JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

المناعة الكهربية chemiluminescence (ECLIA) هو نهج جديد للكشف الكمي من المتغيرات البروتين MeCP2 المحلية وتطبيقها خارجيًا ، والتي تنتج قياسات كمية ودقيقة وقابلة للاستنساخ مع خطأ منخفض داخل وبين القياس على نطاق عمل واسع. هنا، يتم وصف بروتوكول MeCP2-ECLIA في شكل 96-well.

Abstract

وECLIA هو طريقة متعددة الاستخدامات التي هي قادرة على تحديد كميات البروتين الذاتية والمؤتلفة في شكل 96 بئر. لإثبات كفاءة ECLIA، تم استخدام هذا القول لتحليل المستويات الجوهرية من MeCP2 في أنسجة الدماغ الماوس والاستيلاء على TAT-MeCP2 في الخلايا الليفية الجلدية البشرية. تنتج MeCP2-ECLIA قياسات دقيقة للغاية وقابلة للاستنساخ مع خطأ منخفض داخل وبين القياس. باختصار، قمنا بتطوير طريقة كمية لتقييم متغيرات البروتين MeCP2 التي يمكن استخدامها في شاشات عالية الإنتاجية.

Introduction

ويستند المناعة الكهربية (ECLIA) على عملية تستخدم التسميات المصممة لانبعاث الإنارة عندما يحفز كيميائيا. وهي تقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع للكشف الكمي عن الأدوية البيولوجية في الصناعة الأساسية والبحوث الأكاديمية وصناعة الأغذية وكذلك في التشخيص السريري1. عادة، يتم استخدام لوحة 96-جيدا يمكن التخلص منها مع أقطاب الحبر الكربون. تعمل هذه الأقطاب الكهربائية كناقل للمرحلة الصلبة للمناعة. يتم اقتران الأجسام المضادة الثانوية إلى تسمية electrochemiluminescent وعندما يتم تطبيق الكهرباء على النظام ، يتم تشغيل الانبعاثات الخفيفة للتسمية الكيميائية. جهاز عالي الضوضاء جداً (CCD) يسجل شدة الضوء التي تتناسب مباشرة مع المستضد المرتبط بالجسم المضاد لالتقاط مما أدى إلى التحديد الكمي للحازة المستهدفة للعينة2. بالمقارنة مع الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، تعتبر ECLIA مفيدة لأنها توفر حساسية وقابلية تكرار أعلى بالإضافة إلى أتمتة واتساق أفضل3.

هنا قمنا بتحليل البروتين الملزم الميثيل-CpG 2 (MeCP2) مستويات في عينات من أصل الإنسان والمورين، فضلا عن المتغيرات المختلفة من البروتين المؤتلف باستخدام نظام ECLIA وضعت حديثا. MecP2 هو بروتين حمض يجليد الحمض النووي المرتبط بـ X والمعروف بالتفاعل مع تسلسل الحمض النووي الميثيلي. وقد تورط هذا البروتين في تنظيم التعبير الجيني4,5. فقدان وظيفة الطفرات في الجين الذي ترميز هذا البروتين هي الجناة الرئيسيين المسببة لمتلازمة Rett (RTT), اضطراب النمو العصبي الشديد6. اضطراب آخر متعلق بMeCP2 ، متلازمة الازدواجية MECP2 ، يؤدي أيضًا إلى أعراض عصبية يمكن أن تتداخل مع أعراض RTT7. وتجدر الإشارة إلى أن الإناث يتأثرن في الغالب بـ RTT في حين أن الذكور يعانون في الغالب من متلازمة الازدواجية MECP2 6,7.

وترتبط هذه الاضطرابات مع مستويات MeCP2 غير كافية أو زائدة على التوالي في الجهاز العصبي المركزي (CNS). وبالتالي، فإن خيارات العلاج لRTT التي تنطوي على زيادة مستويات MeCP2 في الجهاز الوطني للدراسات الفضائية تحتاج إلى تجنب الآثار الضارة المرتبطة بفائض MeCP27. ونتيجة لهذه الحقيقة، فإن التحديد الكمي الشديد الحساسية والدقيق لمستويات البروتين MeCP2، كما يوفره نظام ECLIA، أمر بالغ الأهمية للنهوض بRTT وكذلك أبحاث متلازمة الازدواجية MECP2. القياسات الدقيقة لمستويات MeCP2 الذاتية والخارجية من خطوط الخلايا البشرية وعينات أنسجة الماوس وكذلك البروتين المؤتلف الذي يتكون من الإنسان MeCP2 isoform B (المعروف أيضا باسم isoform e1) ، والحد الأدنى N-المحطة HIV-TAT نقل المجال (TAT-MeCP2) التي لديها القدرة على عبور حاجز الدم في الدماغ8,9 وترد في هذا العمل.

Protocol

تم الحصول على الموافقة على شراء خزعة الجلد لأغراض البحث من لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في مستشفى الأطفال في ويستميد، أستراليا. تم الحصول على الموافقة على التجارب على الحيوانات من الوزارة الاتحادية النمساوية للعلوم والبحوث والاقتصاد، والتي أجريت وفقا للوائح المحلية لرعاية الحيوان (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

ملاحظة: يتم تصوير مبدأ نظام ECLIA في الشكل 1.

1. اختيار الأجسام المضادة

  1. تقييم نسبة الإشارة إلى الضوضاء لمجموعة من مختلف الأجسام المضادة MeCP2 وتحديد أفضل قوة إشارة وأعلى خصوصية ضمن مزيج من الأجسام المضادة MCP2 أحادية اللون الماوس الأولية (استنساخ Mec-168) والأرنب polyclonal MeCP2 الكشف عن الأجسام المضادة (العرف). للجسم المضاد الثانوي، استخدم جسممضاد خاص بالنظام(جدول المواد)،والذي تم التحقق منه تجريبيًا أيضًا.
    ملاحظة: الجدول 1 يعطي نظرة عامة على جميع الأجسام المضادة التي تم التحقق منها أثناء تطوير MeCP2-ECLIA ونطاقات التخفيف التي تم اختبارها.
وظيفهاسماستنساخالتخفيف
الاساسيالماوس، مكافحة MeCP2Mec-1681:500−1:10,000
الاساسيالماوس، مكافحة MeCP24B61:250−1:4,000
الاساسيالماوس، مكافحة MeCP2الرجال-81:500−1:4,000
الاساسيالماوس، مكافحة MeCP21B111:500−1:4,000
الاساسيأرنب، مضاد لـ MeCP2D4F31:500−1:4,000
الثانويهأرنب، مضاد لـ MeCP2متعدد الكلونات1:2,000−1:20,000
الثانويهأرنب، مضاد لـ MeCP2متعدد الكلونات1:2,000−1:20,000
الكشف عنSULFO-TAG المسمى المضادة للأرنبمتعدد الكلونات1:500−1:1,000

الجدول 1: قائمة الأجسام المضادة والتخفيفات المستخدمة في العمل.

  1. بدلا من ذلك، استخدم كل زوج من الأجسام المضادة MeCP2 التي تعمل بشكل جيد مع ELISA التقليدية.

2. علاج HDFs مع بروتين الاندماج TAT-MeCP2

ملاحظة: تم التعبير عن TAT-MeCP2 بشكل مؤتلف في إشيريشيا القولونية وتنقيتها باستخدام تقنيات الكروماتوغرافية القياسية كما وصفت سابقا8 وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

  1. لوحة 1 × 106 خلايا الورم الليفي الجلدي البشري (HDF) في أطباق 100 مم وتنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى تصل إلى حوالي 90٪ التقاء.
  2. إخراج قارورة واحدة من بروتين الاندماج TAT-MeCP2. تذوب على الجليد وتخلط بلطف.
  3. تمييع TAT-MeCP2 إلى تركيز نهائي من 500 nM في 50 مل من وسائل الإعلام ثقافة HDF.
  4. إزالة وسائل الإعلام من أطباق 100 ملم واحتضان الخلايا مع 500 nM TAT-MeCP2 في 37 درجة مئوية لفترات الحضانة المختلفة تصل إلى 24 ساعة.
  5. إزالة حل TAT-MeCP2 من الخلايا. اغسل الخلايا 2x مع مالين دولبكو العازلة للفوسفات (DPBS) المعقم مسبقًا.
  6. علاج الخلايا مع 2 مل من 0.05٪ trypsin-EDTA الحل لمدة 5 دقيقة في 37 درجة مئوية10.
  7. إضافة 6 مل من الوسائط الثقافية HDF لتعطيل التربسين وجمع الخلايا في أنابيب 15 مل.
  8. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. إزالة supernatant وغسل الخلايا 2x مع DPBS الجليد الباردة. تخزين بيليه على الجليد والمضي قدما مع إعداد العينة.

3. إعداد عينة

  1. HDF الليسات
    1. تحديد أعلى مستويات البروتين من MeCP2 باستخدام طريقة REAP للتقسيم تحت الخلية في المقصورات السيتوبلازمية والنووية تحت الخلية وفقا لسوزوكي وآخرون11. الحد من الكسور إلى ما لا يزيد عن ست عينات لكل تجربة.
  2. دماغ الفأر يلهي
    1. إعداد 100 مل من كل كاشف محلول الدمى الناقص التوتر والمخزن المؤقت لاستخراج.
      1. لكاشف محلول الدمى نقص التوتر، مزيج جيد 10 mM HEPES، 1.5 mM كلوريد المغنيسيوم و10 mM كلوريد البوتاسيوم.
      2. للاحتياطي استخراج, مزيج جيد 20 mM HEPES, 1.5 mm كلوريد المغنيسيوم, 0.42 M كلوريد الصوديوم, 0.2 mM EDTA, و 25% (v/v) الجلسرين.
      3. ضبط درجة الحموضة لكلا المخازن المؤقتة إلى 7.9.
      4. أضف 1 m m dithiothreitol (DTT) وكوكتيل مثبط البروتياز 1x إلى كل من المخازن المؤقتة طازجة. البرد على الجليد قبل الاستخدام.
    2. تعليق 100 ملغ من إجمالي دماغ الفأر (سلالة: C57BL/6J, نوع البري ة الذكور والإناث وB6.129P2 (C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous الذكور والإناث heterozygous; العمر: 4-8 أسابيع من العمر) في 1 مل من الثلج الباردة محلول الدموتوني كاشف.
    3. تجانس الدماغ مع الزمرة قبل المبردة جميع الأنسجة الزجاجية المتجانس من قبل 15 السكتات الدماغية من التجانس A (فضفاضة، لإزالة كبيرة) وB (ضيق، لإزالة الصغيرة)، على التوالي.
    4. نقل الخلايا المتجانسة إلى أنبوب نظيف والطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant (أو الاحتفاظ بها ككسر السيتوبلازمتيك لمزيد من الاستخدام).
    5. إعادة تعليق بيليه في 140 ميكرولتر من استخراج المخزن المؤقت لكل 100 ملغ من مواد البداية. ضع الأنبوب في كتلة حرارية مبردة مسبقًا واخلطبلطف لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    6. طرد مركزي الأنبوب في 16،000 غرام لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل supernatant (أي الكسر النووي) إلى أنبوب جديد مبردة مسبقا وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن تقييم تركيز البروتين من الليسات المشتقة من دماغ الماوس وHDFs من قبل فحص بروتين BCA.

4. MeCP2-ECLIA بروتوكول

  1. إعداد محلول الغسيل، ومنع العازلة وامتصاص حل المخفف (اليوم 1)
    1. إضافة 500 ميكرولتر من Tween 20 إلى 1 لتر من برنامج تلفزيوني لإعداد 0.05٪ Tween 20 في محلول PBS، مزيج بقوة والتسمية بأنها "حل الغسيل".
      ملاحظة: تأكد من استخدام مخزن الغسيل الطازج فقط.
    2. إعداد محلول حظر 3٪ مانع A(جدول المواد)في المالحة المخزنة مؤقتا الفوسفات (PBS). تخلط عن طريق التحريك لطيف، تصفية تعقيم والاحتفاظ بها في الثلاجة حتى استخدامها لمدة أقصاها أسبوعين.
    3. إضافة 5 مل من منع الحل إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني لإعداد حل توسعي ازان (1٪ مانع A في PBS).
  2. طلاء لوحات ربط عالية
    1. إخراج 96-بئر متعددة صفيف بقعة واحدة لوحة ربط عالية.
      ملاحظة: لوحات ربط عالية لديها قدرة أكبر ملزمة وبالتالي مجموعة ديناميكية أكبر من لوحات القياسية مع الأسطح الكارهة للماء.
    2. إذابة الماوس أحادي النسيلة المضادة MeCP2 الأجسام المضادة على الجليد وخلط 0.67 ميكرولتر من الأجسام المضادة مع 4 مل من برنامج تلفزيوني (1:6000 تخفيف الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني). دوامة حل الأجسام المضادة لخلط جيدا وتسمية الأنبوب بأنه "حل الطلاء".
    3. الاستغناء بعناية 25 ميكرولتر من محلول الطلاء في الزاوية السفلى من كل بئر باستخدام الأنابيب متعددة القنوات؛ وهذا ما يسمى طريقة طلاء الحل. اضغط على لوحة 96 بئر بلطف على كل جانب لضمان أن حل الطلاء يغطي الجزء السفلي من كل بئر.
    4. ختم لوحة مع احباط لاصق واحتضان لوحة في الثلاجة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها (12-16 ساعة).
  3. حظر (اليوم 2)
    1. أخرج يُخرج الصحن من الثلاجة وأزيل يُـمْل.
    2. إزالة حل طلاء الأجسام المضادة عن طريق النقر عليه في سلة النفايات واضغط على لوحة على منشفة ورقية لإزالة كل حل الطلاء من الآبار.
    3. إضافة 125 ميكرولتر من محلول الحجب لكل بئر. ختم لوحة مرة أخرى ووضعها على شاكر microplate المدارية.
    4. احتضان لوحة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر في 800 دورة في الدقيقة.
  4. إعداد المعايير والعينات
    1. خلال فترة الحضانة، قم بإعداد معايير البروتين MeCP2 و/أو TAT-MeCP2 والعينات المختلفة.
      ملاحظة: يجب أن يكون المخزن المؤقت تحلل المستخدمة لتخفيف القياسية نفس المستخدمة في العينات التي تم تحليلها.
    2. إخراج قارورة واحدة من MePC2 و / أو TAT-MeCP2 محلول مخزون البروتين (250 ميكروغرام / مل) ، وخلايا دماغ الماوس والبروتين HDF من -80 درجة مئوية. إذابتها على الجليد
    3. تمييع محلول المخزون القياسي (MeCP2 و/أو TAT-MeCP2) في أنابيب نظيفة وفقًا للجدول 2.
    4. تمييع العينات في المخزن المؤقت للتليس على النحو التالي: 1-20 ميكروغرام من مليس دماغ الماوس لكل 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للزلي، و0.25−1 ميكروغرام من الليفي ة عالية الوضوح لكل 25 ميكرولتر من العازلة اللين. إعداد حجم كاف من كل عينة لإجراء التحليل في ثلاثية.
القياسيهتركيزالتخفيف
المعيار 11,800 نانوغرام/مل1.08 ميكرون لتر محلول المخزون القياسي + 148.92 ميكرون لتر محلول الليسيس المؤقت
المعيار 2600 نانوغرام/مل50 ميكرولتر معيار 1 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 3200 نانوغرام/مل50 ميكرولتر قياسي 2 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 466.67 نانوغرام/مل50 ميكرولتر قياسي 3 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 522.22 نانوغرام/مل50 ميكرولتر قياسي 4 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 67.41 نانوغرام/مل50 ميكرولتر قياسي 5 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 72.47 نانوغرام/مل50 ميكرولتر قياسي 6 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 80.82 نانوغرام/مل50 ميكرولتر قياسي 7 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 90.27 نانوغرام/مل50 ميكرولتر قياسي 8 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 100 نانوغرام/مل150 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت

الجدول 2: السلسلة القياسية من 0 إلى 800 1 نانوغرام/مل.

  1. إضافة العينات والحلول القياسية
    1. إزالة حل حظر عن طريق النقر عليه في سلة النفايات واضغط على لوحة على منشفة ورقية لإزالة كل حل حظر من الآبار.
    2. اغسل يُغسل الصفيحة 3x بمحلول الغسيل بـ 150 ميكرولتر بإضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور.
    3. إضافة 25 ul من المعايير والعينات إلى الزاوية السفلى من البئر باستخدام قناة واحدة pipette.
    4. ختم لوحة واحتضان لوحة لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر في 800 دورة في الدقيقة.
  2. الأجسام المضادة للكشف غير المسمى
    1. إذابة الأرنب متعدد الكلون المضادة MeCP2 الأجسام المضادة على الجليد. تمييع الأجسام المضادة 1:6,000 في حل مخفف.
    2. إزالة المعايير والعينات عن طريق النقر عليه في سلة النفايات واضغط على لوحة على منشفة ورقية.
    3. اغسل يُغسل الصفيحة 3x بمحلول الغسيل بـ 150 ميكرولتر بإضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور.
    4. أضف 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكشف غير المسمى إلى كل بئر مع البيكتور متعدد القنوات. ختم لوحة واحتضان لمدة 1 ساعة مع اهتزاز مستمر في 800 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. جسم مضاد مترافق محدد
    1. إخراج الأجسام المضادة الثانوية محددة(جدول المواد)من الثلاجة ووضعها على الجليد. تمييع الأجسام المضادة 1:666.67 في حل مخفف وتخلط بلطف.
    2. قم بإزالة الأجسام المضادة الثانوية المجانية غير المسماة عن طريق النقر عليه في سلة النفايات واضغط على الطبق على منشفة ورقية.
    3. اغسل يُغسل الصفيحة 3x بمحلول الغسيل بـ 150 ميكرولتر بإضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور.
    4. إضافة 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة مترافقة محددة(جدول المواد)إلى كل جيدا مع البيكتور متعدد القنوات. ختم لوحة واحتضان لمدة 1 ساعة مع اهتزاز مستمر في 800 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. قراءة لوحة
    1. إزالة الأجسام المضادة الحرة الزوجية(جدول المواد)عن طريق النقر عليه في سلة النفايات والاستفادة من لوحة على منشفة ورقية.
    2. اغسل يُغسل الصفيحة 3x بـ 150 ميكرولتر من محلول الغسيل.
    3. إضافة 150 ميكرولتر من 1x تريس القائم على الذهب قراءة المخزن المؤقت(جدول المواد)مع السطحي ة التي تحتوي على tripropylamine كتفاعل مشترك لتوليد الضوء إلى لوحة. تجنب أي فقاعات الهواء باستخدام تقنيات الأنابيب العكسي.
    4. ضع اللوحة على منصة الكشف عن اللوحة الدقيقة(جدول المواد)وابدأ القياس على الفور. استخدم الإعدادات للحصول على لوحة 96 بئرًا.
    5. التقط إشارات الكهركيميلوميناتسين بواسطة كاميرا مدمجة في CCD في نظام الكشف عن الكهركيميلوميناتسين(جدول المواد)وتسجيل أعداد الإشارات ، والتي تتوافق مع وحدات الضوء النسبية (RLU) وتتناسب مباشرة مع شدة الضوء.
      ملاحظة: عند التحفيز الكهروكيميائي، تنبعث من ملصق الروثينيوم المرتبط بقطب الكربون ضوء الإضاءة عند 620 نانومتر. تحليل البيانات باستخدام البرنامج المصاحب للأداة(جدول المواد).

النتائج

ويرد وصف لمبدأ نظام ECLIA في الشكل 1. يتم عرض المنحنيات القياسية لاثنين من متغيرات MeCP2 في الشكل 2. وكان من الممكن التحديد الكمي الدقيق على مدى مجموعة واسعة من التركيزات (1-800 1 نانوغرام/مل). في الشكل 3، تم تحليل مستويات MeCP2 من تحللات مشتقة من دماغ الم...

Discussion

لقياس MeCP2 الذاتية، المؤتلف ة MeCP2 وTAT-MeCP2 المستويات، تم تطوير لوحة 96 بئر ECLIA. وقد ثبت أن فقدان وظيفة البروتين MeCP2 يؤدي إلى متلازمة RTT6, العلاج الذي يقتصر حاليا على إدارة الأعراض والعلاج الطبيعي. أحد طرق العلاج الواعدة هو ما يسمى العلاج ببدائل البروتين ، حيث يمكن أن يتم تأنيب مستويات...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ونحن ممتنون جدا للدكتورة بريجيت شتورم لدعمها مع صك ECLIA.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD9779Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBio-Rad Laboratories Inc.500-0006Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbitMeso Scale DiagnosticsR32AB-1Antibody
Discovery workbench 4.0Meso Scale DiscoverySoftware
DMEM (1X)gibco by Life Technologies41966-029Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile)Sigma-AldrichD8537-500MLSample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTASigma-AldrichEDSExtraction Buffer
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF9665Sample preperation
GlycerolSigma-AldrichG2025Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactantMeso Scale DiagnosticsR92TGMeCP2 ECLIA protocol
HEPESSigma-AldrichH3375Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder setSigma-AldrichD8938Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)GFL3014MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)Sigma-AldrichM2670Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)Abnova CorporationH00004204-P01Cell treatment
Microseal B sealBio-Rad Laboratories Inc.MSB1001for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulinSigma-AldrichM6818-100UL; RRID:AB_262075Antibody, Coating solution
MSD Blocker AMeso Scale DiagnosticsR93BA-4Blocker
MSD SECTOR Imager 2400Meso Scale DiagnosticsI30AA-0MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well PlateMeso Scale DiagnosticsL15XB-3/L11BX-3MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycingibco by Life Technologies15140122Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbitEurogentec S.A.custom-designedAntibody
Potassium chloride (KCl)Merck KGaA1049361000Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)Sigma-AldrichSAB1404063; RRID:AB_10737296Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)Sigma-AldrichWH0004204M1; RRID:AB_1842411Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)Sigma-AldrichM6818; RRID:AB_262075Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)Sigma-AldrichM7443; RRID:AB_477235Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)Cell Signaling Technology3456S; RRID:AB_2143849Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X)Sigma-Aldrich8340Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2Eurogentec S.A.customAntibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2Merck07-013Antibody
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS3014Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)Meso Scale DiagnosticsW0015528SAntibody
TAT-MeCP2 fusion proteinin-house productionCell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X)gibco by Life Technologies25200-056Cell treatment
Tween 20Sigma-AldrichP9416Washing solution

References

  1. Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).
  2. Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
  3. Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
  4. Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
  5. Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
  6. Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
  7. Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
  8. Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
  9. Laccone, F. A. . Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).
  10. Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
  11. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  12. Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
  13. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  14. Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
  15. Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
  16. Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
  17. Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
  18. Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159 ECLIA MeCP2 TAT TAT MeCP2 Rett

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved