בסיס אלקטרוכימי מבוסס-מיניאונציה עבור גרסאות חלבון MeCP2

Summary

שיטת החיסוני האלקטרוכימי (ECLIA) היא גישה מקורית לזיהוי כמותי של משתני חלבון MeCP2, המייצרת מדידות כמותית, מדויקת ומדוייקת ובעלת שגיאה בתוך ובין-שיטה נמוכה בטווח עבודה רחב. כאן, הפרוטוקול עבור MeCP2-ECLIA בפורמט 96-ושוב מתואר.

Abstract

ECLIA היא שיטה רב-תכליתית אשר מסוגל לכמת אנדוגני וכמויות חלבון רקומביננטי בפורמט 96. כדי להדגים את היעילות ECLIA, השימוש באותה שימוש כדי לנתח רמות פנימיות של MeCP2 ברקמת המוח של העכבר ואת ספיגת של תאת-MeCP2 בתוך העור האדם פיברופיצוצים. MeCP2-ECLIA מייצרת מדידות מדויקות ומובנות עם שגיאה נמוכה בתוך ובין-שיטת הספק. לסיכום, פיתחנו שיטה כמותית להערכת משתני חלבון MeCP2 שניתן לעשות בהם שימוש במסכי תפוקה גבוהה.

Introduction

הטיפול החיסוני האלקטרוכימי (ECLIA) מבוסס על תהליך העושה שהוא משתמש בתוויות המיועדות לפלוט לומיאוציה כאשר מגורה באמצעות אלקטרוכימית. זוהי טכניקה הישימה באופן כללי עבור גילוי כמותי של אנליטים ביולוגיים בתעשייה בסיסית ומחקר אקדמי, תעשיית המזון, כמו גם באבחון קליני¹. בדרך כלל, 96 חד פעמי עם אלקטרודות לדיו פחמן משמש. אלקטרודות אלה משמשים כמוביל בשלב מוצק עבור שיטת החיסוני. נוגדן משני מצומת לתווית אלקטרוכימית וכאשר החשמל מוחל על המערכת, פליטת האור של התווית הכימית מופעלת. אולטרה נמוך במיוחד המטען מצמידים מכשיר (CCD) רשומות את עוצמת האור אשר פרופורציונלי באופן ישיר אנטיגן מאוגד לנוגדן לכידת וכתוצאה מכך את הכמת של המטרה של המדגם². לעומת שיטת החיסוני הקשורה באנזימים (אליסה), ECLIA נחשבת ליתרון כפי שהוא מציע רגישות גבוהה יותר, מיוציציה, כמו גם אוטומציה טובה יותר ועקביות³.

כאן ניתחנו את החלבון כריכת מתיל-CpG 2 (MeCP2) רמות בדגימות של מקור אנושי מורמי, כמו גם גרסאות שונות של החלבון רקומביננטי באמצעות מערכת ECLIA שפותחה לאחרונה. MecP2 הוא מקושר X הגרעין חומצה מחייב חלבון ידוע לקיים אינטראקציה עם רצפי DNA ממתיל. החלבון הזה היה מעורב בוויסות. הביטוי הגנטי^4,5 אובדן הפונקציה של מוטציות בגן אשר מקודד חלבון זה הם הפושעים העיקריים גורם Rett תסמונת (RTT), הפרעה חמורה התפתחותית הנוירולוגית⁶. עוד הפרעה MeCP2 הקשורות, תסמונת שכפול MeCP2 , גם מוביל סימפטומים נוירולוגיים שיכולים חופפים עם אלה של rtt⁷. בעיקר, הנקבות מושפעות בעיקר על ידי rtt בעוד הזכרים הם⁶נגועים בעיקר על ידי תסמונת MECP2 ^{שכפול 6,7}.

הפרעות אלה משויכות לרמות MeCP2 לא מספיקות או עודפות בהתאמה במערכת העצבים המרכזית (CN). מכאן, אפשרויות טיפול RTT המערבות הגדלת רמות MeCP2 ב-CN צריך למנוע את ההשפעות מזיקים הקשורים עם עודף של MeCP2⁷. בשל עובדה זו, ככמת מאוד רגיש ומדויק של רמות החלבון MeCP2, כפי שסופקו על ידי מערכת ECLIA, היא חיונית לקידום RTT כמו גם MeCP2 מחקר תסמונת שכפול. המדידות המדויקות של רמות אנדודוגני ואקסודוגני MeCP2 מקווי התאים האנושיים ודגימות רקמות העכבר, כמו גם חלבון רקומביננטי המורכב של האדם MeCP2 isoform B (הידוע גם בשם isoform e1), ו מינימלי N-מסוף התמרה התחום HIV-תאת (תאת-MeCP2) כי יש⁸את הפוטנציאל לחצות את מוח הדם-^{מחסום 8,9} מוצגים בעבודה זו.

Protocol

אישור לרכישת ביופסיה לעור לצורכי מחקר התקבל מוועדת האתיקה של מחקר האדם בבית החולים לילדים בווסטמיד, אוסטרליה. הסכמה לניסויים בבעלי חיים הושגה מהמשרד הפדרלי האוסטרי של מדע, מחקר וכלכלה, אשר בוצעו בהתאם לתקנות בעלי חיים מקומיים לרווחת (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

הערה: העיקרון של מערכת ה-ECLIA מתואר באיור 1.

1. בחירת נוגדנים

1. הערכת יחס אות לרעש עבור מגוון של נוגדנים MeCP2 שונים ולזהות את עוצמת האות הטובה ביותר ואת הספציפיות ביותר בתוך שילוב של MeCP2 נוגדן העכבר העיקרי (שיבוט Mec-168) ו הארנב polyclonal בטים MeCP2 נוגדן זיהוי (נעשה בהתאמה אישית). עבור הנוגדן המשני, השתמש בנוגדן ספציפי למערכת (טבלת חומרים), שהיה גם מאומת.
   הערה: טבלה 1 מעניקה סקירה של כל הנוגדנים האומתו במהלך פיתוח MECP2-eclia וטווחי הדילול שלהם נבדק.

פונקציה	שם	שיבוט	דילול
ראשי	עכבר, אנטי MeCP2	Mec-168	1:500 לאחד: 10000
ראשי	עכבר, אנטי MeCP2	מיכל כהן	1:250-1:4000
ראשי	עכבר, אנטי MeCP2	גברים-8	1:500-1:4000
ראשי	עכבר, אנטי MeCP2	מיכל בייס	1:500-1:4000
ראשי	ארנב, אנטי MeCP2	D4F3	1:500-1:4000
שני	ארנב, אנטי MeCP2	פוליבטיים	1:2000-1:20000
שני	ארנב, אנטי MeCP2	פוליבטיים	1:2000-1:20000
זיהוי	SULFO-תג מתויג אנטי ארנב	פוליבטיים	1:500-1:1000

שולחן 1-רשימת נוגדנים ומדלל עבודה משומשים.

2. לחלופין, השתמש בכל זוג של MeCP2-נוגדנים הפועלים היטב עם אליסה המקובלת.

2. טיפול HDFs עם היתוך תאת-MeCP2 חלבון

הערה: תאת-MeCP2 היה recombinantly ביטא es, coli ומטוהר באמצעות טכניקות כרומוגרפיות סטנדרטיות כפי שתוארה בעבר⁸ ומאוחסן ב-80 ° c.

1. צלחת 1 x 10⁶ בתאי הגוף האנושי (hdf) תאים ב 100 מ"מ מנות ולגדול את התאים לילה ב 37 ° צ' עם 5% CO₂ עד שהם מגיעים על 90% שליטה.
2. תוציא בקבוקון אחד. מחלבון ההיתוך תאת-MeCP2 . להפשיר על קרח ולערבב בעדינות
3. לדלל תאת-MeCP2 לריכוז הסופי של 500 nM ב 50 mL של מדיה תרבות HDF.
4. להסיר את המדיה מתוך 100 מ"מ מנות ו-דגירה את התאים עם 500 ננומטר תאת-MeCP2 ב 37 ° צ' לתקופות דגירה שונות עד 24 h.
5. הסר את הפתרון תאת-MeCP2 מהתאים. לשטוף את התאים 2x עם תמיסת מלח פוספט מחומם מראש של Dulbecco (DPBS).
6. פנקו את התאים בעלי 2 מ ל של 0.05% טריפסין-EDTA עבור 5 דקות ב 37 ° c¹⁰.
7. הוסיפו 6 מ ל של מדיית תרבות HDF כדי להשבית את טריפסין ולאסוף את התאים בצינורות של 15 מ"ל.
8. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
9. הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים 2x עם DPBS קר קרח. לאחסן את הגלולה על הקרח ולהמשיך עם ההכנה לדוגמא.

3. הכנה לדוגמא

1. ליטים HDF
   1. לקבוע את רמות החלבון הגבוה ביותר של MeCP2 באמצעות שיטת הקצירה לשבר הסלולר לתוך התאים הגרעיניים cytoplasmic והגרעין על פי סוזוקי et al.¹¹. הגבל שבירה ליותר משישה דגימות לכל ניסוי.
2. המוח העכבר ליסוטים
   1. הכינו 100 mL של כל לפירוק ההיפוטוניקה מגיב ומאגר החילוץ.
      1. עבור לפירוק ההיפוטוניקה מגיב, מערבבים היטב 10 מ"מ HEPES, 1.5 מ"מ מגנזיום כלוריד ו 10 מ"מ אשלגן כלוריד.
      2. עבור מאגר החילוץ, מערבבים היטב 20 מ"מ HEPES, 1.5 מ"מ מגנזיום כלוריד, 0.42 M נתרן כלוריד, 0.2 mM EDTA, ו -25% (v/v) גליצרול.
      3. כוונן את ה-pH של שני המאגרים ל-7.9.
      4. הוסף 1 מילימטר ממדי dithioitol (DTT) ו-1x מעכב פרוטאז קוקטייל שני מאגרים טרי. הירגע על הקרח לפני השימוש.
   2. להשעות 100 מ"ג של המוח הכללי של העכבר (זן: C57BL/6J, wildtype זכר ונקבה ו B 6.129 P2 (C)-Mecp2^{tm 1.1 bird}/j, hemizygous זכר וheterozygous נקבה; גיל: 4-8 שבועות הישן) ב 1 מ ל של הקרח קר לפירוק ההיפוטון מגיב.
   3. המגון לסדר את המוח עם מקורר לפני כל זכוכית הומוגנידצר רקמות על ידי 15 משיכות של הומוגניצר A (רופף, עבור הרשאה גדולה) ו-B (הדוק, עבור הרשאה קטנה), בהתאמה.
   4. העבר את התאים המהומוגניים לצינור נקי וצנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c. התעלם מהסופרנטנט (או שמור אותו כשבר cytoplasmatic לשימוש נוסף).
   5. השהה מחדש את הגלולה ב-140 μL של מאגר החילוץ לכל 100 מ"ג של חומר התחלתי. הניחו את הצינור בבלוק תרמותרמי מראש וערבבו בעדינות במשך 30 דקות ב -4 ° c.
   6. צנטריפוגה את הצינור ב 16,000 g עבור 10 דקות ב 4 ° c. העבר את הסופרנטאנט (כלומר, השבר הגרעיני) לצינור מקורר חדש ולחנות ב-80 ° c עד השימוש.
      הערה: ריכוז החלבון של lysates נגזר ממוח העכבר ו-HDFs ניתן להעריך על ידי שיטת החלבון BCA.

4. MeCP2-פרוטוקול ECLIA

1. הכנת פתרון כביסה, חסימת פתרון מאגר ושיטת מדלל (יום 1)
   1. הוסף 500 μL של רצף של 20 אל 1 L של PBS כדי להכין 0.05% רצף 20 בפתרון PBS, לערבב במרץ ותווית כמו "פתרון כביסה".
      הערה: ודא שנעשה שימוש רק במאגר הכביסה המוכן לשימוש.
   2. הכנת פתרון חסימה של 3% חוסם A (טבלת חומרים) בתמיסת מלח מאגור פוספט (PBS). מערבבים על ידי ערבוב עדין, מסנן לעקר ולשמור אותם במקרר עד לשימוש עבור שבועיים לכל היותר.
   3. הוסף 5 מ ל של פתרון חסימה ל 10 מ ל של PBS כדי להכין את הפתרון שיטת הפעולה (1% חוסם A ב PBS).
2. ציפוי לוחות מאגד גבוה
   1. קח את 96-היטב multi-מערך בודד במקום יחיד לאגד לוחית גבוהה.
      הערה: לוחיות האיגוד הגבוהות כוללים קיבולת מחייבת גדולה יותר ולכן טווח דינמי גדול יותר מלוחות סטנדרטיים עם משטחי הידרופובי.
   2. הפשרת העכבר מונוקובטיים anti-MeCP2 נוגדן על הקרח ולערבב 0.67 μL של הנוגדן עם 4 מ ל של PBS (1:6000 נוגדן דילול ב-PBS). מערבולת פתרון הנוגדן לערבב היטב ולתייג את הצינור כמו "פתרון ציפוי".
   3. בזהירות לוותר על 25 μL של פתרון ציפוי בפינה התחתונה של כל טוב באמצעות מצנפיאור רב-ערוצי; הדבר נקרא שיטת ציפוי הפתרון. הקש על צלחת ה-96 בעדינות על כל צד כדי לוודא שפתרון הציפוי מכסה את החלק התחתון של כל באר.
   4. אטום את הצלחת בנייר דבק והטה את הצלחת במקרר ב -4 ° c ללילה (12-16 שעות).
3. חסימה (יום 2)
   1. הוציאו את הצלחת מהמקרר והסירו את נייר הכסף.
   2. הסר את הפתרון ציפוי נוגדן על ידי מצליף אותו לסל האשפה ולהקיש על צלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל פתרון ציפוי מן הבארות.
   3. הוסף 125 μL של פתרון חסימה לכל טוב. לאטום את הצלחת שוב ולמקם אותו על שייקר מיקרולוח מסלולית.
   4. מודטה את הצלחת עבור 90 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול קבוע ב 800 סל ד.
4. הכנות של תקנים ודוגמאות
   1. בזמן הדגירה, הכינו את תקני החלבון MeCP2 ו/או תאת-MeCP2 ודגימות שונות.
      הערה: מאגר לייליזה המשמש לדילול סטנדרטי חייב להיות זהה לזה שנעשה בו שימוש בדגימות שנותחו.
   2. להוציא בקבוקון אחד של MePC2 ו/או תאת-MeCP2 מלאי חלבון פתרון (250 μg/mL), המוח העכבר lysates ו HDF lysates מ-80 ° c. . להפשיר אותם על קרח
   3. דלל את פתרון המניה הסטנדרטית (MeCP2 ו/או תאת-MeCP2) בצינורות נקיים לפי טבלה 2.
   4. לדלל את הדגימות במאגר לפירוק כדלקמן: 1-20 μg של המוח העכבר ליפוסט לכל 25 μL של מאגר לפירוק, ו 0.25-1 μg של HDF ליפוסט 25 μL של מאגר לפירוק. הכן מספיק נפח של כל מדגם כדי לבצע ניתוח בטרילקאט.

רגיל	ריכוז	דילול
תקן 1	1,800 ng/mL	1.08 μL רגיל פתרון מניות + 148.92 μL לליזה מאגר
חדר סטנדרט 2	600 ng/mL	50 μL סטנדרטי 1 + 100 μL מאגר לוליזיס
חדר סטנדרט 3	200 ng/mL	50 μL סטנדרטי 2 + 100 μL לליזה מאגר
חדר סטנדרט 4	66.67 ng/mL	50 μL סטנדרטי 3 + 100 μL לוליזיס מאגר
חדר סטנדרט 5	22.22 ng/mL	50 μL סטנדרטי 4 + 100 μL מאגר לוליזיס
חדר סטנדרט 6	7.41 ng/mL	50 μL רגיל 5 + 100 μL מאגר לוליזיס
חדר סטנדרט 7	2.47 ng/mL	50 μL רגיל 6 + 100 μL מאגר לוליזיס
רגיל 8	0.82 ng/mL	50 μL סטנדרטי 7 + 100 μL מאגר לוליזיס
חדר סטנדרט 9	0.27 ng/mL	50 μL סטנדרטית 8 + 100 μL לליזה מאגר
חדר סטנדרט 10	0 ng/mL	מאגר הליזה 150 μL

טבלה 2: סדרות סטנדרטיות בין 0 ל-1,800 ng/mL.

5. הוספת דגימות ופתרונות סטנדרטיים
   1. הסר את פתרון חסימת ידי מצליף אותו לסל הפסולת ולהקיש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל פתרון חסימת מבארות.
   2. לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של הפתרון כביסה על ידי הוספת פתרון כביסה ומיד להסיר אותו.
   3. הוסף 25 ul של תקנים ודגימות לפינה התחתונה של הבאר באמצעות צינור בודד בערוץ.
   4. חותם את הצלחת ו מודקת את הצלחת עבור 4 h בטמפרטורת החדר עם טלטול קבוע ב 800 סל ד.
6. נוגדן זיהוי ללא תווית
   1. להפשיר את הארנב רב שבטיים anti-MeCP2 נוגדן על הקרח. לדלל את הנוגדן 1:6000 בתוך שיטת הפתרון.
   2. הסר את הסטנדרטים והדגימות על-ידי הצליף בו לסל הפסולת והקש על הצלחת על מגבת נייר.
   3. לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של הפתרון כביסה על ידי הוספת פתרון כביסה ומיד להסיר אותו.
   4. הוסף 25 μL של נוגדן זיהוי ללא תווית לכל טוב עם הצינורות הרב-ערוצי. חותם את הצלחת ו מודקת אותו עבור 1 h עם טלטול קבוע ב 800 rpm בטמפרטורת החדר.
7. נוגדן ספציפי
   1. קחו את הנוגדן המשני המסוים (טבלת חומרים) מהמקרר והניחו אותו על הקרח. לדלל את הנוגדן 1:666.67 בתוך הפתרון בסדר ומערבבים בעדינות.
   2. להסיר את הנוגדן ללא תווית משנית על ידי מצליף אותו בסל האשפה ולהקיש על צלחת על מגבת נייר.
   3. לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של הפתרון כביסה על ידי הוספת פתרון כביסה ומיד להסיר אותו.
   4. הוסף 25 μL של נוגדן ספציפי (טבלת חומרים) לכל טוב עם הצינורות הרב רב-ערוצי. חותם את הצלחת ואת הדגירה עבור 1 h עם טלטול קבוע ב 800 rpm בטמפרטורת החדר.
8. קריאת הלוחית
   1. הסר את הנוגדן בחינם המגודרת (טבלה של חומרים) על ידי מצליף אותו בסל האשפה ולהקיש על צלחת על מגבת נייר.
   2. לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של פתרון כביסה.
   3. הוסף 150 μL של 1 x טריס מבוססי זהב לקרוא מאגר (טבלה של חומרים) עם החומרים המכילים triפרופיאמין כשותף מגיב עבור דור האור לצלחת. להימנע בועות אוויר על ידי שימוש הפוך טכניקות ליטוף.
   4. מניחים את הצלחת על פלטפורמת זיהוי אימונולוגיה (לוח חומרים) ולהתחיל את המדידה מיד. השתמש בהגדרות של 96-ובכן רכישת צלחת.
   5. ללכוד את האותות אלקטרוכימי על ידי מצלמת CCD מובנית במערכת זיהוי אלקטרוככימי (טבלת חומרים) ולהקליט את ספירות האות, אשר מתאים יחידות אור יחסית (rlu) והם יחסיים ישירות לעוצמת האור.
      הערה: על ידי גירוי אלקטרוכימי, התווית הרותניום המאוגדת לאלקטרודה הפחמן מקרינה אור מואר ב620 ננומטר. ניתוח נתונים באמצעות התוכנה המלווה במכשירים (טבלת חומרים).

תוצאות

עקרון מערכת ה-ECLIA מתואר באיור 1. עקומות סטנדרטיות לשתי משתני MeCP2 מוצגות באיור 2. הקוונפיקציה מדויקת היתה אפשרית מעל מגוון רחב של ריכוזים (1-1800 ng/mL). באיור 3, רמות MeCP2 של lysates נגזר ממוח העכבר ו-hdfs נותחו. MeCP2 ביטוי של lysates גרעינית המוח מ heterozygous, ומסוג wil...

Discussion

כדי למדוד MeCP2 אנדודוגני, רקומביננטי MeCP2 ו-תאת-MeCP2 רמות, הצלחת 96-באר ECLIA פותחה. זה הוכח כי אובדן של פונקציית חלבון MeCP2 מוביל לתסמונת RTT⁶, עבור איזה טיפול מוגבל כעת ניהול סימפטום ופיזיותרפיה. אחד שדרת טיפול מבטיח הוא טיפול החלפת חלבון כביכול, שם רמות MeCP2 יכול להיות טיטרציה עד הריכוז ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad Laboratories Inc.	500-0006	Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit	Meso Scale Diagnostics	R32AB-1	Antibody
Discovery workbench 4.0	Meso Scale Discovery		Software
DMEM (1X)	gibco by Life Technologies	41966-029	Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Sample preperation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant	Meso Scale Diagnostics	R92TG	MeCP2 ECLIA protocol
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)	GFL	3014	MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)	Sigma-Aldrich	M2670	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)	Abnova Corporation	H00004204-P01	Cell treatment
Microseal B seal	Bio-Rad Laboratories Inc.	MSB1001	for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin	Sigma-Aldrich	M6818-100UL; RRID:AB_262075	Antibody, Coating solution
MSD Blocker A	Meso Scale Diagnostics	R93BA-4	Blocker
MSD SECTOR Imager 2400	Meso Scale Diagnostics	I30AA-0	MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate	Meso Scale Diagnostics	L15XB-3/L11BX-3	MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin	gibco by Life Technologies	15140122	Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit	Eurogentec S.A.	custom-designed	Antibody
Potassium chloride (KCl)	Merck KGaA	1049361000	Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)	Sigma-Aldrich	SAB1404063; RRID:AB_10737296	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)	Sigma-Aldrich	WH0004204M1; RRID:AB_1842411	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)	Sigma-Aldrich	M6818; RRID:AB_262075	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)	Sigma-Aldrich	M7443; RRID:AB_477235	Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)	Cell Signaling Technology	3456S; RRID:AB_2143849	Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Sigma-Aldrich	8340	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Eurogentec S.A.	custom	Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Merck	07-013	Antibody
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014	Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)	Meso Scale Diagnostics	W0015528S	Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein	in-house production		Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X)	gibco by Life Technologies	25200-056	Cell treatment
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Washing solution