Электрохимилуминесценция на основе анализ для MeCP2 Белковые варианты

Резюме

Электрохимилюминесценционный иммуноанализ (ECLIA) является новым подходом к количественному выявлению эндогенных и экзогенно применяемых белков meCP2 вариантов, который производит высококоличественные, точные и воспроизводимые измерения с низкой внутри- и межанализу ошибки в широком рабочем диапазоне. Здесь описан протокол MeCP2-ECLIA в формате 96 скважин.

Аннотация

ECLIA является универсальным методом, который способен количественно эндогенных и рекомбинантных белков в формате 96-наилучшим образом. Чтобы продемонстрировать эффективность ECLIA, этот анализ был использован для анализа внутренних уровней MeCP2 в ткани мозга мыши и поглощения TAT-MeCP2 в человеческих кожных фибробластов. MeCP2-ECLIA производит высокоточные и воспроизводимые измерения с низкой погрешностью внутри- и межанализа. Таким образом, мы разработали количественный метод для оценки вариантов белка MeCP2, которые могут быть использованы в высокопроизводительных экранах.

Введение

Электрохимилюминесценция иммуноанализ (ECLIA) основана на процессе, который использует этикетки, предназначенные для испускания люминесценции, когда электрохимически стимулировали. Это широко применимый метод количественного обнаружения биологических аналитов в основных отраслях промышленности и научных исследованиях, пищевой промышленности, а также в клинической диагностике¹. Обычно используется одноразовая 96-колодная пластина с углеродными чернилами. Эти электроды выступают в качестве твердой фазы носителя для иммуноанализ. Вторичное антитело спрягается с электрохимилюминесцентной этикеткой, и при применении электричества к системе срабатывает световое излучение химической этикетки. Ультра-низкий шум заряда связаны устройства (CCD) записывает интенсивность света, который прямо пропорциональна антигена связаны с захватом антитела в результате количественной оценки целевого анализ образца². По сравнению с фермент-связанных иммуносорбент анализа (ELISA), ECLIA считается выгодным, поскольку он предлагает более высокую чувствительность и воспроизводимость, а также лучшую автоматизацию и консистенцию³.

Здесь мы проанализировали уровень связывающего белка метил-CpG 2 (MeCP2) в образцах происхождения человека и мурина, а также различные варианты рекомбинантного белка с использованием недавно разработанной системы ECLIA. MecP2 — это x-связанный нуклеиновой кислотно-связывающий белок, который, как известно, взаимодействует с метилированными последовательностями ДНК. Этот белок был вовлечен в регуляцию экспрессии генов^4,,5. Потеря функции мутаций в гене, который кодирует этот белок являются основными виновниками вызывая синдром Ретт (RTT), тяжелое расстройство нервной^{системы 6}. Другой MeCP2 связанных расстройство, синдром дублирования MECP2, также приводит к неврологическим симптомам, которые могут перекрываться с RTT⁷. Примечательно, что женщины в основном страдают от RTT в то время как мужчины в основном страдают от синдрома дублирования MECP2 ^6,7.

Эти расстройства связаны с недостаточным или избыточным уровнем MeCP2 соответственно в центральной нервной системе (ЦНС). Таким образом, варианты лечения RTT, которые включают повышение уровня MeCP2 в ЦНС необходимо, чтобы избежать пагубных последствий, связанных с превышением MeCP2⁷. В связи с этим, очень чувствительныи и точные количественной оценки уровня белка MeCP2, как это предусмотрено системой ECLIA, имеет решающее значение для развития RTT, а также MECP2 исследования синдрома дублирования. Точные измерения эндогенных и экзогенных уровней MeCP2 из клеточных линий человека и образцов тканей мыши, а также рекомбинантный белок, состоящий из изоформы человека MeCP2 (также известный как изоформный e1), и минимальный N-терминальный ВИЧ-TAT трансдукционный домен (TAT-MeCP2), который имеет потенциал, чтобы пересечь гематоген-барьер^{8,представлены} в этой работе.

протокол

Разрешение на закупку биопсии кожи в исследовательских целях было получено от Комитета по этике исследований человека Детской больницы в Вестмиде, Австралия. Согласие на эксперименты на животных было получено от Федерального министерства науки, исследований и экономики Австрии, которые были выполнены в соответствии с местными правилами защиты животных (ГЗ: 66.009/0218-II/3b/2015).

ПРИМЕЧАНИЕ: Принцип системы ECLIA изображен на рисунке 1.

1. Выбор антител

1. Оцените соотношение сигнала к шуму для ряда различных антител MeCP2 и определите наилучшую силу сигнала и самую высокую специфичность в сочетании первичного моноклонального антитела MeCP2 мыши (клон Mec-168) и антитела обнаружения обнаружения кролика Polyclonal MeCP2 (обычное). Для вторичного антитела, используйте системно-специфические антитела (Таблица материалов), который также был экспериментально проверен.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 1 дает обзор всех проверенных антител во время разработки MeCP2-ECLIA и их проверенных диапазонов разбавления.

Функции	Имя	Клон	Разбавления
Основной	Мышь, анти-MeCP2	Mec-168	1:500-1:10,000
Основной	Мышь, анти-MeCP2	4B6	1:250-1:4,000
Основной	Мышь, анти-MeCP2	Мужчины-8	1:500-1:4,000
Основной	Мышь, анти-MeCP2	1B11	1:500-1:4,000
Основной	Кролик, анти-MeCP2	D4F3	1:500-1:4,000
Вторичного	Кролик, анти-MeCP2	Поликлональных	1:2,000-1:20,000
Вторичного	Кролик, анти-MeCP2	Поликлональных	1:2,000-1:20,000
Обнаружения	SULFO-TAG помечены анти-кролик	Поликлональных	1:500-1:1,000

Таблица 1: Список антител и используемых рабочих разбавлений.

2. Кроме того, используйте каждую пару meCP2-антител, которые хорошо работают с обычными ELISA.

2. Лечение HdFs с белком синтеза TAT-MeCP2

ПРИМЕЧАНИЕ: TAT-MeCP2 был рекомбинантно выражен в escherichia coli и очищен с помощью стандартных хроматографических методов, как ранее описано⁸ и хранится при -80 градусов по Цельсию.

1. Плита 1 х 10⁶ человека дермальной фибробласт (HDF) клетки в 100 мм блюд и расти клетки на ночь при 37 градусов по Цельсию с 5% CO_2, пока они не достигнут около 90% confluency.
2. Вынвейте один флакон белка синтеза TAT-MeCP2. Оттепель на льду и аккуратно перемешать.
3. Разбавить TAT-MeCP2 до конечной концентрации 500 нм в 50 мл носителей культуры HDF.
4. Удалите средства массовой информации из 100 мм посуды и инкубировать клетки с 500 нм TAT-MeCP2 при 37 градусах Цельсия для различных инкубационных периодов до 24 ч.
5. Удалите раствор TAT-MeCP2 из ячеек. Вымойте клетки 2x с предварительно подогретых Dulbecco в фосфат-буферный солен (DPBS).
6. Лечить клетки с 2 мл 0,05% трипсин-EDTA раствор в течение 5 мин при 37 КС¹⁰.
7. Добавьте 6 мл средств массовой информации культуры HDF, чтобы инактивировать трипсин и собрать клетки в трубках 15 мл.
8. Пелле клетки центрифугации при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
9. Удалить супернатант и мыть клетки 2x с ледяной DPBS. Храните гранулы на льду и приступайте к подготовке образца.

3. Подготовка образцов

1. Лисаты HDF
   1. Определите самые высокие уровни белка MeCP2 с помощью метода REAP для субклеточной фракционирования в цитоплазмамические и ядерные субклеточные отсеки в соответствии с Suzuki et al.¹¹. Ограничьте фракционирование не более чем шестью образцами за эксперимент.
2. Мышиные мозговые лисаты
   1. Приготовьте 100 мл каждого гипотонного лисисового реагента и буфера извлечения.
      1. Для гипотонического лисис-реагента хорошо перемешайте 10 мМ HEPES, 1,5 мм хлорида магния и 10 мм хлористого калия.
      2. Для буфера извлечения хорошо смешайте 20 мМ HEPES, 1,5 мм хлорида магния, 0,42 М хлористого натрия, 0,2 мм ЭДТА и 25% (v/v) глицерола.
      3. Отрегулируйте рН обоих буферов до 7,9.
      4. Добавьте 1 мМ дитиотрейтол (DTT) и 1x коктейль-ингибитор протеазы в оба буфера свежего. Охладите на льду перед использованием.
   2. Приостановить 100 мг общего мозга мыши (напряжение: C57BL/6J, дикий тип мужчины и женщины и B6.129P2 (C)-Mecp2^tm1.1Bird/J, hemizygous мужского и гетерозиготного женского пола; возраст: 4'8 недель) в 1 мл ледяного гипототониса реагент.
   3. Гомогенизировать мозг с предварительно охлажденной Dounce все стекла ткани гомогенизатор 15 ударов гомогенизатора А (свободный, для большого клиренса) и B (жесткий, для небольшого зазора), соответственно.
   4. Перенесите гомогенизированные клетки в чистую трубку и центрифугу при 10 000 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта (или держите его в качестве цитоплазматической фракции для дальнейшего использования).
   5. Приостановите гранулы в 140 л из буфера экстракции на 100 мг исходного материала. Поместите трубку в предварительно охлажденный термоблок и аккуратно перемешайте в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.
   6. Центрифуга трубки при 16000 г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант (т.е. ядерную фракцию) в новую предварительно охлажденный трубку и храните при -80 градусов до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка лизатов, полученных из мозга мыши и HDFs может быть оценена по анализу белка BCA.

4. Протокол MeCP2-ECLIA

1. Приготовление стирального раствора, блокирование буфера и асси разбавите (день 1)
   1. Добавьте 500 л Tween от 20 до 1 л PBS, чтобы подготовить 0,05% Tween 20 в растворе PBS, энергично перемешайте и наметите как «стиральное решение».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что используется только свежеприготовленный буфер для стирки.
   2. Подготовьте блокирующее решение 3% блокатора A(Таблица материалов)в фосфатно-буферизированном сольнике (PBS). Смешайте нежным помешивая, фильтр стерилизовать и держать их в холодильнике до использования в течение максимум двух недель.
   3. Добавьте 5 мл блокирующего раствора в 10 мл PBS для подготовки разбавителя (1% блокатор а в PBS).
2. Покрытие высокосвязных пластин
   1. Выньте 96-хорошо многослойной одной пластины высокой связывания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высокосвязные пластины имеют большую связывающую способность и, следовательно, больший динамический диапазон, чем стандартные пластины с гидрофобными поверхностями.
   2. Оттепели моноклональные мыши анти-MeCP2 антитела на льду и смешать 0,67 л антитела с 4 мл PBS (1:6,000 разбавления антител в PBS). Vortex антитела решение хорошо перемешать и этикетки трубки как "покрытие решение".
   3. Тщательно распределите 25 зл покрытия раствора в нижнем углу каждой скважины с помощью многоканального пипетатора; это называется методом покрытия раствора. Нажмите 96-ну хорошо пластины осторожно с каждой стороны, чтобы убедиться, что покрытие решение охватывает дно каждого колодца.
   4. Запечатать тарелку клейкой фольгой и инкубировать тарелку в холодильнике при цене 4 градусов по Цельсию на ночь (12–16 ч).
3. Блокировка (день 2)
   1. Вынуть тарелку из холодильника и удалить фольгу.
   2. Удалите раствор покрытия антител, щелкнув его в корзину для мусора и нажмите на тарелку на бумажном полотенце, чтобы удалить все покрытие раствор из колодцев.
   3. Добавьте 125 л блокирующего раствора на скважину. Запечатайте пластину снова и поместите ее на орбитальный микроплитный шейкер.
   4. Инкубировать тарелку в течение 90 минут при комнатной температуре при постоянной тряске при 800 об/мин.
4. Подготовка стандартов и образцов
   1. Во время инкубации подготовьте стандарты белка MeCP2 и/или TAT-MeCP2 и различные образцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Lysis буфер, используемый для стандартного разбавления, должен быть таким же, как и в исследуемых образцах.
   2. Выняйте один флакон из раствора протеинового запаса MePC2 и/или TAT-MeCP2 (250 мкг/мл), щелочаций мозга мыши и лисатов HDF от -80 градусов по Цельсию. Оттепель их на льду.
   3. Разбавить стандартный складраствор (MeCP2 и/или TAT-MeCP2) в чистых трубках в соответствии с таблицей 2.
   4. Разбавить образцы в буфере лисиса следующим образом: 1–20 мкг щели мозга мыши на 25 л буфера из лисиса и 0,25-1 мкг лизата HDF на 25 л буфера лисиса. Подготовьте достаточный объем каждого образца для проведения анализа в тройном.

Стандартный	Концентрации	Разбавления
Стандарт 1	1800 нг/мл	1,08 л стандартный фондовый раствор 148,92 л люсиса буфера
Стандарт 2	600 нг/мл	Буфер 50 Зл Стандарт 1 100 Л Люсиса
Стандарт 3	200 нг/мл	Буфер 50 Зл Стандарт 2 и 100 л люсиса
Стандарт 4	66,67 нг/мл	50 зЛ Стандартный 3 й 100 l L Lysis буфер
Стандарт 5	22.22 нг/мл	Буфер 50 Зл Стандарт 4 и 100 л люсиса
Стандарт 6	7,41 нг/мл	Буфер 50 Зл Стандарт 5 и 100 л люсиса
Стандарт 7	2,47 нг/мл	Буфер 50 Зл Стандарт 6 и 100 л люсиса
Стандарт 8	0,82 нг/мл	Буфер 50 Зл Стандарт 7 и 100 Л Люсиса
Стандарт 9	0,27 нг/мл	50 зЛ Стандарт 8 и 100 л люсиса буфер
Стандарт 10	0 нг/мл	Буфер 150 Л Lysis

Таблица 2: Стандартная серия от 0 до 1800 нг/мл.

5. Добавление образцов и стандартных решений
   1. Удалите блокирующее решение, щелкнув его в корзину для мусора и нажмите тарелку на бумажное полотенце, чтобы удалить все блокирующие растворы из колодцев.
   2. Вымойте тарелку 3x с 150 л стирального раствора, добавив стиральный раствор и немедленно удалите его.
   3. Добавьте 25 ул стандартов и образцов в нижний угол скважины с помощью одного канала пипетки.
   4. Печать пластины и инкубировать пластину в течение 4 ч при комнатной температуре с постоянной тряски на 800 об/мин.
6. Антитела немаркированного обнаружения
   1. Оттепель поликлональных кролика анти-MeCP2 антитела на льду. Разбавить антитела 1:6,000 в расса разбавить раствор.
   2. Удалите стандарты и образцы, щелкнув его в корзину для мусора и нажмите тарелку на бумажное полотенце.
   3. Вымойте тарелку 3x с 150 л стирального раствора, добавив стиральный раствор и немедленно удалите его.
   4. Добавьте 25 зл немаркированных антител обнаружения к каждому колодцу с многоканальным пипеттором. Печать пластины и инкубировать его в течение 1 ч с постоянной тряски при 800 об/мин при комнатной температуре.
7. Специфические конъюгированные антитела
   1. Вынизить из холодильника специфическое вторичное антитело(Таблица материалов)и поместите его на лед. Разбавить антитела 1:666.67 в ассе разбавитель раствора и аккуратно перемешать.
   2. Удалите свободные немаркированные вторичные антитела, щелкнув его в корзину для мусора и нажмите тарелку на бумажное полотенце.
   3. Вымойте тарелку 3x с 150 л стирального раствора, добавив стиральный раствор и немедленно удалите его.
   4. Добавьте 25 зл и специфические конъюгированные антитела(Таблица материалов)к каждому колодцу с многоканальным пипеттором. Печать пластины и инкубировать в течение 1 ч с постоянной тряски при 800 об/мин при комнатной температуре.
8. Чтение тарелки
   1. Удалите свободные спряжение антитела (Таблица материалов), щелкнув его в корзину для мусора и нажмите тарелку на бумажное полотенце.
   2. Вымойте тарелку 3x с 150 зл стирки раствора.
   3. Добавьте 150 зл 1x Tris основе золото читать буфер (Таблица материалов) с сурфактант, содержащий трипропиламин в качестве со-реценгенанта для светогенерации на пластину. Избегайте любых пузырьков воздуха, используя обратные методы пипетки.
   4. Поместите пластину на платформу обнаружения микроплит(Таблица материалов)и немедленно начните измерение. Используйте настройки для приобретения пластины 96 колодцев.
   5. Захват электрохимилуминеционных сигналов встроенной камерой CCD в системе обнаружения электрохимилуминесценции(Таблица материалов)и запись количества сигналов, которые соответствуют относительному световому агрегату (RLU) и прямо пропорциональны интенсивности света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При электрохимической стимуляции метка рутения, привязанная к углеродовому электроду, излучает свет люминесценции на уровне 620 нм. Анализ данных с помощью программного обеспечения, сопровождаемого инструментом(Таблица материалов).

Результаты

Принцип системы ECLIA описан на рисунке 1. Стандартные кривые для двух вариантов MeCP2 отображаются на рисунке 2. Точная количественная оценка была возможна в широком диапазоне концентраций (1–1800 нг/мл). На рисунке 3были проанализированы уровн?...

Обсуждение

Для измерения эндогенных уровней MeCP2, рекомбинантных MeCP2 и TAT-MeCP2 была разработана 96-колодная пластина ECLIA. Было показано, что потеря функции белка MeCP2 приводит к синдрому RTT⁶, для которого лечение в настоящее время ограничивается симптомам управления и физической терапии. Одн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad Laboratories Inc.	500-0006	Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit	Meso Scale Diagnostics	R32AB-1	Antibody
Discovery workbench 4.0	Meso Scale Discovery		Software
DMEM (1X)	gibco by Life Technologies	41966-029	Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Sample preperation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant	Meso Scale Diagnostics	R92TG	MeCP2 ECLIA protocol
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)	GFL	3014	MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)	Sigma-Aldrich	M2670	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)	Abnova Corporation	H00004204-P01	Cell treatment
Microseal B seal	Bio-Rad Laboratories Inc.	MSB1001	for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin	Sigma-Aldrich	M6818-100UL; RRID:AB_262075	Antibody, Coating solution
MSD Blocker A	Meso Scale Diagnostics	R93BA-4	Blocker
MSD SECTOR Imager 2400	Meso Scale Diagnostics	I30AA-0	MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate	Meso Scale Diagnostics	L15XB-3/L11BX-3	MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin	gibco by Life Technologies	15140122	Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit	Eurogentec S.A.	custom-designed	Antibody
Potassium chloride (KCl)	Merck KGaA	1049361000	Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)	Sigma-Aldrich	SAB1404063; RRID:AB_10737296	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)	Sigma-Aldrich	WH0004204M1; RRID:AB_1842411	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)	Sigma-Aldrich	M6818; RRID:AB_262075	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)	Sigma-Aldrich	M7443; RRID:AB_477235	Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)	Cell Signaling Technology	3456S; RRID:AB_2143849	Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Sigma-Aldrich	8340	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Eurogentec S.A.	custom	Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Merck	07-013	Antibody
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014	Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)	Meso Scale Diagnostics	W0015528S	Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein	in-house production		Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X)	gibco by Life Technologies	25200-056	Cell treatment
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Washing solution