Ein Electrochemilumineszenz-basierter Assay für MeCP2-Proteinvarianten

Zusammenfassung

Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) ist ein neuartiger Ansatz für den quantitativen Nachweis endogener und exogen angewendeter MeCP2-Proteinvarianten, der hochquantitative, genaue und reproduzierbare Messungen mit geringem Intra- und Inter-Assay-Fehler über einen weiten Arbeitsbereich erzeugt. Hier wird das Protokoll für die MeCP2-ECLIA im 96-Well-Format beschrieben.

Zusammenfassung

Die ECLIA ist eine vielseitige Methode, die in der Lage ist, endogene und rekombinante Proteinmengen in einem 96-Well-Format zu quantifizieren. Um die ECLIA-Effizienz zu demonstrieren, wurde dieser Test verwendet, um intrinsische Konzentrationen von MeCP2 im Gehirngewebe der Maus und die Aufnahme von TAT-MeCP2 in humanen dermalen Fibroblasten zu analysieren. Der MeCP2-ECLIA erzeugt hochpräzise und reproduzierbare Messungen mit geringem Intra- und Inter-Assay-Fehler. Zusammenfassend haben wir eine quantitative Methode zur Bewertung von MeCP2-Proteinvarianten entwickelt, die in Hochdurchsatz-Bildschirmen eingesetzt werden können.

Einleitung

Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) basiert auf einem Verfahren, bei dem Etiketten verwendet werden, die bei elektrochemisch stimulierter Lumineszenz emittiert werden. Es ist eine allgemein anwendbare Technik für den quantitativen Nachweis biologischer Analyten in der Grundlagenindustrie und der akademischen Forschung, der Lebensmittelindustrie sowie in der klinischen Diagnostik¹. Üblicherweise wird eine Einwegplatte mit Carbon-Tintenelektroden verwendet. Diese Elektroden fungieren als Festphasenträger für den Immunoassay. Ein sekundärer Antikörper wird mit einem elektrochemilumineszierenden Etikett konjugiert und wenn Strom auf das System aufgebracht wird, wird die Lichtemission des chemischen Etiketts ausgelöst. Ein ultra-low noise charge coupled device (CCD) zeichnet die Lichtintensität auf, die direkt proportional zum Antigen ist, das an den Aufnahmeantikörper gebunden ist, was zur Quantifizierung des Zielanalyten der Probe²führt. Im Vergleich zum enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA) gilt ECLIA als vorteilhaft, da es eine höhere Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit sowie eine bessere Automatisierung und Konsistenz^{bietet 3}.

Hier analysierten wir die Methyl-CpG-Bindungsprotein-2 (MeCP2)-Spiegel in Proben menschlichen und murinen Ursprungs sowie verschiedene Varianten des rekombinanten Proteins mit dem neu entwickelten ECLIA-System. MecP2 ist ein X-verknüpftes Nukleinsäure-bindendes Protein, das bekanntermaßen mit methylierten DNA-Sequenzen interagiert. Dieses Protein ist in die Regulation der Genexpression^4,5verwickelt. Funktionsverlustmutationen im Gen, die dieses Protein kodiert, sind die Hauptschuldigen, die das Rett-Syndrom (RTT), eine schwere neuroentwicklungsbedingten Störung^{verursachen 6}. Eine weitere MeCP2-bedingte Erkrankung, das MECP2-Duplikationssyndrom, führt auch zu neurologischen Symptomen, die sich mit denen von RTT⁷überschneiden können. MECP2 Insbesondere sind Frauen meist von RTT betroffen, während Männer meist vom MECP2-Duplikationssyndrom ^6,7betroffen sind.

Diese Störungen sind mit unzureichenden oder überschüssigen MeCP2-Spiegeln bzw. im Zentralnervensystem (ZNS) verbunden. Daher müssten Behandlungsoptionen für RTT, die eine Erhöhung des MeCP2-Spiegels im CNS beinhalten, die nachteiligen Auswirkungen im Zusammenhang mit einem Überschuss an MeCP2⁷vermieden werden. Aufgrund dieser Tatsache ist eine hochsensible und genaue Quantifizierung des MeCP2-Proteinspiegels, wie sie vom ECLIA-System bereitgestellt wird, entscheidend für die Weiterentwicklung der RTT sowie der Forschung zum MECP2-Duplizierungssyndrom. MECP2 Die präzisen Messungen von endogenen und exogenen MeCP2-Spiegeln aus menschlichen Zelllinien und Mausgewebeproben sowie eines rekombinanten Proteins bestehend aus humanem MeCP2-Isoform B (auch bekannt als Isoform e1) und einer minimalen N-terminalen HIV-TAT-Transduktionsdomäne (TAT-MeCP2), die das Potenzial hat, die Blut-Hirn-Schranke^8,,⁹ zu überqueren, werden in dieser Arbeit vorgestellt.

Protokoll

Die Zulassung für die Beschaffung von Hautbiopsien zu Forschungszwecken wurde von der Human Research Ethics Committee of the Children es Hospital in Westmead, Australien, eingeholt. Die Zustimmung zu Tierversuchen erhielt das Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft, die nach den örtlichen Tierschutzbestimmungen durchgeführt wurden (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

ANMERKUNG: Das Prinzip des ECLIA-Systems ist in Abbildung 1dargestellt.

1. Antikörperauswahl

1. Bewerten Sie das Signal-Rausch-Verhältnis für eine Reihe von verschiedenen MeCP2-Antikörpern und identifizieren Sie die beste Signalstärke und höchste Spezifität in der Kombination eines primären monoklonalen MeCP2-Antikörpers (Klon Mec-168) und eines polyklonalen MeCP2-Detektionsantikörpers (kundenspezifisch). Verwenden Sie für den sekundären Antikörper einen systemspezifischen Antikörper (Materialtabelle), der ebenfalls experimentell verifiziert wurde.
   HINWEIS: Tabelle 1 gibt einen Überblick über alle nachgewiesenen Antikörper während der MeCP2-ECLIA-Entwicklung und deren getestete Verdünnungsbereiche.

Funktion	Namen	Klon	Verdünnung
Primäre	Maus, anti-MeCP2	Mec-168	1:500 bis 1:10.000
Primäre	Maus, anti-MeCP2	4B6	1:250 bis 1:4.000
Primäre	Maus, anti-MeCP2	Herren-8	1:500 bis 1:4.000
Primäre	Maus, anti-MeCP2	1B11	1:500 bis 1:4.000
Primäre	Kaninchen, anti-MeCP2	D4F3	1:500 bis 1:4.000
Sekundären	Kaninchen, anti-MeCP2	Polyclonal	1:2,000 bis 1:20,000
Sekundären	Kaninchen, anti-MeCP2	Polyclonal	1:2,000 bis 1:20,000
Erkennung	SULFO-TAG gekennzeichnet Anti-Kaninchen	Polyclonal	1:500 bis 1:1.000

Tabelle 1: Liste der Antikörper und der verwendeten Arbeitsverdünnungen.

2. Alternativ können Sie jedes Paar MeCP2-Antikörper verwenden, das gut mit herkömmlichem ELISA funktioniert.

2. Behandlung von HDFs mit TAT-MeCP2-Fusionsprotein

ANMERKUNG: TAT-MeCP2 wurde rekombinant in Escherichia coli exprimiert und mit Standardchromatographietechniken wie zuvor^{beschrieben 8} gereinigt und bei -80 °C gelagert.

1. Platte 1 x 10⁶ menschliche dermale Fibroblasten (HDF) Zellen in 100 mm Schalen und wachsen die Zellen über Nacht bei 37 °C mit 5%_CO2, bis sie etwa 90% Konfluenz erreichen.
2. Nehmen Sie eine Durchstechflasche mit TAT-MeCP2-Fusionsprotein heraus. Auf Eis auftauen und sanft mischen.
3. TAT-MeCP2 auf eine Endkonzentration von 500 nM in 50 ml HDF-Kulturmedien verdünnen.
4. Entfernen Sie die Medien von 100 mm Geschirr und inkubieren Sie die Zellen mit 500 nM TAT-MeCP2 bei 37 °C für verschiedene Inkubationsperioden bis zu 24 h.
5. Entfernen Sie die TAT-MeCP2-Lösung aus den Zellen. Waschen Sie die Zellen 2x mit vorgewärmter Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS).
6. Behandeln Sie die Zellen mit 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung für 5 min bei 37 °C¹⁰.
7. Fügen Sie 6 ml HDF-Kulturmedien hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren und die Zellen in 15 ml-Röhren zu sammeln.
8. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
9. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen 2x mit eiskaltem DPBS. Das Pellet auf Eis aufbewahren und mit der Probenvorbereitung fortfahren.

3. Probenvorbereitung

1. HDF-Lysate
   1. Bestimmen Sie die höchsten Proteingehalte von MeCP2 mit der REAP-Methode zur subzellulären Fraktionierung in die zytoplasmatischen und nuklearen subzellulären Kompartimente nach Suzuki et al.¹¹. Beschränken Sie die Fraktionierung auf nicht mehr als sechs Proben pro Experiment.
2. Mausgehirn lysiert
   1. Bereiten Sie 100 ml jedes hypotonischen Lysereagenz und Extraktionspuffer s.
      1. Für das hypotonische Lysereagenz 10 mM HEPES, 1,5 mM Magnesiumchlorid und 10 mM Kaliumchlorid gut mischen.
      2. Für den Extraktionspuffer gut 20 mM HEPES, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,42 M Natriumchlorid, 0,2 mM EDTA und 25% (v/v) Glycerin mischen.
      3. Stellen Sie den pH-Wert beider Puffer auf 7,9 ein.
      4. 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 1x Protease-Hemmer-Cocktail zu beiden Puffern frisch hinzufügen. Vor Gebrauch auf Eis abkühlen lassen.
   2. Suspend 100 mg des gesamten Maushirns (Stamm: C57BL/6J, Wildtyp männlich und weiblich und B6.129P2(C)-Mecp2^tm1.1Bird/J, hemizygotes männchen und heterozygotes Weibchen; Alter: 4 bis 8 Wochen alt) in 1 ml eiskaltem hypotonischem Lysereage.
   3. Homogenisieren Sie das Gehirn mit einem vorgekühlten Dounce Ganzglas-Gewebehomogenisator durch 15 Striche Homogenisator A (locker, für große Freiraum) bzw. B (eng, für kleine Freiräume).
   4. Die homogenisierten Zellen bei 10.000 x g bei 10.000 x g bei 20 min bei 4 °C in ein sauberes Rohr und eine Zentrifuge übertragen. Entsorgen Sie den Überstand (oder halten Sie ihn als zytoplasmatische Fraktion für die weitere Verwendung).
   5. Setzen Sie das Pellet in 140 l Extraktionspuffer pro 100 mg Ausgangsmaterial wieder auf. Das Rohr in einen vorgekühlten Thermoblock geben und bei 4 °C 30 min sanft mischen.
   6. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 16.000 g für 10 min bei 4 °C. Den Überstand (d.h. die Kernfraktion) in ein neues vorgekühltes Rohr geben und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Die Proteinkonzentration von Lysaten aus Maushirn und HDFs kann durch den BCA-Proteintest beurteilt werden.

4. MeCP2-ECLIA-Protokoll

1. Vorbereitung von Waschlösung, Sperrpuffer und Assay-Verdünnungslösung (Tag 1)
   1. Fügen Sie 500 l Tween 20 bis 1 L PBS hinzu, um eine 0,05% Tween 20 in PBS-Lösung vorzubereiten, kräftig mischen und als "Waschlösung" kennzeichnen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass nur frisch zubereiteter Waschpuffer verwendet wird.
   2. Bereiten Sie eine Blockierlösung von 3% Blocker A (Materialtabelle) in phosphatgepufferter Saline (PBS) vor. Durch sanftes Rühren mischen, sterilisieren und im Kühlschrank aufbewahren, bis sie maximal zwei Wochen lang verwendet werden.
   3. Fügen Sie 5 ml Blockierlösung zu 10 ml PBS hinzu, um eine Assay-Verdünnungslösung vorzubereiten (1% Blocker A in PBS).
2. Beschichtung von hochbindbaren Platten
   1. Nehmen Sie eine 96-Well Multi-Array-Single-Spot-High-Bind-Platte heraus.
      HINWEIS: Hohe Bindeplatten haben eine größere Bindungskapazität und damit einen größeren Dynamikbereich als Standardplatten mit hydrophoben Oberflächen.
   2. Den monoklonalen Maus-Anti-MeCP2-Antikörper auf Eis auftauen und 0,67 l des Antikörpers mit 4 ml PBS (1:6.000 Antikörperverdünnung in PBS) mischen. Wirbel die Antikörperlösung gut zu mischen und die Röhre als "Beschichtungslösung" zu kennzeichnen.
   3. Mit einem Mehrkanal-Pipettor dosieren Sie vorsichtig 25 L Beschichtungslösung in der unteren Ecke jedes Brunnens; dies wird als Lösungsbeschichtungsverfahren bezeichnet. Tippen Sie auf jeder Seite vorsichtig auf die 96-Well-Platte, um sicherzustellen, dass die Beschichtungslösung den Boden jedes Brunnens abdeckt.
   4. Versiegeln Sie die Platte mit einer Klebefolie und bebrüten Sie die Platte im Kühlschrank bei 4 °C über Nacht (12-16 h).
3. Blockierung (Tag 2)
   1. Nehmen Sie die Platte aus dem Kühlschrank und entfernen Sie die Folie.
   2. Entfernen Sie die Antikörper-Beschichtungslösung, indem Sie sie in den Abfallkorb werfen und tippen Sie auf die Platte auf ein Papiertuch, um die gesamte Beschichtungslösung aus den Brunnen zu entfernen.
   3. Fügen Sie 125 L Blockierlösung pro Bohrgut hinzu. Versiegeln Sie die Platte erneut und legen Sie sie auf einen Orbital-Mikroplatten-Shaker.
   4. Inkubieren Sie die Platte für 90 min bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln bei 800 Rpm.
4. Vorbereitung von Normen und Proben
   1. Bereiten Sie während der Inkubationszeit die MeCP2- und/oder TAT-MeCP2-Proteinstandards und verschiedene Proben vor.
      HINWEIS: Der Für die Standardverdünnung verwendete Lysispuffer muss mit dem in den analysierten Proben verwendeten identisch sein.
   2. Nehmen Sie eine Durchstechflasche mit MePC2- und/oder TAT-MeCP2-Protein-Stammlösung (250 g/ml), Maus-Gehirnlysate und HDF-Lysate aus -80 °C heraus. Tauen Sie sie auf Eis.
   3. Verdünnen Sie die Standard-Lagerlösung (MeCP2 und/oder TAT-MeCP2) in sauberen Rohren nach Tabelle 2.
   4. Verdünnen Sie die Proben im Lysepuffer wie folgt: 1,20 g Maushirnlysat pro 25 L Lysepuffer und 0,25 ,1 g HDF-Lysat pro 25 L Lysepuffer. Bereiten Sie genügend Volumen jeder Probe vor, um eine Analyse in dreifacher Ausfertigung durchzuführen.

Standard	Konzentration	Verdünnung
Standard 1	1.800 ng/mL	1,08 l Standard-Lagerlösung + 148,92 l Lysispuffer
Standard 2	600 ng/mL	50 l Standard 1 + 100 l Lysispuffer
Standard 3	200 ng/mL	50 l Standard 2 + 100 l Lysispuffer
Standard 4	66,67 ng/ml	50 l Standard 3 + 100 l Lysispuffer
Standard 5	22,22 ng/ml	50 l Standard 4 + 100 l Lysispuffer
Standard 6	7,41 ng/ml	50 l Standard 5 + 100 l Lysispuffer
Standard 7	2,47 ng/ml	50 l Standard 6 + 100 l Lysispuffer
Standard 8	0,82 ng/ml	50 l Standard 7 + 100 l Lysispuffer
Standard 9	0,27 ng/ml	50 l Standard 8 + 100 l Lysispuffer
Standard 10	0 ng/mL	150 L Lysis-Puffer

Tabelle 2: Standardserien von 0 bis 1.800 ng/ml.

5. Hinzufügen der Muster und Standardlösungen
   1. Entfernen Sie die Sperrlösung, indem Sie sie in den Abfallkorb werfen und tippen Sie auf die Platte auf ein Papiertuch, um die gesamte Blocklösung aus den Brunnen zu entfernen.
   2. Waschen Sie die Platte 3x mit 150 l Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.
   3. Fügen Sie 25 Ul von Standards und Proben in die untere Ecke des Brunnens mit einer einkanaligen Pipette.
   4. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie die Platte für 4 h bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen von 15.00 Uhr.
6. Unbeschrifteter Detektionsantikörper
   1. Den polyklonalen Kaninchen-Anti-MeCP2-Antikörper auf Eis auftauen. Verdünnen Sie den Antikörper 1:6.000 in Assay-Verdünnungslösung.
   2. Entfernen Sie die Standards und Proben, indem Sie sie in den Abfallkorb werfen und tippen Sie auf die Platte auf ein Papiertuch.
   3. Waschen Sie die Platte 3x mit 150 l Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.
   4. Fügen Sie mit dem Mehrkanal-Pipettor 25 L unbeschrifteten Detektionsantikörper zu jedem Brunnen hinzu. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie sie für 1 h mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen bei Raumtemperatur.
7. Spezifischer konjugierter Antikörper
   1. Nehmen Sie den spezifischen sekundären Antikörper (Tabelle der Materialien) aus dem Kühlschrank und legen Sie ihn auf Eis. Den Antikörper 1:666.67 in assay verdünnungsmitteler Lösung verdünnen und sanft mischen.
   2. Entfernen Sie den kostenlosen unbeschrifteten Sekundärantikörper, indem Sie ihn in den Abfallkorb werfen und auf ein Papiertuch tippen.
   3. Waschen Sie die Platte 3x mit 150 l Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.
   4. Fügen Sie mit dem Mehrkanalpipettor 25 L spezifischen konjugierten Antikörper (Materialtabelle) zu jedem Brunnen hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten für 1 h mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen bei Raumtemperatur.
8. Lesen der Platte
   1. Entfernen Sie den freien konjugierten Antikörper (Tabelle der Materialien), indem Sie ihn in den Abfallkorb werfen und tippen Sie auf die Platte auf ein Papiertuch.
   2. Waschen Sie die Platte 3x mit 150 l Waschlösung.
   3. Fügen Sie 150 L 1x Tris-basierten Gold-Lesepuffer (Tabelle der Materialien) mit Tensid enthaltenTripropylamin als Co-Reaktant für die Lichterzeugung auf die Platte. Vermeiden Sie Luftblasen, indem Sie Reverse Pipettiertechniken verwenden.
   4. Legen Sie die Platte auf die Mikroplatten-Erkennungsplattform (Materialtabelle) und starten Sie die Messung sofort. Verwenden Sie die Einstellungen für die 96-Well-Plattenerfassung.
   5. Erfassen Sie die Elektrochemilumineszenzsignale mit einer eingebauten CCD-Kamera in einem Elektrochemilumineszenz-Erkennungssystem (Materialtabelle) und erfassen Sie die Signalzahlen, die relativen Lichteinheiten (RLU) entsprechen und direkt proportional zur Lichtintensität sind.
      HINWEIS: Bei elektrochemischer Stimulation emittiert das an die Kohlenstoffelektrode gebundene Ruthenium-Etikett Leuchtlicht bei 620 nm. Analysieren Sie Daten mit der instrumentenbegleiteten Software (Tabelle der Materialien).

Ergebnisse

Das Prinzip des ECLIA-Systems ist in Abbildung 1beschrieben. Standardkurven für zwei MeCP2-Varianten sind in Abbildung 2dargestellt. Eine genaue Quantifizierung war über einen breiten Konzentrationsbereich (1.800 ng/ml) möglich. In Abbildung 3wurden MeCP2-Spiegel von Lysaten aus Dem mausgehirn und HDFs analysiert. Die MeCP2-Expression in Kernlysaten im Gehirn von heterozygoten, Wildtyp- und Knockout-Mäusen wurde in

Diskussion

Zur Messung der endogenen MeCP2-, rekombinanten MeCP2- und TAT-MeCP2-Spiegel wurde eine 96-Well-Platte ECLIA entwickelt. Es hat sich gezeigt, dass der Verlust der MeCP2-Proteinfunktion zum RTT-Syndrom⁶führt, für das die Behandlung derzeit auf Symptommanagement und Physiotherapie beschränkt ist. Eine vielversprechende Behandlungsmöglichkeit ist die sogenannte Proteinersatztherapie, bei der MeCP2-Spiegel bis zu ihrer benötigten Konzentration^12,,

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad Laboratories Inc.	500-0006	Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit	Meso Scale Diagnostics	R32AB-1	Antibody
Discovery workbench 4.0	Meso Scale Discovery		Software
DMEM (1X)	gibco by Life Technologies	41966-029	Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Sample preperation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant	Meso Scale Diagnostics	R92TG	MeCP2 ECLIA protocol
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)	GFL	3014	MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)	Sigma-Aldrich	M2670	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)	Abnova Corporation	H00004204-P01	Cell treatment
Microseal B seal	Bio-Rad Laboratories Inc.	MSB1001	for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin	Sigma-Aldrich	M6818-100UL; RRID:AB_262075	Antibody, Coating solution
MSD Blocker A	Meso Scale Diagnostics	R93BA-4	Blocker
MSD SECTOR Imager 2400	Meso Scale Diagnostics	I30AA-0	MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate	Meso Scale Diagnostics	L15XB-3/L11BX-3	MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin	gibco by Life Technologies	15140122	Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit	Eurogentec S.A.	custom-designed	Antibody
Potassium chloride (KCl)	Merck KGaA	1049361000	Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)	Sigma-Aldrich	SAB1404063; RRID:AB_10737296	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)	Sigma-Aldrich	WH0004204M1; RRID:AB_1842411	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)	Sigma-Aldrich	M6818; RRID:AB_262075	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)	Sigma-Aldrich	M7443; RRID:AB_477235	Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)	Cell Signaling Technology	3456S; RRID:AB_2143849	Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Sigma-Aldrich	8340	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Eurogentec S.A.	custom	Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Merck	07-013	Antibody
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014	Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)	Meso Scale Diagnostics	W0015528S	Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein	in-house production		Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X)	gibco by Life Technologies	25200-056	Cell treatment
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Washing solution