Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר יעיל באתר היברידיזציה באתרו כדי לזהות את רמות ביטוי mRNA ודפוסי מרחבית של גנים היעד בנוזל הסיפונקולוס nuomic .

Abstract

באתרו היברידיזציה (ISH) היא טכניקה מאוד אינפורמטיבי להציג דפוסי הפצה תאית של גנים ספציפיים (g., mRNA ו ncRNA) ברקמות. התולעת הסיפנעית מהווה משאב-דיג מכריע, שכן הוא בעל ערכי תזונה ומרפא גבוהים. כיום, המחקר על הביולוגיה המולקולרית של סיפונקולוס נודוס עדיין בחיתוליו. מטרת מאמר זה היא לפתח שיטה רגישה לאיתור mRNA מסוים בנוזל הסיפונקולוס nudus . הפרוטוקול כולל צעדים מפורטים של ISH, כולל digoxigenin-התווית אנטי הגיוני הכנה החלקה, לאסוף נוזלים קולוממית והכנה מקטע, הכלאה החוצה באופן ספציפי, הדגירה הנוגדן, צבע ושלאחר צבע טיפולים. תוצאות הנציג שהתקבלו מניסוי מוצלח באמצעות שיטה זו מומחש. הפרוטוקול צריך להיות רלוונטי גם. למינים אחרים של האחרים

Introduction

ISH, באמצעות בדיקה חומצה גרעין בתווית כדי לזהות את ה-DNA הספציפי או רצף RNA של עניין, היא שיטה שימושית כדי לתאר את תבנית הביטוי המרחבי של גנים היעד ברקמות שנשמרו מורפולוגית1,2,3. בדרך כלל, רצף היעד מופק על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ולאחר מכן משמש כתבנית כדי לסנתז את antisense/תחושה RNA בדיקה מתויג עם digoxigenin uridine-5'-triphosphate. הדגימות קבועות ומופרחות לפני הדגירה. לאחר שטיפת המקדח עודף, היברידיזציה היא דמיינו על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן אנטי digoxygenin, שהוא בסיסי פוספטאז-מצומת3,4,5,6.

סיפונקולוס נודוס (מאכל שמנת; הזמנת סיקולידה: סיפונקולרוב) היא תולעת מחולקת, קומטואט ובקיעים ימית של התולעים7,8. סיפונקולוס נודוס הוא זן קוסמופוליטי המופץ באופן נרחב במימי חוף טרופיים וממוזגים. זהו גם משאב הדיג הימי החשוב בדרום סין בשל ערכי התזונה והמרפא הגבוהים שלה9,10. עם זאת, הסיפונקולוס נודוס בביולוגיה מולקולרית עדיין בחיתוליו. כדי להבין באופן מלא את התפקיד הביולוגי של הגנים, החקירה של ביטויים גנים דפוסי ברזולוציה תאית הוא מעניין מאוד. באורגניזם הלא מודל Sipunculus nudus, השיטה ISH, שהיא שיטה אידיאלית כדי לזהות את דפוסי הביטוי גנים, עדיין לא הוקם. נוזל קולאומית שלו מכיל מספר סוגי תאים, כולל גרנולוציטים, בתאי urn, תאים vesicular תאי הנבט, אריתרופוציטים, וכו '11. מין כפול/mab-3 מקדם התעתיק הקשור-1 (dmrt1), משמש כג מייצג בשיטה זו, הוא מווסת הטרנססקריפט שימור מאוד של קביעת מין ובידול ברוב המינים החל מיצורים חסרי חוליות ליונקים12,13. במגוון מינים (כלומר, פורגיה שחורה וכו ') 14, dmrt1 ביטא בתאי sertoli, סביב התאים נבטי, שתפקידם דומה לתאי הפיצוץ של סיפונקולוס nudus. לכן, אנו שיערו שdmrt1 של הסידקולוס נודוס באה לידי ביטוי בתאי הפיצוץ של spermatozeugmata, והתוצאה של שיטת ISH אישרה בבירור את ההשערה.

פרוטוקול זה בפעם הראשונה מתאר ISH, עם digoxigenin-התווית אנטי sense/תחושה mRNA, כדי לקבוע דפוסי ביטוי mRNA במכתם נוזל קולאומית שלה. תנאי התגובה האופטימליים מסופקים, המאפשרים הדמיה מאוד רגישה של ביטוי mRNA ברזולוציה גבוהה. שיטת ה-ISH המפותחת יכולה להיות מיושמת בעוד מינים של סיפונקולידה מלבד סיפנקולוס נודוס.

Protocol

נוהל בעלי החיים אושר על ידי ועדת הבריאות והרווחה של אוניברסיטת Huaqao.

1. הכנה לריבוחלוק

  1. פריימר עיצוב
    1. פתח את התוכנית פריימר 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). העתק את רצף dmrt1 (genbank: MK182259) לתוך חלון הרצף.
    2. הגדר אורך פריימר (23-25 bp), טמפרטורת ההיתוך (55-60 ° c), ו-G/C תוכן (40-60%). לחץ על בחר התחל.
      הערה: הגודל המינימלי הנדרש עבור בדיקה RNA הוא כ 500 bp. הבדיקות הארוכות בדרך כלל כוללים ספציפיות יותר.
    3. הוסיפו את רצף המקדם של T7 RNA פולימראז (5, -taאטקg, טטקקאכא2-3,) לאחד מצבעי היסוד שנבחרו. רצפי dmrt1 פריימר עבור ISH מוצגים בטבלה 1.
      הערה: לבדיקות הגיוניות, היזם T7 RNA פולימראז ממוקם בקצה של 5 התחל הקדמי. עבור בדיקה נגד היגיון, היזם T7 RNA פולימראז ממוקם ב 5 '-סוף של התחל לאחור.
  2. הגברה הPCR
    1. מניחים את הצינורות microfuge על הקרח, ולהכין את תערובת התגובה הבאה (עבור התגובה μL 50): 1x Taq DNA פולימראז לערבב, 1 μg של cDNA (אשר מוכן 100 μL של נוזל קולוממית), 1 μM קדימה פריימר, 1 μM הפוכה פריימר ו nuclease מים ללא.
    2. מערבבים את תגובת ה-PCR באמצעות ליטוף וצנטריפוגה בקצרה.
    3. מניחים את צינור התגובה ב ציקלייר תרמית, ולהפעיל את ה-PCR באמצעות התנאים הבאים: דנטורציה הראשונית ב 95 ° c עבור 2 דקות ואחריו 36 מחזורים של דנטורציה ב 95 ° צ' עבור 30 s, ריפוי ב 55-60 ° c עבור 30, הארכה בשעה 72 ° צלזיוס עבור 30 ו הארכה הסופית בשעה 72 °
      הערה: טמפרטורת הריפוי צריכה להיות ממוטבת לפי התחל.
  3. מוצר הטיהור והאימות של מוצרי PCR
    1. לטעון את 50 μL של התערובת PCR ישירות על 1% agarose ג'ל. הפעל את ג'ל agarose ב 150-180 V עבור 10 דקות ב 0.5 x TBE. בודד את קטעי ה-DNA הספציפיים מ 1% הצמח ג'ל.
      הערה: הדנ א אמור להופיע כלהקה אחת ולא ככתם.
    2. לטהר את קטעי ה-DNA באמצעות ערכת החילוץ ג'ל על פי פרוטוקול של היצרן. לכמת את המוצרים מטוהרים ידי ספקטרופוטומטר באורך גל של 260 ננומטר.
    3. בדוק את אמיתות מוצרי ה-PCR לפי רצף.
      הערה: (נקודת השהיה) ניתן לאחסן את מוצרי ה-PCR המטוהרים ב-20 ° c במשך מספר חודשים.
  4. סינתזה של ריבוגלימה
    1. מניחים את RNase-microfuge לשחרר את הצינורות על קרח, ולהוסיף את הבאות לצינור microfuge (עבור התגובה 10 μL): 1x Digoxygenin-RNA תיוג שילוב, 1x שעתוק מאגר, 0.5 μL של מעכבי RNase, 1 μL של T7 RNA פולימס, 1 μg של המוצר PCR ערבב את התגובה על ידי ליטוף וצנטריפוגה בקצרה. דגירה עבור 2 h ב 37 ° c.
    2. הוסף 2 μL של RNase-חינם DNase לערבב את התגובה על ידי ליטוף וצנטריפוגה בקצרה. דגירה של 15 דקות ב 37 ° c.
    3. הוסף 2 μL 0.2 M EDTA (pH 8.0). ערבב את התגובה על ידי ליטוף וצנטריפוגה בקצרה.
    4. הוסף 2.5 μL של 4 M LiCl ו 75 μL של אתנול מקורר לתגובה לעיל. . תערבב היטב השאירו 30 דקות ב-70 ° c.
    5. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. . מדקלת את האתנול הוסף 1 מ ל של מקורר 70% אתנול (v/v) ולשטוף את המשקעים על ידי ערבוב בעדינות.
    6. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. Decant 70% אתנול ויבש את המשקעים בקצרה ליד מנורת אלכוהול. מתמוסס את המשקעים על ידי הוספת 30 μL של מים ללא RNase-חינם ולערבב בעדינות.
    7. טען 2 μL של רנ א מסונתז על 1% צמח ג'ל. הפעל את ג'ל agarose ב 180 V עבור 5-10 דקות ב 0.5 x TBE. למדוד את הריכוז של ה-RNA שכותרתו באמצעות ספקטרוסקופיה באורך גל של 260 ננומטר.
      1. השימוש RNase-microfuge בחינם צינורות וטיפים מסנן כדי למנוע זיהום RNase.
        הערה: (נקודת הפסקה) ניתן לאחסן את הבדיקות המסומנות ב-digoxygenin-70 ° c במשך מספר חודשים.

2. אוסף נוזלים קולאומית

  1. . תקן את ס. נודוס על שולחן הניתוח עם סיכות פתח את גופתו של ה . nudus עם מספריים אוטוקליים קטנים. בודד את נוזל קולוממית עם פיפטה.
  2. לאסוף ולהעביר 1 mL הנוזל קולוממית עם פיפטה כדי פולי-D-ליזין מיקרוסקופ שקופיות. החל את הנוזל הקולאומית באופן שווה עם טיפ פיפטה. מייבשים את השקופיות ב-37 ° c.

3. באתרו היברידיזציה

  1. היום הראשון
    1. מימה מחדש את השקופיות בצנצנת מכתים שקופית המכילה 100 mL של מלוחים באגירה מפוספז של 1x דיאתיל פירוקרבונט (depc-PBS). מייבשים 3 פעמים עם 1 x DEPC-PBS, 5 דקות לכל כביסה עם עצבנות עדינה.
    2. החדירות הכתם של נוזל קולוממית על ידי עיכול עם 10 μg/mL פרוטטינואז K בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. מארג השקופיות ב 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) עבור 20 דקות כדי לעצור את העיכול. שטוף את השקופיות ב-1x-PBS עם עצבנות עדינה למשך 5 דקות 3 פעמים.
    3. הוסף 50 μL של תערובת היברידיזציה (HM) המכילה את הגלימה של התחושה/החושים על השקופיות והוסף תגית כיסוי.
    4. הוסף מאגר תיבות רטובות לתוך התיבה הרטובה. שים את השקופיות לתוך הקופסה רטוב לאטום היטב עם סרט פרפין. Hybridize לילה (לפחות 16 h) ב 60 ° c.
  2. היום השני
    1. מחממים את מאגר הכביסה ב-65 ° c. הישאב את השקופית לצנצנת המכתים שקופיות המכילה את מאגר הכביסה והעמד אותו עד להצגת השקופיות באופן אוטומטי. . זה לוקח בערך 5 דקות
    2. רוחצים 2 פעמים עם מאגר כביסה ב 65 ° c, 30 דקות לכביסה עם עצבנות עדינה. רוחצים 2 פעמים עם מלוחים של 0.2 x-נתרן ציטראט ב65 ° c, 30 דקות לכביסה בעצבנות עדינה. שטוף 2 פעמים עם מאגר חומצה מלפימית המכילה את הטמפרטורה 20 (מאבטי) בטמפרטורת החדר, 30 דקות לכביסה בעצבנות עדינה.
    3. מודיית את השקופיות בטמפרטורת החדר עבור 3 – 4 h במאגר חסימת. מודלת את השקופיות ב-1 mL anti-digoxigenin-AP שברי הפתרון מדולל ב 1/5000 עם מאגר חסימת ב 4 ° c לילה.
  3. היום השלישי
    1. הסר את פתרון הנוגדן ושטוף את השקופיות לזמן קצר ב-מאבט. שטפו 4 פעמים עם מאבט בטמפרטורת החדר, 25 דקות לכביסה בעצבנות עדינה.
    2. מודאת השקופיות עם מאגר פוספספטאז אלקליין בטמפרטורת החדר 3 פעמים, 5 דקות לכביסה. להסיר את מאגר פוספספטאז בסיסי, ולהוסיף 1 מ ל 5-bromo-4-כלורט-3-indolyl פוספט (BCIP)/ניטרו כחול הטטרזויום (NBT) כתמים הפתרון. . שמור את השקופיות בחושך
    3. שימו לב לתגובת הצבע מידי פעם תחת מיקרוסקופ אופטי. כאשר הצבע מפותח במלואו (זמן התגובה בטווח של 1-4 h), שטוף את השקופיות 2 פעמים עם מייבט בטמפרטורת החדר, 5 דקות לכביסה בעצבנות עדינה.
    4. שטוף 2 פעמים עם פתרון הפסקה בטמפרטורת החדר, 15 דקות לכביסה עם עצבנות עדינה. דגירה את השקופיות ב מתנול להסיר כתם עודף, בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות. על פי צבע הרקע, שטיפת מתנול יכול להיעשות 2 או 3 פעמים את הזמן decolorization ניתן להאריך.
    5. שטוף 2 פעמים עם מאבט בטמפרטורת החדר, 5 דקות לכביסה עם עצבנות עדינה. העבר את השקופיות לנייר סינון טרי. הוסף 50 μL של גליצרול. הוסף את הכיסויים ובדוק את המיקרוסקוזה.
      הערה: הרכב הפתרון מופיע בטבלה 2.

תוצאות

סיכום השלבים המעורבים ב-ISH מומחש באיור 1. Antisense ואת התחושה המתאימה riboprobes עבור dmrt1 היו מסונתז מ-PCR מוצרים הוגדל מתוך cdomic נוזלים. האותנטיות של מוצרי ה-PCR אומתה באמצעות רצף ישיר. ריבוגלימות היו מסונתז באמצעות T7 RNA פולימות לפי פרוטוקולי היצרן ודוח קודם4 עם כמה שינ?...

Discussion

מחקרים קודמים הראו כי איש מתאים לזיהוי מרובים rnas מטרה16,17,18. בפרוטוקול זה, תיארנו שיטת ISH ברזולוציה גבוהה כדי לאתר את ה-mRNA בנוזל הקולאומית ולהדגיש את תנאי הכלאה הממוטבים בסיפונקולוס נודוס. האותות הברורים של dmrt1 הבחנו ביישום מוצלח ?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי קרן המדענים הצעירים של הארגון הלאומי למדעי הטבע של סין (גרנט No. 31801034), הקרן המדע הטבעי של מחוז פוג'יין, סין (2016J01161), קרנות המחקר המדעי של אוניברסיטת Huaqiao (15BS306) ו פוסט בוגרי הקרן החדשנית מחקר מדעי של אוניברסיטת Huaqao

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseBiowest111860
Anti-digoxigenin-AP Fab fragmentsRoche11093274910
BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kitBeyotimeC3206
Bovine Serum AlbuminSigmaB2064
CentrifugeEppendorf5415R
Citric acidSinopharm Chemical Reagent Co.5949-29-1
Citric acid trisodiumSinopharm Chemical Reagent Co.4/3/6132
CoverslipsBeyotimeFCGF60
Deionized formamideAmresco12/7/1975
Diethyl pyrocarbonate, DEPCSigmaD5758Noxious substance
Digoxigenin (DIG) RNA Labeling MixRoche11277073910
DNase I, RNase-freeInvitrogen18047019
EDTASigma431788
Electrophoresis gel imagingBio-RadUniversal Hood III
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co.64-17-5
Gel extraction kitsOmegaD2500
Gel-electrophoresis apparatusBeijing Liuyi Instrument FactoryDYY-6C
GlycerolSinopharm Chemical Reagent Co.56-81-5
GlycineSigmaG5417
HeparinSigma8/1/9041
KClSinopharm Chemical Reagent Co.7447-40-7
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent Co.7778-77-0
LiClSigma203637
Maleic acidSinopharm Chemical Reagent Co.110-16-7
MethanolSinopharm Chemical Reagent Co.67-56-1Noxious substance
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co.7786-30-3
Na2HPO4Sinopharm Chemical Reagent Co.7558-79-4
NaClBiofountJT0001
NaOHSinopharm Chemical Reagent Co.1310-73-2Corrosive
Paraffin filmBemis Company, Inc.PM-996
Paraformaldehyde, PFASigma158127Noxious substance
PCR InstrumentLife TechnologyProflex
PinsDeli16
PipetteEppendorfplus G
Poly-D-lysine treated microscope slidesLiushengVER_A01
Proteinase KSigmaSRE0005
RNase free waterHyCloneSH30538. 02
RNase inhibitorRoche3335399001
S. nudus
Sheep serumBeyotimeC0265
Slide staining jarBeyotimeFG010
Slide storage boxBeyotimeFBX011
Small autoclaved scissorsShuanglusku_8330
SpectrophotometersThermo FisherNanoDrop 2000/2000c
T7 RNA polymerasesRoche10881767001
Taq DNA polymerase mix (2X)Thermo ScientificK1081
Tris HClSigmaRES3098T
tRNARoche10109517001
Tween-20SigmaP1379
Water bathZhengzhou Great Wall Scientific IndustrialHH-S2

References

  1. Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
  2. Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
  3. Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
  4. Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  5. Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
  6. Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
  7. Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
  8. Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
  9. Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
  10. Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
  11. Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
  12. Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
  13. Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
  14. Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
  15. Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
  16. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  17. Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
  18. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159RNADigoxigenin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved