프로브를 세척 한 후, 혼성화는 알칼리 성 인산염 - 공액^{3,,4,,5,,6인}항 디그산소인 항체를 사용하여 면역 조직 화학에 의해 시각화됩니다.

시분큘러스 누두스(Phylum Sipuncula; 주문 시분쿨리다: 시분큘리대)는 세분화되지 않은, coelomate 및 양측 대칭해양 벌레

프로토콜

동물 절차는 화차오 대학의 동물 관리 및 복지위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 리보프로브 준비

1. 프라이머 디자인
   1. 프로그램 프라이머 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)를 엽니 다. dmrt1 시퀀스(GenBank: MK182259)를 시퀀스 창에 복사합니다.
   2. 설정 프라이머 길이 (23-25 bp), 용융 온도 (55-60 ° C), 및 G / C 함량 (40-60%). 프라이머 선택을클릭합니다.
      참고: RNA 프로브에 필요한 최소 크기는 약 500 bp입니다.
   3. T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열(5, -TAATACGCACTATAGGG-3) 을 선택된 프라이머 중 하나에 첨가한다.^, ISH에 대한 dmrt1 프라이머 서열은 표 1에나타내고 있습니다.
      참고: 센스 프로브의 경우, T7 RNA 폴리머라제 프로모터는 5' 전달 프라이머의 끝에 위치합니다. 안티센스 프로브의 경우, T7 RNA 폴리머라제 프로모터는 역프라이머의 5'-끝에 위치한다.
2. P

결과

ISH와 관련된 단계에 대한 요약은 그림 1에나와 있습니다. dmrt1에 대한 안티센스 및 상응하는 감각 리보프로브는 COELOMIC 유체 cDNAs로부터 증폭된 PCR 제품으로부터 합성되었다. PCR 제품의 진위는 직접 시퀀싱을 통해 확인되었습니다. 리보프로브는 제조사의 프로토콜및 이전 보고서^4에 따라 T7 RNA 폴리머라제와 약간의 수정을 사용하여 합성되었다. ISH의 ?...

토론

이전 연구는 ISH가 다중 표적 RNA^{16,,17,,18을}검출하기에 적합하다는 것을 보여주었다. 이 프로토콜에서, 우리는 coelomic 액체에 있는 mRNA를 검출하고 Sipunculus nudus에 있는 최적화된 혼성화 조건을 강조하는 고분해능 ISH 방법을 기술했습니다. 우리가 관찰한 dmrt1의 명백한 신호는 유전자 발현의 검출에서 이 프로토콜의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Biowest	111860
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments	Roche	11093274910
BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit	Beyotime	C3206
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Citric acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.	5949-29-1
Citric acid trisodium	Sinopharm Chemical Reagent Co.	4/3/6132
Coverslips	Beyotime	FCGF60
Deionized formamide	Amresco	12/7/1975
Diethyl pyrocarbonate, DEPC	Sigma	D5758	Noxious substance
Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix	Roche	11277073910
DNase I, RNase-free	Invitrogen	18047019
EDTA	Sigma	431788
Electrophoresis gel imaging	Bio-Rad	Universal Hood III
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	64-17-5
Gel extraction kits	Omega	D2500
Gel-electrophoresis apparatus	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	56-81-5
Glycine	Sigma	G5417
Heparin	Sigma	8/1/9041
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7447-40-7
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7778-77-0
LiCl	Sigma	203637
Maleic acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.	110-16-7
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	67-56-1	Noxious substance
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7786-30-3
Na2HPO4	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7558-79-4
NaCl	Biofount	JT0001
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent Co.	1310-73-2	Corrosive
Paraffin film	Bemis Company, Inc.	PM-996
Paraformaldehyde, PFA	Sigma	158127	Noxious substance
PCR Instrument	Life Technology	Proflex
Pins	Deli	16
Pipette	Eppendorf	plus G
Poly-D-lysine treated microscope slides	Liusheng	VER_A01
Proteinase K	Sigma	SRE0005
RNase free water	HyClone	SH30538. 02
RNase inhibitor	Roche	3335399001
S. nudus
Sheep serum	Beyotime	C0265
Slide staining jar	Beyotime	FG010
Slide storage box	Beyotime	FBX011
Small autoclaved scissors	Shuanglu	sku_8330
Spectrophotometers	Thermo Fisher	NanoDrop 2000/2000c
T7 RNA polymerases	Roche	10881767001
Taq DNA polymerase mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Tris HCl	Sigma	RES3098T
tRNA	Roche	10109517001
Tween-20	Sigma	P1379
Water bath	Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial	HH-S2