西普库鲁斯核素体液的原位杂交

摘要

该协议描述了一种有效的原位杂交方法，用于检测西普库鲁斯核糖体流体中目标基因的mRNA表达水平和空间模式。

摘要

原位杂交 （ISH） 是一种非常翔实的技术，用于在组织中呈现特定基因（例如 mRNA 和 ncRNA）的细胞分布模式。虹吸虫西潘库鲁斯核苷，是一种重要的渔业资源，因为它具有较高的营养和药用价值。目前，西潘库鲁斯核子分子生物学的研究还处于起步阶段。本文的目的是开发一种敏感的方法，用于在虹吸虫核糖体流体中局部特定的mRNA。该协议包括ISH的详细步骤，包括二戈西根宁标记的抗感觉和感觉核探针制备、共母液收集和截面制备、特定的核试探杂交、抗体孵育、着色和着色后处理。演示了使用该方法的成功实验取得的代表性结果。该协议也应适用于其他西潘库拉物种。

引言

ISH，使用标记的核酸探针来检测特定的DNA或RNA感兴趣的序列，是描述形态保存组织^{11、2、32,3}中目标基因的空间表达模式的有用方法。通常，目标序列由聚合酶链反应（PCR）生成，然后用作模板，合成标有二戈西根尿碱-5'-三磷酸的抗感觉/感觉RNA探针。样品在用核试探孵育前固定并渗透。洗掉多余的探针后，利用抗地氧辛抗体，即碱性磷酸酶^{33、4、5、6，4,5,6}通过免疫组织化学进行可视化。

西潘库鲁斯努杜斯（菲勒姆·西潘库拉;命令西潘库利达:西潘库利达）是一种未分割、共和和双边对称的海虫^77、8。8虹食核生物是一种国际性物种，广泛分布于热带和温带沿海水域。也是中国南方重要的海洋渔业资源，因其高营养和药用价值^9,9，10。然而，分子生物学中的西普库鲁斯核苷也还处于起步阶段。为了充分理解基因的生物作用，对细胞分辨率下的基因表达模式进行调查是十分感兴趣的。在非模型生物Sipunculusnudus中，ISH方法是检测基因表达模式的理想方法，但至今尚未建立。其共母体流体包含多种细胞类型，包括粒细胞、urn细胞、细胞、生殖细胞、红细胞等^11种。双性/mab-3相关转录因子1（dmrt1），作为这种方法的代表性基因，是一种高度保守的转录调节器，在大多数物种，从无脊椎动物到哺乳动物^{12，13。,13}在一系列物种中（如黑色毛孔等）¹⁴ 14，dmrt1表示在Sertoli细胞，围绕生殖细胞，其功能类似于西潘库鲁斯核细胞的营养细胞。因此，我们假设，虹膜核糖的dmrt1表示在精子的营养细胞中，ISH方法的结果明确证实了这一假设。

该协议首次描述ISH，用二戈西根宁标记的抗感觉/感觉mRNA探针，以确定mRNA表达模式在其共发流体涂片。提供最佳反应条件，允许在高分辨率下对mRNA表达进行非常敏感的可视化。开发的ISH方法可能应用于西潘库利达物种以外的西普库利达物种。

研究方案

动物程序经华桥大学动物福利委员会批准。

1. 核试探准备

1. 底漆设计
   1. 打开程序引页 3 （http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/）。将dmrt1序列（GenBank: MK182259）复制到序列窗口中。
   2. 设置底漆长度（23-25 bp）、熔融温度（55-60°C）和G/C含量（40-60%）。单击"选取底漆"。
      注:RNA探针所需的最小尺寸约为500bp。较长的探针通常具有较高的特异性。
   3. 将T7RNA聚合酶促进剂序列（5，-TAATACGACTATAGGG-3）添加到选定的^,引物之一。 ISH 的dmrt1底漆序列显示在表 1中。
      注:对于检测器，T7 RNA聚合酶促进剂位于正向引物的5'末端。对于抗感觉探针，T7 RNA聚合酶促进剂位于反向引物的5'端。
2. PCR 放大
   1. 将微熔管放在冰上，并准备以下反应混合物（用于 50 μL 反应）:1x Taq DNA 聚合酶混合物、1 μg cDNA（从 100 μL 的共乳液制备）、1 μM 正向底漆、1 μM 反向底漆和无核酸酶水。
   2. 通过移液和离心机将PCR反应简单混合。
   3. 将反应管放入热循环器中，并使用以下条件运行 PCR:在 95 °C 下初始变性 2 分钟，然后在 95°C 下 30 秒下36次变性循环，在 55-60 °C 下退退 30 秒，在 72 °C 下延长 30 秒，在 72 °C 下最终延长 7 分钟。
      注:退火温度应根据底漆进行优化。
3. PCR产品纯化和验证
   1. 将 50 μL 的 PCR 混合物直接加载到 1% 的琼脂胶凝胶上。在 150-180 V 下运行琼脂胶凝胶 10 分钟，在 0.5x TBE 中。从1%的琼脂胶凝胶中分离出特定的DNA片段。
      注:DNA应显示为单一带，而不是涂片。
   2. 根据制造商的协议，使用凝胶提取套件净化DNA片段。通过波长为 260 nm 的分光光度测量来量化纯化产品。
   3. 通过排序验证 PCR 产品的真实性。
      注:（暂停点）纯化PCR产品可在-20°C下储存数月。
4. 核糖体合成
   1. 将无RNase微熔管放在冰上，并将以下内容添加到微熔管中（为10μL反应）:1倍DigoxyinRNA标签混合物、1倍转录缓冲液、0.5 μL RNase抑制剂、1 μL T7 RNA聚合酶、1 μg PCR产物和无Nase水。通过移液和离心机简单混合反应。在37°C下孵育2小时。
   2. 加入2μL的无RNase DNase I.通过移液和离心机简单混合反应。在37°C下孵育15分钟。
   3. 添加 2 μL 0.2 M EDTA （pH 8.0）。通过移液和离心机简单混合反应。
   4. 在上述反应中加入2.5μL的4MLiCl和75μL的预冷乙醇。混合好。在-70°C下离开30分钟。
   5. 在 12，000 x g下离心 10 分钟，在 4 °C 下。去乙醇加入1 mL的预冷70%乙醇（v/v），通过轻轻混合洗涤沉淀。
   6. 在 12，000 x g下离心 5 分钟，在 4 °C 下。将 70% 乙醇干燥，并在酒精灯附近短暂干燥沉淀物。加入30μL的无RNase水，轻轻混合，溶解沉淀物。
   7. 在1%的琼脂胶凝胶上加载2μL合成RNA。在 180 V 下运行琼脂胶凝胶 5-10 分钟，在 0.5x TBE 中。使用波长为 260 nm 的分光光度计测量标记 RNA 的浓度。
      1. 使用无RNase微熔管和过滤尖端，以避免RNase污染。
         注:（暂停点）地氧素标记探头可储存在-70°C，几个月。

2. 热质流体收集

1. 用针固定解剖表上的S. nudus。 用小的自剪剪刀打开S.nudus的身体。用移液器分离共支液。
2. 用移液器收集和传输1 mL结体液，以多D-Lysine处理的显微镜幻灯片。使用移液器尖端均匀涂抹同热流体。在 37 °C 下将滑轨干 1 小时。

3. 原位杂交

1. 第1天
   1. 在含有 100 mL 1x 二乙基热碳酸酯处理磷酸盐缓冲盐水 （DEPC-PBS） 的滑动染色罐中补充滑片。用 1x DEPC-PBS 补充 3 次，每次洗涤 5 分钟，轻轻搅拌。
   2. 在室温下用10微克/mL蛋白酶K消化，将乳液涂片渗透5分钟。将滑片孵化为4%的甲醛（PFA）20分钟，以停止消化。用轻柔搅拌将幻灯片洗涤 1x DEPC-PBS 5 分钟 3 次。
   3. 在幻灯片上添加 50 μL 的混合混合混合 （HM），其中包含感觉/反感觉核探针，并添加盖玻片。
   4. 将湿箱缓冲区添加到湿箱中。将幻灯片放入湿箱中，用石蜡薄膜密封好。在 60°C 下混合过夜（至少 16 小时）。
2. 第2天
   1. 在 65 °C 下预热洗涤缓冲液。将幻灯片浸入包含洗涤缓冲液的幻灯片染色罐中，让它站立，直到盖玻片自动滑下。大约需要5分钟。
   2. 在 65°C 下用洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次洗涤 30 分钟，轻轻搅拌。在65°C下用0.2x盐水钠柠度（SSC）洗涤2次，每次洗涤30分钟，轻轻搅拌。在室温下用含有Tween 20 （MABT）的雄酸缓冲液洗涤 2 次，每次洗涤 30 分钟，轻轻搅拌。
   3. 在室温下在阻塞缓冲器中孵育滑道 3⁄4 小时。在1 mL抗二高基宁-AP Fab片段溶液中孵育在1/5000稀释的滑轨中，在4°C过夜处用阻塞缓冲液。
3. 第3天
   1. 取出抗体溶液，在 MABT 中短暂清洗幻灯片。在室温下用MABT洗4次，每次洗涤25分钟，轻轻搅拌。
   2. 在室温下用碱性磷酸酶缓冲液孵育幻灯片 3 次，每次洗涤 5 分钟。取出碱性磷酸酶缓冲液，加入1 mL的5-溴4-3-无二醇磷酸盐（BCIP）/硝基蓝色四氮（NBT）染色溶液。将幻灯片放在黑暗中。
   3. 在光学显微镜下定期观察颜色反应。当颜色完全发育时（反应时间在 1-4 h 的范围内），在室温下用 MABT 洗 2 次幻灯片，每次洗涤 5 分钟，轻轻搅拌。
   4. 在室温下用停止溶液洗涤2次，每次洗涤15分钟，轻轻搅拌。在室温下孵育甲醇中的滑片，以去除多余的污渍30分钟。根据背景颜色，甲醇清洗可进行2至3次，脱色时间可延长。
   5. 在室温下用MABT洗涤2次，每次洗涤5分钟，轻轻搅拌。将幻灯片传输到新的滤纸。加入50μL的甘油。添加盖玻片，并观察微观。
      注: 解决方案组合图在表 2中显示。

结果

图 1中说明了 ISH 中涉及的步骤的摘要。从从共性流体cDNA放大的PCR产物中合成了dmrt1的抗感觉和相应的感觉核探针。通过直接测序验证了PCR产品的真实性。根据制造商的协议和以前的报告^4，使用T7RNA聚合器合成了Riboprobes，并进行了一些小的修改。ISH 的代表性信号如图2所示。以dmrt1为目标的西潘库鲁斯核糖体流体的I...

讨论

先前的研究表明，ISH适用于探测多个目标^{RNA16、17、18。,17,18}在此协议中，我们描述了一种高分辨率ISH方法，用于检测共分液中的mRNA，并强调西潘库鲁斯核糖的优化杂交条件。我们观察到的dmrt1的明显信号证明了该协议在基因表达检测中的成功应用（图2）。

在实验中，需...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Biowest	111860
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments	Roche	11093274910
BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit	Beyotime	C3206
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Citric acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.	5949-29-1
Citric acid trisodium	Sinopharm Chemical Reagent Co.	4/3/6132
Coverslips	Beyotime	FCGF60
Deionized formamide	Amresco	12/7/1975
Diethyl pyrocarbonate, DEPC	Sigma	D5758	Noxious substance
Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix	Roche	11277073910
DNase I, RNase-free	Invitrogen	18047019
EDTA	Sigma	431788
Electrophoresis gel imaging	Bio-Rad	Universal Hood III
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	64-17-5
Gel extraction kits	Omega	D2500
Gel-electrophoresis apparatus	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	56-81-5
Glycine	Sigma	G5417
Heparin	Sigma	8/1/9041
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7447-40-7
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7778-77-0
LiCl	Sigma	203637
Maleic acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.	110-16-7
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	67-56-1	Noxious substance
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7786-30-3
Na2HPO4	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7558-79-4
NaCl	Biofount	JT0001
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent Co.	1310-73-2	Corrosive
Paraffin film	Bemis Company, Inc.	PM-996
Paraformaldehyde, PFA	Sigma	158127	Noxious substance
PCR Instrument	Life Technology	Proflex
Pins	Deli	16
Pipette	Eppendorf	plus G
Poly-D-lysine treated microscope slides	Liusheng	VER_A01
Proteinase K	Sigma	SRE0005
RNase free water	HyClone	SH30538. 02
RNase inhibitor	Roche	3335399001
S. nudus
Sheep serum	Beyotime	C0265
Slide staining jar	Beyotime	FG010
Slide storage box	Beyotime	FBX011
Small autoclaved scissors	Shuanglu	sku_8330
Spectrophotometers	Thermo Fisher	NanoDrop 2000/2000c
T7 RNA polymerases	Roche	10881767001
Taq DNA polymerase mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Tris HCl	Sigma	RES3098T
tRNA	Roche	10109517001
Tween-20	Sigma	P1379
Water bath	Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial	HH-S2