Un essai à base d’électrochimie pour Les variantes de protéines MeCP2

Résumé

L’immunoassay d’électrochimie (ECLIA) est une nouvelle approche pour la détection quantitative des variantes de protéines MeCP2 endogènes et exogènement appliquées, qui produit des mesures hautement quantitatives, précises et reproductibles avec une erreur intra- et inter-essais faible sur un large éventail de travail. Ici, le protocole pour le MeCP2-ECLIA dans un format de 96 puits est décrit.

Résumé

L’ECLIA est une méthode polyvalente qui est capable de quantifier les quantités de protéines endogènes et recombinantes dans un format de 96 puits. Pour démontrer l’efficacité d’ECLIA, cet essai a été employé pour analyser des niveaux intrinsèques de MeCP2 dans le tissu de cerveau de souris et l’absorption de TAT-MeCP2 dans les fibroblastes dermals humains. Le MeCP2-ECLIA produit des mesures très précises et reproductibles avec une faible erreur intra-analyse et inter-analyse. En résumé, nous avons développé une méthode quantitative pour l’évaluation des variantes de protéines MeCP2 qui peuvent être utilisées dans des écrans à haut débit.

Introduction

L’immunoassay d’électrochimie (ECLIA) est basé sur un processus qui utilise des étiquettes conçues pour émettre de la luminescence lorsqu’elles sont stimulées électrochimiquement. Il s’agit d’une technique largement applicable pour la détection quantitative des analytes biologiques dans l’industrie de base et la recherche universitaire, l’industrie alimentaire ainsi que dans le diagnostic clinique¹. Généralement, une plaque jetable de 96 puits avec des électrodes en encre de carbone est utilisée. Ces électrodes agissent comme un porteur de phase solide pour l’immunoassay. Un anticorps secondaire est conjugué à une étiquette électrochimique et lorsque l’électricité est appliquée au système, l’émission de lumière de l’étiquette chimique est déclenchée. Un dispositif ultra-faible de charge de bruit (CCD) enregistre l’intensité lumineuse qui est directement proportionnelle à l’antigène lié à l’anticorps de capture ayant pour résultat la quantification de l’analyte ciblé de l’échantillon². Par rapport à l’essai immunosorbent lié à l’enzyme (ELISA), ECLIA est considéré comme avantageux car il offre une plus grande sensibilité et reproductibilité ainsi qu’une meilleure automatisation et la cohérence³.

Ici, nous avons analysé les niveaux de protéine liant méthyle-CpG 2 (MeCP2) dans des échantillons d’origine humaine et trouble ainsi que différentes variantes de la protéine recombinante utilisant le système ECLIA nouvellement développé. MecP2 est une protéine nucléique liée à l’acide X connue pour interagir avec des séquences d’ADN méthylées. Cette protéine a été impliquée dans la régulation de l’expression génique^4,5. Les mutations de perte de fonction dans le gène qui code cette protéine sont les principaux coupables causant le syndrome de Rett (RTT), un désordre neurodéveloppemental grave⁶. Un autre trouble lié à MeCP2, syndrome de duplication MECP2, conduit également à des symptômes neurologiques qui peuvent se chevaucher avec ceux de RTT⁷. Notamment, les femelles sont principalement affectées par RTT tandis que les mâles sont pour la plupart affligés par le syndrome de duplication MECP2 ^6,7.

Ces troubles sont associés à des niveaux insuffisants ou excessifs de MeCP2 respectivement dans le système nerveux central (SNC). Par conséquent, les options de traitement pour RTT qui impliquent l’augmentation des niveaux meCP2 dans le SNC devraient éviter les effets néfastes associés à l’excès de MeCP2⁷. En raison de ce fait, une quantification très sensible et précise des niveaux de protéines MeCP2, tel que fourni par le système ECLIA, est crucial pour l’avancement de rtT ainsi que la recherche sur le syndrome de duplication MECP2. Les mesures précises des niveaux endogènes et exogènes meCP2 des lignées cellulaires humaines et des échantillons de tissu de souris ainsi qu’une protéine recombinante composée de l’isoforme B humaine MeCP2 (également connu sous le nom d’isoforme e1), et un domaine minimal de transduction N-terminal HIV-TAT (TAT-MeCP2) qui a le potentiel de traverser la barrière hémato-encéphalique^8,,9 sont présentées dans ce travail.

Protocole

L’approbation de l’approvisionnement en biopsie de la peau à des fins de recherche a été obtenue auprès du Comité d’éthique de la recherche humaine de l’Hôpital pour enfants de Westmead, en Australie. Le consentement pour les expériences animales a été obtenu auprès du Ministère fédéral autrichien des sciences, de la recherche et de l’économie, qui ont été effectués conformément aux règlements locaux sur le bien-être animal (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

REMARQUE : Le principe du système ECLIA est représenté à la figure 1.

1. Sélection d’anticorps

1. Évaluez le rapport signal-bruit pour une gamme de divers anticorps MeCP2 et identifiez la meilleure force de signal et la plus grande spécificité dans la combinaison d’un anticorps monoclonal de souris primaire MeCP2 (clone Mec-168) et d’anticorps de détection polyclonal de lapin MeCP2 (fabriqué sur mesure). Pour l’anticorps secondaire, utilisez un anticorps spécifique au système(tableau des matériaux), qui a également été vérifié expérimentalement.
   REMARQUE : Le tableau 1 donne un aperçu de tous les anticorps vérifiés pendant le développement de MeCP2-ECLIA et de leurs plages de dilution testées.

Fonction	Nom	Clone	Dilution
Primaire	Souris, anti-MeCP2	Mec-168	1:500-1:10,000
Primaire	Souris, anti-MeCP2	4B6	1:250-1:4,000
Primaire	Souris, anti-MeCP2	Hommes-8	1:500-1:4,000
Primaire	Souris, anti-MeCP2	1B11	1:500-1:4,000
Primaire	Lapin, anti-MeCP2	D4F3	1:500-1:4,000
Secondaire	Lapin, anti-MeCP2	Polyclonaux	1:2,000-1:20,000
Secondaire	Lapin, anti-MeCP2	Polyclonaux	1:2,000-1:20,000
Détection	SULFO-TAG étiqueté anti-lapin	Polyclonaux	1:500-1:1,000

Tableau 1 : Liste des anticorps et des dilutions de travail utilisées.

2. Vous pouvez également utiliser chaque paire d’anticorps MeCP2 qui fonctionne bien avec l’ELISA classique.

2. Traitement des HDFs avec protéine de fusion TAT-MeCP2

REMARQUE : LE TAT-MeCP2 a été récombiné dans Escherichia coli et purifié à l’aide de techniques chromatographiques standard comme indiqué précédemment⁸ et stockés à -80 oC.

1. Plaque 1 x 10⁶ cellules de fibroblaste dermique humain (HDF) dans des plats de 100 mm et cultivez les cellules pendant la nuit à 37 oC avec 5 % de CO₂ jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 90 % de confluence.
2. Sortez une fiole de protéine de fusion TAT-MeCP2. Décongeler sur la glace et mélanger délicatement.
3. Diluer TAT-MeCP2 à une concentration finale de 500 nM dans 50 mL de médias culturels HDF.
4. Retirez le support des plats de 100 mm et incuber les cellules avec 500 nM TAT-MeCP2 à 37 oC pour diverses périodes d’incubation jusqu’à 24 h.
5. Retirez la solution TAT-MeCP2 des cellules. Laver les cellules 2x avec pré-réchauffé Dulbecco phosphate tamponné saline (DPBS).
6. Traiter les cellules avec 2 ml de solution trypsin-EDTA à 0,05 % pendant 5 min à 37 oC¹⁰.
7. Ajouter 6 ml de support de culture HDF pour inactiver la trypsine et recueillir les cellules dans des tubes de 15 ml.
8. Pelleter les cellules par centrifugation à 500 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
9. Retirer le supernatant et laver les cellules 2x avec DPBS glacé. Rangez le granulé sur la glace et procédez à la préparation de l’échantillon.

3. Préparation de l’échantillon

1. HDF lysates
   1. Déterminez les niveaux de protéines les plus élevés de MeCP2 en utilisant la méthode REAP pour la fractionnement subcellulaire dans les compartiments subcellulaires cytoplasmiques et nucléaires selon Suzuki et coll.¹¹. Limiter la fractionnement à pas plus de six échantillons par expérience.
2. lysates de cerveau de souris
   1. Préparer 100 ml de chaque réactif hypotonique et tampon d’extraction.
      1. Pour le réactif hypotonique de lyse, mélanger bien 10 mM HEPES, 1,5 mM de chlorure de magnésium et 10 mm de chlorure de potassium.
      2. Pour le tampon d’extraction, mélanger bien 20 mM HEPES, 1,5 mM de chlorure de magnésium, 0,42 M de chlorure de sodium, 0,2 mM EDTA et 25% (v/v) glycérol.
      3. Ajuster le pH des deux tampons à 7,9.
      4. Ajouter 1 mM dithiothreitol (TNT) et 1x cocktail inhibiteur de protéase aux deux tampons fraîchement. Refroidir sur la glace avant l’utilisation.
   2. Suspendre 100 mg du cerveau total de la souris (souche : C57BL/6J, mâle et femelle de type sauvage et B6.129P2(C)-Mecp2^tm1.1Bird/J,mâle hemizygous et femelle hétérozygote; âge : 4-8 semaines) dans 1 mL de froid hypotonique froid lysis reagent.
   3. Homogénéisez le cerveau avec un homogénéisateur de tissu tout en verre Dounce pré-réfrigéré par 15 coups d’homogénéiseur A (lâche, pour le dégagement important) et B (serré, pour le petit dégagement), respectivement.
   4. Transférer les cellules homogénéisées dans un tube propre et une centrifugeuse à 10 000 x g pendant 20 min à 4 oC. Jetez le supernatant (ou gardez-le comme fraction cytoplasmatique pour une utilisation ultérieure).
   5. Réutilisez la granule dans 140 l de tampon d’extraction par 100 mg de matériau de départ. Placer le tube dans un thermobloc pré refroidi et mélanger délicatement pendant 30 minutes à 4 oC.
   6. Centrifuge le tube à 16.000 g pendant 10 min à 4 oC. Transférer le supernatant (c.-à-d. la fraction nucléaire) dans un nouveau tube pré-réfrigéré et conserver à -80 oC jusqu’à l’utilisation.
      REMARQUE : La concentration de protéines de lysates dérivées du cerveau de souris et des HDF peut être évaluée par l’essai de protéine de BCA.

4. Protocole MeCP2-ECLIA

1. Préparation de la solution de lavage, tampon de blocage et solution diluente d’essai (jour 1)
   1. Ajoutez 500 L de Tween 20 à 1 L de PBS pour préparer une Tween 20 de 0,05 % dans la solution PBS, mélanger vigoureusement et étiqueter comme « solution de lavage ».
      REMARQUE : Assurez-vous que seul le tampon de lavage fraîchement préparé est utilisé.
   2. Préparer une solution de blocage de 3% de bloqueur A(Tableau des matériaux) en saline tamponnée par phosphate (PBS). Mélanger en remuant doucement, filtrer la stérilisation et les conserver au réfrigérateur jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pendant un maximum de deux semaines.
   3. Ajoutez 5 ml de solution de blocage à 10 ml de PBS pour préparer la solution de diluent d’essai (1 % de bloqueur A dans PBS).
2. Revêtement des plaques de linge haute
   1. Sortez une plaque de lier haute à un seul endroit multi-array 96-well.
      REMARQUE : Les plaques de lier élevées ont une plus grande capacité de liaison et donc une plus grande plage dynamique que les plaques standard avec des surfaces hydrophobes.
   2. Décongeler l’anticorps anti-MeCP2 de souris monoclonale sur la glace et mélanger 0,67 l d’anticorps avec 4 ml de PBS (1:6,000 dilution d’anticorps dans PBS). Vortex la solution d’anticorps pour bien mélanger et étiqueter le tube comme "solution de revêtement".
   3. Distribuez soigneusement 25 L de solution de revêtement dans le coin inférieur de chaque puits à l’aide d’un tuyauteur multicanal; c’est ce qu’on appelle la méthode de revêtement de solution. Appuyez doucement sur la plaque de 96 puits de chaque côté pour vous assurer que la solution de revêtement couvre le fond de chaque puits.
   4. Sceller l’assiette avec un papier d’aluminium adhésif et incuber l’assiette au réfrigérateur à 4 oC pendant la nuit (12-16 h).
3. Blocage (jour 2)
   1. Sortir l’assiette du réfrigérateur et retirer le papier d’aluminium.
   2. Retirez la solution de revêtement d’anticorps en la faisant glisser dans le panier à déchets et appuyez sur la plaque sur un essuie-tout pour enlever toute la solution de revêtement des puits.
   3. Ajouter 125 L de solution de blocage par puits. Scellez à nouveau la plaque et placez-la sur un shaker orbital de microplaque.
   4. Incuber la plaque pendant 90 min à température ambiante avec secousse constante à 800 tr/min.
4. Préparation des normes et des échantillons
   1. Pendant le temps d’incubation, préparez les normes de protéines MeCP2 et/ou TAT-MeCP2 et divers échantillons.
      REMARQUE : Le tampon de Lyse utilisé pour la dilution standard doit être le même que celui utilisé dans les échantillons analysés.
   2. Sortez une fiole de mePC2 et/ou de la solution de stock de protéines TAT-MeCP2 (250 g/mL), des lysates du cerveau de souris et des lysates HDF à partir de -80 oC. Décongeler sur la glace.
   3. Diluer la solution de stock standard (MeCP2 et/ou TAT-MeCP2) dans des tubes propres selon le tableau 2.
   4. Diluer les échantillons dans le tampon de lyse comme suit : 1 à 20 g de lysate du cerveau de souris par tampon de lyse de 25 l et 0,25 à 1 g de HDF lysate par tampon de lyse de 25 ll. Préparer suffisamment de volume de chaque échantillon pour effectuer l’analyse en triplicate.

Standard	Concentration	Dilution
Norme 1	1 800 ng/mL	Solution d’actions standard de 1,08 l ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '
Norme 2	600 ng/mL	50 L Standard 1 '100 'L 'L Lysis tampon
Norme 3	200 ng/mL	50 L Standard 2 '100 'L 'L Lysis tampon
Norme 4	66,67 ng/mL	50 L Standard 3 et 100 L tampon de Lysis
Norme 5	22,22 ng/mL	50 L Standard 4 '100 'L 'L Lysis tampon
Norme 6	7,41 ng/mL	50 L Standard 5 '100 'L 'L Lysis tampon
Norme 7	2,47 ng/mL	50 L Standard 6 '100 'L 'L Lysis tampon
Norme 8	0,82 ng/mL	50 L Standard 7 '100 'L 'L Lysis tampon
Norme 9	0,27 ng/mL	50 L Standard 8 '100 'L 'L Lysis tampon
Norme 10	0 ng/mL	Tampon de 150 l de Lysis

Tableau 2 : Série standard de 0 à 1 800 ng/mL.

5. Ajout d’échantillons et de solutions standard
   1. Retirez la solution de blocage en la faisant glisser dans le panier à déchets et appuyez sur la plaque sur un essuie-tout pour supprimer toute la solution de blocage des puits.
   2. Laver la plaque 3x avec 150 l de solution de lavage en ajoutant la solution de lavage et en l’enlevant immédiatement.
   3. Ajoutez 25 ul de normes et d’échantillons au coin inférieur du puits à l’aide d’une pipette à canal unique.
   4. Scellez la plaque et incuber la plaque pendant 4 h à température ambiante avec une secousse constante à 800 tr/min.
6. Anticorps de détection non étiquetés
   1. Décongeler l’anticorps anti-MeCP2 de lapin polyclonal sur la glace. Diluer l’anticorps 1:6,000 dans la solution diluent d’essai.
   2. Retirez les normes et les échantillons en le faisant glisser dans le panier à déchets et appuyez sur la plaque sur un essuie-tout.
   3. Laver la plaque 3x avec 150 l de solution de lavage en ajoutant la solution de lavage et en l’enlevant immédiatement.
   4. Ajouter 25 L d’anticorps de détection non étiquetés à chaque puits avec le tuyauteur multicanal. Scellez la plaque et incuber pendant 1 h avec une secousse constante à 800 tr/min à température ambiante.
7. Anticorps conjugués spécifiques
   1. Sortez l’anticorps secondaire spécifique(tableau des matériaux) du réfrigérateur et placez-le sur la glace. Diluer l’anticorps 1:666.67 dans la solution de diluent d’essai et mélanger doucement.
   2. Retirez l’anticorps secondaire non étiqueté en le faisant glisser dans le panier à déchets et appuyez sur la plaque sur un essuie-tout.
   3. Laver la plaque 3x avec 150 l de solution de lavage en ajoutant la solution de lavage et en l’enlevant immédiatement.
   4. Ajoutez 25 L d’anticorps conjugués spécifiques(tableau des matériaux)à chaque puits avec le tuyauteur multicanal. Scellez la plaque et incuber pendant 1 h avec une secousse constante à 800 tr/min à température ambiante.
8. Lecture de l’assiette
   1. Retirez l’anticorps conjugué gratuit (tableau des matériaux) en le faisant glisser dans le panier à déchets et appuyez sur la plaque sur un essuie-tout.
   2. Laver la plaque 3x avec 150 l ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '
   3. Ajoutez 150 L de tampon de lecture d’or à base de 1x Tris(Tableau des matériaux) avec un surfactant contenant de la tripropylamine comme co-réactif pour la production légère à l’assiette. Évitez les bulles d’air en utilisant des techniques de tuyauterie inversée.
   4. Placez la plaque sur la plate-forme de détection des microplates(tableau des matériaux) et commencez la mesure immédiatement. Utilisez les paramètres pour l’acquisition de plaques de 96 puits.
   5. Capturez les signaux d’électrochimie par une caméra CCD intégrée dans un système de détection d’électrochimie(Tableau des matériaux) et enregistrez les nombres de signaux, qui correspondent aux unités de lumière relatives (RLU) et sont directement proportionnels à l’intensité de la lumière.
      REMARQUE : Lors de la stimulation électrochimique, l’étiquette de ruthénium liée à l’électrode de carbone émet une lumière de luminescence à 620 nm. Analyser les données avec le logiciel accompagné d’instruments(Tableau des matériaux).

Résultats

Le principe du système ECLIA est décrit à la figure 1. Les courbes standard pour deux variantes MeCP2 sont indiquées dans la figure 2. La quantification précise était possible sur un large éventail de concentrations (1 à 1 800 ng/mL). Dans la figure 3, les niveaux de lysates meCP2 dérivés du cerveau de souris et des HDF ont été analysés. L’expression meCP2 dans les lysates nucléaires du cerveau des hétérozygotes, d...

Discussion

Pour mesurer les niveaux endogènes MeCP2, recombinants MeCP2 et TAT-MeCP2, une plaque de 96 puits ECLIA a été développée. Il a été démontré que la perte de la fonction de protéine MeCP2 conduit au syndrome de RTT⁶, pour lequel le traitement est actuellement limité à la gestion des symptômes et la physiothérapie. Une avenue de traitement prometteuse est la thérapie de remplacement de protéine, où les niveaux de MeCP2 peuvent être titrés jusqu’à leur concentration nécessaire

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad Laboratories Inc.	500-0006	Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit	Meso Scale Diagnostics	R32AB-1	Antibody
Discovery workbench 4.0	Meso Scale Discovery		Software
DMEM (1X)	gibco by Life Technologies	41966-029	Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Sample preperation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant	Meso Scale Diagnostics	R92TG	MeCP2 ECLIA protocol
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)	GFL	3014	MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)	Sigma-Aldrich	M2670	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)	Abnova Corporation	H00004204-P01	Cell treatment
Microseal B seal	Bio-Rad Laboratories Inc.	MSB1001	for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin	Sigma-Aldrich	M6818-100UL; RRID:AB_262075	Antibody, Coating solution
MSD Blocker A	Meso Scale Diagnostics	R93BA-4	Blocker
MSD SECTOR Imager 2400	Meso Scale Diagnostics	I30AA-0	MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate	Meso Scale Diagnostics	L15XB-3/L11BX-3	MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin	gibco by Life Technologies	15140122	Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit	Eurogentec S.A.	custom-designed	Antibody
Potassium chloride (KCl)	Merck KGaA	1049361000	Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)	Sigma-Aldrich	SAB1404063; RRID:AB_10737296	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)	Sigma-Aldrich	WH0004204M1; RRID:AB_1842411	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)	Sigma-Aldrich	M6818; RRID:AB_262075	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)	Sigma-Aldrich	M7443; RRID:AB_477235	Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)	Cell Signaling Technology	3456S; RRID:AB_2143849	Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Sigma-Aldrich	8340	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Eurogentec S.A.	custom	Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Merck	07-013	Antibody
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014	Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)	Meso Scale Diagnostics	W0015528S	Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein	in-house production		Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X)	gibco by Life Technologies	25200-056	Cell treatment
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Washing solution