Um ensaio baseado em eletroquimiluminescência para variantes de proteína MeCP2

Resumo

O imunoensaio eletroqueiluminescence (ECLIA) é uma nova abordagem para detecção quantitativa de variantes de proteína MeCP2 endógenas e exógenamente aplicadas, que produz medições altamente quantitativas, precisas e reprodutíveis com baixo erro intra e interensaio sobre uma ampla gama de trabalho. Aqui, o protocolo para o MeCP2-ECLIA em um formato de 96 poços é descrito.

Resumo

O ECLIA é um método versátil que é capaz de quantificar quantidades de proteínas endógenas e recombinantes em um formato de 96 poços. Para demonstrar a eficiência do ECLIA, este ensaio foi utilizado para analisar os níveis intrínsecos de MeCP2 no tecido cerebral do camundongo e a captação de TAT-MeCP2 em fibroblastos dérmicos humanos. O MeCP2-ECLIA produz medidas altamente precisas e reprodutíveis com baixo erro intra e interensaio. Em resumo, desenvolvemos um método quantitativo para a avaliação de variantes proteicas MeCP2 que podem ser utilizadas em telas de alto throughput.

Introdução

O imunoensaio eletroqueiluminescência (ECLIA) baseia-se em um processo que utiliza rótulos projetados para emitir luminescência quando estimulados eletroquimicamente. É uma técnica amplamente aplicável para a detecção quantitativa de analitos biológicos na indústria básica e na pesquisa acadêmica, na indústria alimentícia, bem como nos diagnósticos clínicos¹. Comumente, uma placa descartável de 96 poços com eletrodos de tinta de carbono é usada. Estes eletrodos agem como um portador de fase sólida para o imunoensaio. Um anticorpo secundário é conjugado a um rótulo eletroquímico e quando a eletricidade é aplicada ao sistema, a emissão de luz da etiqueta química é acionada. Um dispositivo de carga de ruído ultra-baixo (CCD) registra a intensidade da luz que é diretamente proporcional ao antígeno ligado ao anticorpo de captura, resultando na quantificação do analito alvo da amostra². Em comparação com o ensaio imunosorbent ligado à enzima (ELISA), o ECLIA é considerado vantajoso, pois oferece maior sensibilidade e reprodutibilidade, bem como melhor automação e consistência³.

Aqui analisamos os níveis de proteína de ligação metil-CpG 2 (MeCP2) em amostras de origem humana e murina, bem como diferentes variantes da proteína recombinante usando o recém-desenvolvido sistema ECLIA. MECP2 é uma proteína de ligação de ácido nucleico ligada a X conhecida por interagir com seqüências de DNA metilados. Esta proteína foi implicada na regulação da expressão genética^4,5. Mutações de perda de função no gene que codifica essa proteína são os principais culpados pela síndrome de Rett (TRT), uma grave desordem neurodesenvolvimentista⁶. Outro distúrbio relacionado ao MECP2, a síndrome da duplicação do MECP2, também leva a sintomas neurológicos que podem se sobrepor aos da TRT⁷. Notavelmente, as fêmeas são mais afetadas pela TT, enquanto os machos são mais acometidos pela síndrome de duplicação MECP2 ^6,7.

Esses transtornos estão associados a níveis insuficientes ou excessivos de MeCP2, respectivamente, no sistema nervoso central (SNC). Assim, as opções de tratamento para tRT que envolvem o aumento dos níveis de MeCP2 no CNS precisariam evitar os efeitos prejudiciais associados ao excesso de MECP2⁷. Devido a esse fato, uma quantificação altamente sensível e precisa dos níveis de proteína MeCP2, conforme fornecido pelo sistema ECLIA, é crucial para o avanço da TRT, bem como a pesquisa da síndrome da duplicação mecp2. As medidas precisas dos níveis endógenos e exógenos de MeCP2 de linhas de células humanas e amostras de tecido de camundongos, bem como uma proteína recombinante composta pelo isoform ebeuco B humano MeCP2 (também conhecido como isoform e1), e um domínio mínimo de transdução n-terminal HIV-TAT (TAT-MeCP2) que tem o potencial de atravessar a^barreirahemato-cérebro-8^,9 são apresentadas neste trabalho.

Protocolo

A aprovação para aquisição de biópsias de pele para fins de pesquisa foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa Humana do Hospital Infantil de Westmead, Austrália. O consentimento para experimentos em animais foi obtido do Ministério da Ciência, Pesquisa e Economia da Áustria, realizado de acordo com as normas locais de bem-estar animal (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

NOTA: O princípio do sistema ECLIA é retratado na Figura 1.

1. Seleção de anticorpos

1. Avalie a relação sinal-ruído para uma gama de vários anticorpos MeCP2 e identifique a melhor resistência ao sinal e a maior especificidade dentro da combinação de um anticorpo MeCP2 monoclonal do mouse primário (clone Mec-168) e anticorpo de detecção de coelclonal MeCP2 (feito sob medida). Para o anticorpo secundário, use um anticorpo específico do sistema(Table of Materials),que também foi verificado experimentalmente.
   NOTA: A Tabela 1 fornece uma visão geral de todos os anticorpos verificados durante o desenvolvimento do MeCP2-ECLIA e suas faixas de diluição testadas.

Função	Nome	Clone	Diluição
Primária	Mouse, anti-MeCP2	MEC-168	1:500-1:10.000
Primária	Mouse, anti-MeCP2	4B6	1:250-1:4.000
Primária	Mouse, anti-MeCP2	Homens-8	1:500-1:4.000
Primária	Mouse, anti-MeCP2	1B11	1:500-1:4.000
Primária	Coelho, anti-MeCP2	D4F3	1:500-1:4.000
Secundário	Coelho, anti-MeCP2	Polyclonal	1:2.000-1:20.000
Secundário	Coelho, anti-MeCP2	Polyclonal	1:2.000-1:20.000
Detecção	SULFO-TAG rotulado anti-coelho	Polyclonal	1:500-1:1.000

Tabela 1: Lista de anticorpos e diluições de trabalho utilizadas.

2. Alternativamente, use cada par de anticorpos MeCP2 que funcionem bem com o ELISA convencional.

2. Tratamento de HDFs com proteína de fusão TAT-MeCP2

NOTA: TAT-MeCP2 foi recombinantemente expresso em Escherichia coli e purificado usando técnicas cromatográficas padrão como descrito anteriormente⁸ e armazenado a -80 °C.

1. Placa 1 x 10⁶ células humanas de fibroblasto dérmico (HDF) em pratos de 100 mm e crescer as células durante a noite a 37 °C com 5% de CO₂ até atingirem cerca de 90% de confluência.
2. Tire um frasco de proteína de fusão TAT-MeCP2. Descongele no gelo e misture delicadamente.
3. Diluir TAT-MeCP2 para uma concentração final de 500 nM em 50 mL de mídia de cultura HDF.
4. Retire a mídia de pratos de 100 mm e incuba as células com 500 nM TAT-MeCP2 a 37 °C para vários períodos de incubação até 24 h.
5. Remova a solução TAT-MeCP2 das células. Lave as células 2x com o salino pré-aquecido de Dulbecco com fosfato tampão (DPBS).
6. Tratar as células com 2 mL de 0,05% de solução trypsin-EDTA por 5 min a 37 °C¹⁰.
7. Adicione 6 mL de mídia de cultura HDF para inativar a tripsina e coletar as células em tubos de 15 mL.
8. Pelota as células por centrifugação a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente.
9. Remova o sobrenadante e lave as células 2x com DPBS frio. Armazene a pelota no gelo e prossiga com a preparação da amostra.

3. Preparação da amostra

1. Lysates HDF
   1. Determinar os mais altos níveis de proteína de MeCP2 utilizando o método REAP para fracionamento subcelular nos compartimentos subcelulares citoplasmáticos e nucleares de acordo com Suzuki et al.¹¹. Limitar o fracionamento a não mais de seis amostras por experimento.
2. Lysates cerebrais de camundongos
   1. Prepare 100 mL de cada reagente de lyse hipotônica e tampão de extração.
      1. Para o reagente de lise hipotônica, misture bem 10 mM HEPES, 1,5 mM cloreto de magnésio e cloreto de potássio de 10 mM.
      2. Para o tampão de extração, misture bem 20 mM HEPES, 1,5 mM cloreto de magnésio, 0,42 M cloreto de sódio, 0,2 mM EDTA e 25% (v/v) glicerol.
      3. Ajuste o pH de ambos os buffers para 7,9.
      4. Adicione 1 mM dithiothreitol (DTT) e 1x coquetel inibidor de protease a ambos os buffers recentemente. Esfrie no gelo antes de usar.
   2. Suspender 100 mg de cérebro total do rato (cepa: C57BL/6J, macho e fêmea selvagem e B6.129P2(C)-Mecp2^tm1.1Bird/J, hemizygous masculino e heterozigoso feminino; idade: 4-8 semanas de idade) em 1 mL de reagente de llysis hipotônica gelada.
   3. Homogeneize o cérebro com um homogeneizador de tecido dounce pré-refrigerado por 15 golpes de homogeneizador A (solto, para grande folga) e B (apertado, para pequena folga), respectivamente.
   4. Transfira as células homogeneizadas para um tubo limpo e centrífuga a 10.000 x g por 20 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante (ou mantenha-o como fração citoplasmática para uso posterior).
   5. Ressuspensão da pelota em 140 μL de tampão de extração por 100 mg de material inicial. Coloque o tubo em um termobloco pré-resfriado e misture suavemente por 30 min a 4 °C.
   6. Centrifugar o tubo a 16.000 g por 10 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante (ou seja, a fração nuclear) para um novo tubo pré-refrigerado e armazene a -80 °C até o uso.
      NOTA: A concentração proteica de lysates derivados do cérebro do camundongo e hdfs pode ser avaliada pelo ensaio de proteína BCA.

4. Protocolo MeCP2-ECLIA

1. Preparação da solução de lavagem, bloqueio do tampão e solução diluente de ensaio (dia 1)
   1. Adicione 500 μL de Tween 20 a 1 L de PBS para preparar uma solução De 0,05% Tween 20 na solução PBS, misture vigorosamente e rotule como "solução de lavagem".
      NOTA: Certifique-se de que apenas o tampão de lavagem recém-preparado é usado.
   2. Prepare uma solução de bloqueio de 3% do bloqueador A (Tabela de Materiais)em solução salina tampoprotetora da fosfato (PBS). Misture com agitação suave, filtre esterilize e mantenha-os na geladeira até usar por no máximo duas semanas.
   3. Adicionar 5 mL de solução de bloqueio a 10 mL de PBS para preparar a solução diluente de ensaio (1% de bloqueador A na PBS).
2. Revestimento de placas de alta ligação
   1. Pegue uma placa de ligação de 96 polegadas de 96 polegadas.
      NOTA: As placas de ligação elevada têm maior capacidade de ligação e, portanto, um alcance dinâmico maior do que as placas padrão com superfícies hidrofóbicas.
   2. Descongele o anticorpo anti-MeCP2 do rato monoclonal no gelo e misture 0,67 μL do anticorpo com 4 mL de PBS (diluição de anticorpos 1:6.000 no PBS). Vórtice a solução de anticorpos para misturar bem e rotular o tubo como "solução de revestimento".
   3. Dispense cuidadosamente 25 μL de solução de revestimento no canto inferior de cada poço usando um pipettor multicanal; isso é chamado de método de revestimento de solução. Toque suavemente na placa de 96 poços de cada lado para garantir que a solução de revestimento cubra a parte inferior de cada poço.
   4. Sele a placa com uma folha de adesivo e incubar a placa na geladeira a 4 °C durante a noite (12-16 h).
3. Bloqueio (dia 2)
   1. Retire o prato da geladeira e retire a folha.
   2. Remova a solução de revestimento de anticorpos, apertando-a no cesto de resíduos e bata a placa em uma toalha de papel para remover toda a solução de revestimento dos poços.
   3. Adicione 125 μL de solução de bloqueio por poço. Sele a placa novamente e coloque-a em um agitador de microplacas orbitais.
   4. Incubar a placa por 90 min em temperatura ambiente com agitação constante a 800 rpm.
4. Preparações de normas e amostras
   1. Durante o tempo de incubação, prepare os padrões de proteína MeCP2 e/ou TAT-MeCP2 e várias amostras.
      NOTA: O tampão de lyse utilizado para diluição padrão deve ser o mesmo utilizado nas amostras analisadas.
   2. Retire um frasco de solução de estoque de proteína MePC2 e/ou TAT-MeCP2 (250 μg/mL), lysates cerebrais de camundongos e lysates HDF de -80 °C. Descongelá-los no gelo.
   3. Diluir a solução padrão de estoque (MeCP2 e/ou TAT-MeCP2) em tubos limpos de acordo com a Tabela 2.
   4. Diluir as amostras no tampão de lysis da seguinte forma: 1−20 μg de lysate cerebral de camundongos por 25 μL de tampão de lysis, e 0,25-1 μg de hdf lysate por 25 μL de tampão de lysis. Prepare volume suficiente de cada amostra para realizar a análise em triplicado.

Padrão	Concentração	Diluição
Padrão 1	1.800 ng/mL	1,08 μL Solução de estoque padrão + tampão de lysis de 148,92 μL
Padrão 2	600 ng/mL	Tampão de lysis padrão de 50 μL + 100 μL
Padrão 3	200 ng/mL	Tampão de lysis padrão de 50 μL + 100 μL
Padrão 4	66,67 ng/mL	Tampão de lysis padrão de 50 μL 3 + 100 μL
Padrão 5	22.22 ng/mL	Tampão de lysis padrão de 50 μL 4 + 100 μL
Padrão 6	7.41 ng/mL	Tampão de lysis padrão de 50 μL 5 + 100 μL
Padrão 7	2,47 ng/mL	Tampão de lysis padrão de 50 μL 6 + 100 μL
Padrão 8	0,82 ng/mL	Tampão de lysis padrão de 50 μL 7 + 100 μL
Padrão 9	0,27 ng/mL	Tampão de lysis padrão de 50 μL 8 + 100 μL
Padrão 10	0 ng/mL	Tampão de lysis de 150 μL

Tabela 2: Série padrão de 0 a 1.800 ng/mL.

5. Adicionando as amostras e soluções padrão
   1. Remova a solução de bloqueio, apertando-a no cesto de resíduos e bata na placa em uma toalha de papel para remover toda a solução de bloqueio dos poços.
   2. Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.
   3. Adicione 25 ul de padrões e amostras ao canto inferior do poço usando uma pipeta de canal único.
   4. Sele a placa e incuba a placa por 4 h em temperatura ambiente com agitação constante a 800 rpm.
6. Anticorpo de detecção não rotulado
   1. Descongele o anticorpo policlonal anti-MeCP2 no gelo. Diluir o anticorpo 1:6.000 em solução diluída de ensaio.
   2. Remova as normas e amostras, apertando-as no cesto de resíduos e bata a placa em uma toalha de papel.
   3. Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.
   4. Adicione 25 μL de anticorpo de detecção não rotulado a cada poço com o pipettor multicanal. Sele a placa e incuba-a por 1h com agitação constante a 800 rpm à temperatura ambiente.
7. Anticorpo conjugado específico
   1. Retire o anticorpo secundário específico(Tabela de Materiais)da geladeira e coloque-o no gelo. Diluir o anticorpo 1:666.67 na solução diluída do ensaio e misturar suavemente.
   2. Remova o anticorpo secundário livre sem rótulo, apertando-o no cesto de lixo e bata o prato em uma toalha de papel.
   3. Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.
   4. Adicione 25 μL de anticorpos conjugados específicos(Tabela de Materiais)a cada poço com o pipettor multicanal. Sele a placa e incuba por 1 h com agitação constante a 800 rpm à temperatura ambiente.
8. Lendo a placa
   1. Remova o anticorpo conjugado livre(Table of Materials)apertando-o no cesto de resíduos e bata a placa em uma toalha de papel.
   2. Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem.
   3. Adicione 150 μL de 1x tampão de leitura de ouro baseado em Tris(Tabela de Materiais)com surfactante contendo tripropylamina como co-reandré para a geração de luz para a placa. Evite bolhas de ar utilizando técnicas de pipetting reversa.
   4. Coloque a placa na plataforma de detecçãode microplacas (Tabela de Materiais)e inicie a medição imediatamente. Use as configurações para aquisição de placas de 96 poços.
   5. Capture os sinais de eletroquímicailuminescência por uma câmera CCD embutida em um sistema de detecção de eletroquímicailuminescência (Tabela de Materiais) e registre as contagens de sinais, que correspondem a unidades de luz relativa (RLU) e são diretamente proporcionais à intensidade da luz.
      NOTA: Após a estimulação eletroquímica, o rótulo de rutênio ligado ao eletrodo de carbono emite luz de luminescência a 620 nm. Analisar dados com o software acompanhado por instrumentos (Tabela de Materiais).

Resultados

O princípio do sistema ECLIA é descrito na Figura 1. As curvas padrão para duas variantes MeCP2 são mostradas na Figura 2. A quantificação precisa foi possível em uma ampla gama de concentrações (1-1.800 ng/mL). Na Figura 3,foram analisados os níveis de Lnadameado derivados do cérebro do rato e dos HDFs. A expressão mecp2 em lisatos nucleares cerebrais de camundongos heterozigos, selvagens e camundongos nocauteados foi c...

Discussão

Para medir os níveis endógenos de MeCP2, MeCP2 recombinante e TAT-MeCP2, foi desenvolvida uma placa eclia de 96 poços. Foi demonstrado que a perda da função proteica MeCP2 leva à síndrome de TRT⁶, para a qual o tratamento está atualmente limitado ao gerenciamento de sintomas e fisioterapia. Um caminho promissor para o tratamento é a chamada terapia de reposição de proteínas, onde os níveis de MeCP2 podem ser titulados até a concentração necessária^12,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad Laboratories Inc.	500-0006	Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit	Meso Scale Diagnostics	R32AB-1	Antibody
Discovery workbench 4.0	Meso Scale Discovery		Software
DMEM (1X)	gibco by Life Technologies	41966-029	Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Sample preperation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant	Meso Scale Diagnostics	R92TG	MeCP2 ECLIA protocol
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)	GFL	3014	MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)	Sigma-Aldrich	M2670	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)	Abnova Corporation	H00004204-P01	Cell treatment
Microseal B seal	Bio-Rad Laboratories Inc.	MSB1001	for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin	Sigma-Aldrich	M6818-100UL; RRID:AB_262075	Antibody, Coating solution
MSD Blocker A	Meso Scale Diagnostics	R93BA-4	Blocker
MSD SECTOR Imager 2400	Meso Scale Diagnostics	I30AA-0	MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate	Meso Scale Diagnostics	L15XB-3/L11BX-3	MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin	gibco by Life Technologies	15140122	Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit	Eurogentec S.A.	custom-designed	Antibody
Potassium chloride (KCl)	Merck KGaA	1049361000	Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)	Sigma-Aldrich	SAB1404063; RRID:AB_10737296	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)	Sigma-Aldrich	WH0004204M1; RRID:AB_1842411	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)	Sigma-Aldrich	M6818; RRID:AB_262075	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)	Sigma-Aldrich	M7443; RRID:AB_477235	Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)	Cell Signaling Technology	3456S; RRID:AB_2143849	Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Sigma-Aldrich	8340	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Eurogentec S.A.	custom	Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Merck	07-013	Antibody
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014	Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)	Meso Scale Diagnostics	W0015528S	Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein	in-house production		Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X)	gibco by Life Technologies	25200-056	Cell treatment
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Washing solution