Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, Sipunculus nudus coelomic sıvısındaki mRNA ekspresyon düzeylerini ve hedef genlerin mekansal desenlerini saptamak için yerinde hibridizasyon yaklaşımını etkin bir şekilde tanımlar.

Özet

In situ hibridizasyon (ISH), dokularda belirli genlerin (örneğin, mRNA ve ncRNA) hücresel dağılım modellerini sunmak için çok bilgilendirici bir tekniktir. Sipunculid solucanı Sipunculus nudus yüksek besin ve tıbbi değerlere sahip olduğu için önemli bir balıkçılık kaynağıdır. Şu anda Sipunculus nudus moleküler biyolojisi üzerine yapılan araştırmalar henüz emekleme aşamasındadır. Bu makalenin amacı Sipunculus nudus coelomik sıvıda spesifik mRNA lokalizasyonu için hassas bir yöntem geliştirmektir. Protokol, digoksigenin etiketli antisense ve sense riboprob hazırlanması, coelomik sıvı toplama ve kesit hazırlama, spesifik riboprob hibridizasyonu, antikor inkübasyonu, renklendirme ve renklendirme sonrası tedaviler de dahil olmak üzere ISH'in ayrıntılı adımlarını içerir. Bu yöntem kullanılarak başarılı bir deneyden elde edilen temsili sonuçlar gösterilmiştir. Protokol diğer Sipuncula türleri için de geçerli olmalıdır.

Giriş

ISH, ilgi belirli DNA veya RNA dizisi tespit etmek için etiketli bir nükleik asit probu kullanarak, morfolojik olarak korunmuş dokularda hedef genlerin mekansal ifade deseni tanımlamak için yararlı bir yöntemdir1,2,3. Normalde, hedef sırası polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tarafından oluşturulur ve daha sonra antisense / sense RNA probu digoksigenin uridine-5'-trifosfat ile etiketlenmiş sentezlemek için şablon olarak kullanılır. Örnekler riboprob ile kuluçkadan önce sabitlenir ve permeabilize edilir. Aşırı sonda yıkadıktan sonra, hibridizasyon bir anti-digoksijenin antikor kullanılarak immünohistokimya ile görselleştirilmiş, hangi alkali fosfataz konjuge3,4,5,6.

Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; sipariş Sipunculida: Sipunculidae) segmentsiz, coelomate ve çift taraflı simetrik deniz solucanı7,8. Sipunculus nudus, tropikal ve ılıman kıyı sularında yaygın olarak dağılmış kozmopolit bir türdür. Aynı zamanda yüksek besin ve tıbbi değerleri nedeniyle güney Çin'de önemli bir deniz balıkçılık kaynağı9,10. Ancak moleküler biyolojide Sipunculus nudus henüz emekleme aşamasındadır. Genlerin biyolojik rolünü tam olarak anlamak için, hücresel çözünürlükte genlerin ifade kalıplarının araştırılması büyük ilgi çekicidir. Model olmayan organizma Sipunculus nudus'tagenlerin ekspresyon kalıplarını tespit etmek için ideal bir yöntem olan ISH yöntemi henüz kurulmamıştır. Onun coelomic sıvı granülositler, vazo hücreleri, vesiküler hücreler, mikrop hücreleri, eritrositler, vb11dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri içerir. Çift cinsiyet / mab-3 ilgili transkripsiyon faktörü-1(dmrt1),bu yöntemde temsili bir gen olarak kullanılan, omurgasızlar memeliler arasında değişen çoğu türde cinsiyet tayini ve farklılaşma son derece korunmuş transkripsiyon düzenleyici12,13. Çeşitli türlerde (örn. siyah porgy, vb.) 14, dmrt1 Sertoli hücrelerinde ifade edildi, germinal hücreleri çevreleyen, olan fonksiyonu Sipunculus nudustrophoblast hücrelerine benzer . Bu nedenle Sipunculus nudus'un dmrt1'inin spermatozeugmatanın trofoblast hücrelerinde ifade edilm1ve ISH yönteminin sonucu hipotezi açıkça doğrulamıştır.

Bu protokol ilk kez ish açıklar, digoksigenin etiketli antisense / sense mRNA probları ile, onun coelomic sıvı yayma mRNA ifade desenleri belirlemek için. MRNA ifadesinin yüksek çözünürlükte çok hassas bir şekilde görüntülenmesiiçin en uygun tepki koşulları sağlanır. Geliştirilen ISH yöntemi sipunculus nudus dışında daha fazla Sipunculida türünde potansiyel olarak uygulanabilir.

Protokol

Hayvan prosedürü Huaqiao Üniversitesi Hayvan Bakım ve Refah Komitesi tarafından onaylandı.

1. Riboprobe hazırlık

  1. Astar tasarımı
    1. Programı Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/) açın. Dmrt1 sırasını (GenBank: MK182259) sıra penceresine kopyalayın.
    2. Astar uzunluğu (23-25 bp), erime sıcaklığını (55-60 °C) ve G/C içeriğini (%40-60) ayarlayın. Astar Seç'itıklatın.
      NOT: RNA sondası için gereken minimum boyut yaklaşık 500 bp. Daha uzun probların normalde daha yüksek özgüllüğü vardır.
    3. Seçilen astarlardan birine T7 RNA polimeraz promotör sırasını (5, -TAATACGACTTATAGGG-3) ekleyin., ISH için dmrt1 astar dizileri Tablo 1'degösterilmiştir.
      NOT: Duyu probları için T7 RNA polimeraz organizatörü ileri astarların 5' ucunda yer alır. Antisense problar için, T7 RNA polimeraz organizatörü ters astarların 5'ucunda yer alır.
  2. PCR amplifikasyonu
    1. Mikrofuge tüplerini buzüzerine yerleştirin ve aşağıdaki reaksiyon karışımını (50 μL reaksiyon için): 1x Taq DNA polimeraz karışımı, 1 μg cDNA (100 μL coelomik sıvıdan hazırlanır), 1 μM ileri astar, 1 μM ters astar ve çekirdeksiz su hazırlayın.
    2. PcR reaksiyonu kısa bir süre pipetleme ve santrifüj ile karıştırın.
    3. Reaksiyon tüpünü bir termal döngüye yerleştirin ve PCR'yi aşağıdaki koşulları kullanarak çalıştırın: 95 °C'de 2 dk için ilk denatürasyon ve ardından 30 s için 95 °C'de 36 döngü denatürasyon, 30 s için 55-60 °C'de annealing, 30 s için 72 °C'de uzatma ve 72 °C'de 7 dk.'da son uzatma.
      NOT: Tavlama sıcaklığı astarlara göre optimize edilmelidir.
  3. PCR ürün arınması ve doğrulaması
    1. 50 μL PCR karışımını doğrudan %1 agarose jelüzerine yükleyin. Agarose jeli 150-180 V'de 10 dk 0.5x TBE'de çalıştırın. Spesifik DNA parçalarını %1 agarose jelden ayırın.
      NOT: DNA yayma olarak değil, tek bir bant olarak görünmelidir.
    2. Üreticinin protokolüne göre jel çıkarma kiti kullanarak DNA parçalarını arındırın. Saflaştırılmış ürünleri spektrofotometri ile 260 nm dalga boyunda ölçün.
    3. Sıralayarak PCR ürünlerinin orijinalliğini doğrulayın.
      NOT: (Duraklatma noktası) Saflaştırılmış PCR ürünleri -20 °C'de birkaç ay saklanabilir.
  4. Ribozob sentezi
    1. RNase içermeyen mikrofuge tüplerini buzüzerine yerleştirin ve mikrofuge tüpüne (10 μL reaksiyon için): 1x Digoxygenin RNA Etiketleme Karışımı, 1x transkripsiyon tamponu, 0,5 μL RNase inhibitörleri, 1 μL T7 RNA polimeraz, 1 μg PCR ürünü ve RNase içermeyen su ekleyin. Kısa bir süre pipetleme ve santrifüj ile reaksiyon karıştırın. 37 °C'de 2 saat kuluçka.
    2. 2 μL RNase içermeyen DNase I. Pipetleme ve santrifüj ile reaksiyonu kısa bir süre karıştırın. 37 °C'de 15 dakika kuluçka.
    3. 2 μL 0,2 M EDTA (pH 8.0) ekleyin. Kısa bir süre pipetleme ve santrifüj ile reaksiyon karıştırın.
    4. Yukarıdaki reaksiyona 2,5 μL 4 M LiCl ve 75 μL önceden önceden gelen etanol ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın. -70 °C'de 30 dk bekletin.
    5. 4 °C'de 10 dk için 12.000 x g santrifüj. Etanolde dekant. Önceden soğutulmuş 1 mL ekleyin 70% etanol (v /v) ve yavaşça karıştırarak yağış yıkayın.
    6. 4 °C'de 5 dk için 12.000 x g santrifüj. %70 etanol decant ve bir alkol lambası yakınında kısa bir süre yağış kuru. 30 μL'lik RNase içermeyen su ekleyerek yağışı eritin ve hafifçe karıştırın.
    7. %1 agarose jel üzerine sentezlenmiş RNA'nın 2 μL'sini yükleyin. Agarose jeli 180 V'de 5-10 dk 0,5x TBE'de çalıştırın. 260 nm dalga boyunda bir spektrofotometre kullanarak etiketli RNA konsantrasyonu ölçün.
      1. RNase kontaminasyonunu önlemek için RNase içermeyen mikrofuge tüpleri ve filtre uçlarını kullanın.
        NOT: (Duraklatma noktası) Digoksijenin etiketli problar -70 °C'de birkaç ay saklanabilir.

2. Coelomic sıvı toplama

  1. Diseksiyon masasındaki S. nudus'u iğnelerle düzeltin. Küçük otoklavlı makas ile S. nudus gövdesini açın. Bir pipet ile coelomic sıvı izole.
  2. 1 mL coelomik sıvıyı pipetle poli-D-lizin tedavi edilen mikroskop slaytlarına toplayın ve aktarın. Kokomik sıvıyı bir pipet ucuyla eşit olarak uygulayın. 37 °C'de 1 saat boyunca kaydırakları havakurutun.

3. In situ hibridizasyon

  1. 1. Gün
    1. 100 mL 1x dietil pirokarbonat işlenmiş fosfat tamponlu salin (DEPC-PBS) içeren bir slayt boyama kavanozundaki slaytları yeniden nemlendirin. 1x DEPC-PBS ile 3 kez rehidrat, nazik ajitasyon ile yıkama başına 5 dk.
    2. 5 dk. Oda sıcaklığında 10 μg/mL proteinaz K ile sindirimi ile coelomik sıvının bulaşmasını permeabilize edin. Slaytları 1x DEPC-PBS'de 5 dk 3 kez hafif ajitasyonla yıkayın.
    3. Slaytlara duyu/antisense riboprob içeren 50 μL hibridizasyon karışımı (HM) ekleyin ve bir kapak fişi ekleyin.
    4. Islık kutu tamponu ısıt kutuya ekleyin. Islak kutuya slaytlar koyun ve parafin film ile iyi mühür. 60 °C'de bir gecede (en az 16 saat) melezleştirin.
  2. 2. Gün
    1. Yıkama tamponu 65 °C'de önceden ısıtın. Kayağı yıkama tamponunu içeren slayt boyama kavanozuna batırın ve kapak kayması otomatik olarak kaydırılanana kadar bekletin. Yaklaşık 5 dakika sürer.
    2. 65 °C'de yıkama tamponu ile 2 kez yıkayın, yıkama başına 30 dk nazik ajitasyon ile. 65 °C'de 0,2 x tuzlu sodyum sitrat (SSC), yıkama başına 30 dk hafif ajitasyonla 2 kez yıkayın. Oda sıcaklığında Tween 20 (MABT) içeren maleik asit tamponu ile 2 kez yıkayın, nazik ajitasyon ile yıkama başına 30 dk.
    3. Slaytları oda sıcaklığında 3-4 saat boyunca bloke tamponunda kuluçkaya yatırın. 1 mL anti-digoksigenin-AP Fab parçaları çözeltisi 1/5000 seyreltilmiş slaytlar inkübülasyon 4 ° C gecede engelleme tampon ile.
  3. 3. Gün
    1. Antikor solüsyonunu çıkarın ve slaytları MABT'de kısa bir süre yıkayın. MABT ile 4 kez oda sıcaklığında, 25 dk'lık yıkama başına nazik ajitasyonla yıkayın.
    2. Oda sıcaklığında alkali fosfataz tampon ile slaytlar kuluçka 3 kez, yıkama başına 5 dakika. Alkali fosfataz tamponu çıkarın ve 5-bromo-4-kloro-3-indolyl fosfat (BCIP)/nitro mavi tetrazolyum (NBT) boyama çözeltisi 1 mL ekleyin. Slaytları karanlıkta tutun.
    3. Optik mikroskop altında renk reaksiyonu periyodik olarak gözlemleyin. Renk tamamen geliştirildiğinde (1-4 saat aralığında reaksiyon süresi), slaytları oda sıcaklığında MABT ile 2 kez yıkayın, nazik ajitasyon la yıkama başına 5 dk.
    4. Oda sıcaklığında stop çözeltisi ile 2 kez, yıkama başına 15 dk nazik ajitasyon ile yıkayın. 30 dakika oda sıcaklığında, aşırı leke kaldırmak için metanol slaytlar kuluçka. Arka plan rengine göre metanol yıkama 2 veya 3 kez yapılabilir ve renk değişikliği süresi uzatılabilir.
    5. MABT ile 2 kez oda sıcaklığında, 5 dk'lık yıkama başına nazik ajitasyonla yıkayın. Slaytları taze bir filtre kağıdına aktarın. Gliserol 50 μL ekleyin. Kapakları ekleyin ve mikroskobik gözlemleyin.
      NOT: Çözüm kompozisyonu Tablo 2'degösterilebilir.

Sonuçlar

ISH'de yer alan adımların bir özeti Şekil 1'degösterilmiştir. Dmrt1 için antisense ve buna karşılık gelen duyu riboprobları, coelomik sıvı CD'lerinden güçlendirilmiş PCR ürünlerinden sentezlenmiştir. PCR ürünlerinin orijinalliği doğrudan sıralama ile doğrulandı. Riboprobes üreticinin protokollerine göre T7 RNA polimerazlar kullanılarak sentezlenmiş ve bazı küçük değişiklikler ile önceki bir rapor4. ISH'nin temsili sinyalle...

Tartışmalar

Önceki çalışmalar ISH birden fazla hedef RNA16,17,,18tespit için uygun olduğunu gösterdi . Bu protokolde, coelomik sıvıdaki mRNA'yı saptamak ve Sipunculus nudus'ta optimize edilmiş hibridizasyon koşullarını vurgulamak için yüksek çözünürlüklü ish yöntemi ni tanımladık. Gözlemlediğimiz dmrt1 sinyalleri gen ekspresyonunun saptanmasında bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanmas...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 31801034), Fujian Eyaleti, Çin Doğa Bilimleri Vakfı (2016J0161), Huaqiao Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonları (15BS306) ve Lisansüstü Ler Yenilikçi Fonu tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseBiowest111860
Anti-digoxigenin-AP Fab fragmentsRoche11093274910
BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kitBeyotimeC3206
Bovine Serum AlbuminSigmaB2064
CentrifugeEppendorf5415R
Citric acidSinopharm Chemical Reagent Co.5949-29-1
Citric acid trisodiumSinopharm Chemical Reagent Co.4/3/6132
CoverslipsBeyotimeFCGF60
Deionized formamideAmresco12/7/1975
Diethyl pyrocarbonate, DEPCSigmaD5758Noxious substance
Digoxigenin (DIG) RNA Labeling MixRoche11277073910
DNase I, RNase-freeInvitrogen18047019
EDTASigma431788
Electrophoresis gel imagingBio-RadUniversal Hood III
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co.64-17-5
Gel extraction kitsOmegaD2500
Gel-electrophoresis apparatusBeijing Liuyi Instrument FactoryDYY-6C
GlycerolSinopharm Chemical Reagent Co.56-81-5
GlycineSigmaG5417
HeparinSigma8/1/9041
KClSinopharm Chemical Reagent Co.7447-40-7
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent Co.7778-77-0
LiClSigma203637
Maleic acidSinopharm Chemical Reagent Co.110-16-7
MethanolSinopharm Chemical Reagent Co.67-56-1Noxious substance
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co.7786-30-3
Na2HPO4Sinopharm Chemical Reagent Co.7558-79-4
NaClBiofountJT0001
NaOHSinopharm Chemical Reagent Co.1310-73-2Corrosive
Paraffin filmBemis Company, Inc.PM-996
Paraformaldehyde, PFASigma158127Noxious substance
PCR InstrumentLife TechnologyProflex
PinsDeli16
PipetteEppendorfplus G
Poly-D-lysine treated microscope slidesLiushengVER_A01
Proteinase KSigmaSRE0005
RNase free waterHyCloneSH30538. 02
RNase inhibitorRoche3335399001
S. nudus
Sheep serumBeyotimeC0265
Slide staining jarBeyotimeFG010
Slide storage boxBeyotimeFBX011
Small autoclaved scissorsShuanglusku_8330
SpectrophotometersThermo FisherNanoDrop 2000/2000c
T7 RNA polymerasesRoche10881767001
Taq DNA polymerase mix (2X)Thermo ScientificK1081
Tris HClSigmaRES3098T
tRNARoche10109517001
Tween-20SigmaP1379
Water bathZhengzhou Great Wall Scientific IndustrialHH-S2

Referanslar

  1. Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
  2. Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
  3. Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
  4. Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  5. Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
  6. Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
  7. Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
  8. Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
  9. Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
  10. Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
  11. Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
  12. Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
  13. Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
  14. Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
  15. Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
  16. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  17. Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
  18. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 159RNA LokalizasyonuDigoksigeninAntisense RiboprobeSense Riboprobefade DeseniDeniz Solucan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır