Un saggio basato sull'elettrochemiluminescenza per le varianti proteiche MeCP2

Riepilogo

L'elettrochemiluminescenza immunoassay (ECLIA) è un nuovo approccio per il rilevamento quantitativo delle varianti della proteina MeCP2 endogene ed esogenamente applicate su un'ampia gamma di lavoro. Qui, viene descritto il protocollo per il MeCP2-ECLIA in un formato 96-well.

Abstract

L'ECLIA è un metodo versatile che è in grado di quantificare le quantità di proteine endogene e ricombinanti in un formato di 96 pozze. Per dimostrare l'efficienza dell'ECLIA, questo test è stato utilizzato per analizzare i livelli intrinseci di MeCP2 nel tessuto cerebrale del topo e l'assorbimento del TAT-MeCP2 nei fibroblasti dermici umani. Il MeCP2-ECLIA produce misurazioni altamente accurate e riproducibili con basso errore intra-e inter-ssay. In sintesi, abbiamo sviluppato un metodo quantitativo per la valutazione delle varianti proteiche MeCP2 che possono essere utilizzate in schermi ad alta velocità.

Introduzione

L'elettrochemiluminescenza immunoassay (ECLIA) si basa su un processo che utilizza etichette progettate per emettere luminescenza quando stimolata elettrochimicamente. Si tratta di una tecnica ampiamente applicabile per il rilevamento quantitativo di analiti biologici nell'industria di base e nella ricerca accademica, nell'industria alimentare e nella diagnostica clinica¹. Comunemente, viene utilizzata una piastra usa e getta 96 pozze con elettrodi di inchiostro di carbonio. Questi elettrodi agiscono come un vettore solido per l'immunoassay. Un anticorpo secondario viene coniugato a un'etichetta elettrochemiluminescente e quando l'elettricità viene applicata al sistema, viene attivata l'emissione di luce dell'etichetta chimica. Un dispositivo accoppiato a carica di rumore ultra-bassa (CCD) registra l'intensità della luce che è direttamente proporzionale all'antigene legato all'anticorpo di cattura con conseguente quantificazione dell'analita mirata del campione². Rispetto all'analisi immunosorbente legata agli enzimi (ELISA), l'ECLIA è considerata vantaggiosa in quanto offre una maggiore sensibilità e riproducibilità, nonché una migliore automazione e coerenza^{3 .}

Qui abbiamo analizzato i livelli di proteina legante metil-CpG 2 (MeCP2) in campioni di origine umana e murina, nonché diverse varianti della proteina ricombinante utilizzando il nuovo sistema ECLIA. MecP2 è una proteina legante all'acido nucleico legata all'X nota per interagire con sequenze di DNA metilato. Questa proteina è stata implicata nella regolazione dell'espressione genica^4,5. Le mutazioni di perdita di funzione nel gene che codifica questa proteina sono i principali colpevoli della sindrome di Rett (RTT), un grave disturbo neurosviluppo⁶. Un altro disturbo correlato a MeCP2, la sindrome di duplicazione MECP2, porta anche a sintomi neurologici che possono sovrapporsi a quelli di RTT⁷. In particolare, le femmine sono per lo più colpite dalla RTT, mentre i maschi sono per lo più afflitti dalla sindrome di duplicazione MECP2 ^6,7.

Questi disturbi sono associati a livelli insufficiente o in eccesso di MeCP2 rispettivamente nel sistema nervoso centrale (SNC). Di conseguenza, le opzioni di trattamento per RTT che comportano l'aumento dei livelli di MeCP2 nel SNC dovrebbero evitare gli effetti dannosi associati all'eccesso di MeCP2⁷. A causa di questo fatto, una quantificazione altamente sensibile e accurata dei livelli di proteina MeCP2, come previsto dal sistema ECLIA, è cruciale per il progresso della RTT e la ricerca sulla sindrome di duplicazione MECP2. Le misurazioni precise dei livelli endogeni ed esogeni di MeCP2 da linee cellulari umane e campioni di tessuto murino, nonché una proteina ricombinante costituita da isoformo B umano (noto anche come isoforme e1), e un dominio minimo di trasduzione HIV-TAT N-terminal (TAT-MeCP2) che ha il potenziale di attraversare il sangue-barriera cerebrale^8,9 sono presentati in questo lavoro.

Protocollo

L'approvazione per l'approvvigionamento di biopsia cutanea a scopo di ricerca è stata ottenuta dal Comitato Etico della Ricerca Umana dell'Ospedale pediatrico di Westmead, Australia. Il consenso per gli esperimenti sugli animali è stato ottenuto dal Ministero federale austriaco della scienza, della ricerca e dell'economia, che sono stati effettuati in conformità con le normative locali sul benessere degli animali (G: 66.009/0218-II/3b/2015).

NOTA: il principio del sistema ECLIA è illustrato nella figura 1.

1. Selezione anticorpale

1. Valutare il rapporto segnale-rumore per una gamma di vari anticorpi MeCP2 e identificare la migliore potenza del segnale e la massima specificità all'interno della combinazione di un anticorpo MeCP2 monoclonale del topo primario (clone Mec-168) e dell'anticorpo di rilevamento policlonale meCP2 del coniglio (fatto su misura). Per l'anticorpo secondario, utilizzare un anticorpo specifico del sistema (Tabella dei materiali), anch'esso verificato sperimentalmente.
   NOTA: La tabella 1 fornisce una panoramica di tutti gli anticorpi verificati durante lo sviluppo MeCP2-ECLIA e delle loro gamme di diluizione testate.

Funzione	Nome	Clone	Diluizione
Primario	Mouse, anti-MeCP2	Mec-168	1:500-1:10.000
Primario	Mouse, anti-MeCP2	4B6 (in inglese)	1:250-1:4.000
Primario	Mouse, anti-MeCP2	Uomini-8	1:500-1:4.000
Primario	Mouse, anti-MeCP2	1B11 (in tissuma	1:500-1:4.000
Primario	Coniglio anti-MeCP2	D4F3	1:500-1:4.000
Secondario	Coniglio anti-MeCP2	Policlonale	1:2,000-1:20.000
Secondario	Coniglio anti-MeCP2	Policlonale	1:2,000-1:20.000
Rilevamento	SulFO-TAG etichettato anti-coniglio	Policlonale	1:500-1:1.000

Tabella 1: Elenco degli anticorpi e diluazioni di lavoro usate.

2. In alternativa, utilizzare ogni coppia di anticorpi MeCP2 che funziona bene con ELISA convenzionale.

2. Trattamento delle MGIF con proteina di fusione TAT-MeCP2

NOTA: TAT-MeCP2 è stato espresso in ricombinante in Escherichia coli e purificato utilizzando tecniche cromatografiche standard come descritto in precedenza⁸ e conservato a -80 gradi centigradi.

1. Piastra 1 x 10⁶ cellule del fibroblasto dermico umano (HDF) in piatti da 100 mm e far crescere le cellule durante la notte a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂ fino a raggiungere circa il 90% di confluenza.
2. Estrarre una fiala di proteina di fusione TAT-MeCP2. Scongelare sul ghiaccio e mescolare delicatamente.
3. Diluire TAT-MeCP2 ad una concentrazione finale di 500 nM in 50 mL di supporti di coltura HDF.
4. Rimuovere il supporto da piatti da 100 mm e incubare le cellule con 500 nM TAT-MeCP2 a 37 gradi centigradi per vari periodi di incubazione fino a 24 h.
5. Rimuovere la soluzione TAT-MeCP2 dalle celle. Lavare le cellule 2x con la salina preriscaldata di Dulbecco (DPBS).
6. Trattare le cellule con 2 mL di 0.05% soluzione trypsin-EDTA per 5 min a 37 c¹⁰.
7. Aggiungere 6 mL di supporti di coltura HDF per disattivare la trypsin e raccogliere le cellule in tubi da 15 mL.
8. Pellet le cellule per centrifugazione a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente.
9. Rimuovere il supernatante e lavare le cellule 2x con DPBS ghiacciato. Conservare il pellet sul ghiaccio e procedere con la preparazione del campione.

3. Preparazione dei campioni

1. Listi HDF
   1. Determinare i livelli proteici più alti di MeCP2 utilizzando il metodo REAP per la frazione subcellulare nei compartimenti subcellulari e citoplasmati secondo Suzuki et al.¹¹. Limitare la frazione a non più di sei campioni per esperimento.
2. Lismi cerebrali di topo
   1. Preparare 100 mL di ogni reagente ipotonico di lisi e buffer di estrazione.
      1. Per il reagente di lisi ipotonica, mescolare ben 10 mM HEPES, 1,5 mM di cloruro di magnesio e 10 mM di cloruro di potassio.
      2. Per il buffer di estrazione, mescolare bene 20 mM di clordino, 1,5 mM di cloruro di magnesio, 0,42 M di cloruro di sodio, 0,2 mM EDTA e 25% (v/v) glicerolo.
      3. Regolare il pH di entrambi i buffer su 7.9.
      4. Aggiungere 1 mM dithiothreitol (DTT) e 1x cocktail inibitore proteasi a entrambi i buffer al fresco. Raffreddare sul ghiaccio prima dell'uso.
   2. Sospendere 100 mg di cervello topo totale (ceppo: C57BL/6J, wildtype maschio e femmina e B6.129P2(C)-Mecp2^tm1.1Bird/J, maschio eterozigoo femmina; età: 4-8 settimane) in 1 mL di reagente lisi ipotonico freddo.
   3. Omogeneizzare il cervello con un omogenizzatore di tessuto di tessuto di vetro pre-freddo da 15 colpi di omogeneizzatore A (sciolto, per grande distanza) e B (stretto, per piccola distanza), rispettivamente.
   4. Trasferire le cellule omogeneizzate in un tubo pulito e centrifugare a 10.000 x g per 20 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante (o tenerlo come frazione citoplasmatica per un ulteriore uso).
   5. Risospendere il pellet in 140 : L di buffer di estrazione per 100 mg di materiale di partenza. Mettere il tubo in un termoblocco pre-raffreddato e mescolare delicatamente per 30 min a 4 gradi centigradi.
   6. Centrifugare il tubo a 16.000 g per 10 min a 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante (cioè la frazione nucleare) in un nuovo tubo pre-raffreddato e conservarlo a -80 gradi centigradi fino all'uso.
      NOTA: La concentrazione proteica di lismi derivati dal cervello di topo e dall'HDF può essere valutata dall'analisi della proteina BCA.

4. Protocollo MeCP2-ECLIA

1. Preparazione della soluzione di lavaggio, blocco tampone e soluzione diluente di analisi (giorno 1)
   1. Aggiungere 500 l of Tween 20 a 1 L di PBS per preparare uno 0,05% Tween 20 in soluzione PBS, mescolare vigorosamente ed etichettare come "soluzione di lavaggio".
      NOTA: Assicurarsi che venga utilizzato solo il buffer di lavaggio appena preparato.
   2. Preparare una soluzione di blocco del blocco del 3% A (Tabella dei materiali) in salina con buffer fosfato (PBS). Mescolare mescolando delicatamente, filtrare sterilizzare e tenerli in frigo fino all'uso per un massimo di due settimane.
   3. Aggiungere 5 mL di soluzione di blocco a 10 mL di PBS per preparare la soluzione diluente di valutazione (1% blocco A in PBS).
2. Rivestimento di piastre ad alto legame
   1. Estrarre una piastra ad alto legame a punto singolo a 16-pozzetto.
      NOTA: Le piastre ad alto legame hanno una maggiore capacità di rilegatura e quindi una gamma dinamica più ampia rispetto alle piastre standard con superfici idrofobiche.
   2. Scongelare l'anticorpo monoclonale anti-MeCP2 sul ghiaccio e mescolare 0,67 l dell'anticorpo con 4 mL di PBS (1:6,000 di luidione anticorpo in PBS). Vorticare la soluzione anticorpale per mescolare bene ed etichettare il tubo come "soluzione di rivestimento".
   3. erogare con cura 25 - di soluzione di rivestimento nell'angolo inferiore di ogni pozzo utilizzando un pipettor multicanale; questo è chiamato il metodo di rivestimento della soluzione. Toccare delicatamente la piastra del 96 po' su ciascun lato per assicurarsi che la soluzione di rivestimento copra il fondo di ogni pozzo.
   4. Sigillare la piastra con un foglio adesivo e incubare la piastra in frigorifero a 4 gradi centigradi durante la notte (12-16 h).
3. Blocco (giorno 2)
   1. Estrarre il piatto dal frigorifero e rimuovere la pellicola.
   2. Rimuovere la soluzione di rivestimento degli anticorpi sfogliandola nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere tutta la soluzione di rivestimento dai pozzetti.
   3. Aggiungere 125 l di soluzione di blocco per bene. Sigillare nuovamente la piastra e posizionarla su uno shaker di microplacca orbitale.
   4. Incubare la piastra per 90 min a temperatura ambiente con agitazione costante a 800 giri/m.
4. Preparazione di norme e campioni
   1. Durante il periodo di incubazione, preparare gli standard proteici MeCP2 e/o TAT-MeCP2 e vari campioni.
      NOTA: il buffer di lisi utilizzato per la diluizione standard deve essere lo stesso utilizzato nei campioni analizzati.
   2. Estrarre una fiala della soluzione di stock proteica MePC2 e/o TAT-MeCP2 (250 g/mL), le talità cerebrali di topo e listi HDF da -80 gradi centigradi. Scongelarli sul ghiaccio.
   3. Diluire la soluzione standard (MeCP2 e/o TAT-MeCP2) in tubi puliti secondo la tabella 2.
   4. Diluire i campioni nel buffer di lisi come segue: 1,20 g di lisata cerebrale del topo per 25 , l'una del buffer di lisi, e 0,25,1 g di lisate HDF per 25 , luna di buffer di lisi. Preparare un volume sufficiente di ogni campione per eseguire l'analisi in triplice copia.

Standard	Concentrazione	Diluizione
Standard 1	1.800 ng/mL	Soluzione di stock standard 148,92 - buffer di lis
Standard 2	600 ng/mL	50 - L Buffer di lisi
Standard 3	200 ng/mL	50 - L Buffer di lisi
Standard 4	66,67 ng/mL	50 - L Standard 3 - 100 buffer di lisi
Standard 5	22.22 ng/mL	50 - L Standard 4 - 100 buffer di lisi
Standard 6	7.41 ng/mL	50 - L Standard 5 - 100 buffer di lisi
Standard 7	2.47 ng/mL	50 - L Standard 6 - 100 buffer di Lisi
Standard 8	0,82 ng/mL	50 - L Standard 7 - 100 buffer di lisi
Standard 9	0,27 ng/mL	50 - L Standard 8 - 100 buffer di lisi
Standard 10	0 ng/mL	Buffer di lisi da 150 l'l

Tabella 2: Serie standard da 0 a 1.800 ng/mL.

5. Aggiunta di esempi e soluzioni standard
   1. Rimuovere la soluzione di blocco facendola scorrere nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere tutta la soluzione di blocco dai pozzetti.
   2. Lavare la piastra 3 volte con 150 l di lavatrice aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.
   3. Aggiungere 25 ul di standard e campioni nell'angolo inferiore del pozzo utilizzando una pipetta a canale singolo.
   4. Sigillare la piastra e incubare la piastra per 4 h a temperatura ambiente con agitazione costante a 800 giri/min.
6. Anticorpi di rilevamento senza etichetta
   1. Scongelare l'anticorpo anti-MeCP2 del coniglio policlonale sul ghiaccio. Diluire l'anticorpo 1:6,000 in soluzione diluente saggio.
   2. Rimuovere gli standard e i campioni sfogliandolo nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta.
   3. Lavare la piastra 3 volte con 150 l di lavatrice aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.
   4. Aggiungete 25 l di anticorpi di rilevamento senza etichetta in ogni pozzo con il pipettor multicanale. Sigillare la piastra e incubarla per 1 h con agitazione costante a 800 giri/min a temperatura ambiente.
7. Anticorpo coniugato specifico
   1. Estrarre l'anticorpo secondario specifico (Tabella dei materiali) dal frigorifero e posizionarlo sul ghiaccio. Diluire l'anticorpo 1:666.67 nella soluzione diluente di analisi e mescolare delicatamente.
   2. Rimuovere l'anticorpo secondario gratuito senza etichetta facendolo scorrere nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta.
   3. Lavare la piastra 3 volte con 150 l di lavatrice aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.
   4. Aggiungere 25 l di anticorpo coniugato specifico (Tabella dei materiali) ad ogni pozzo con il pipettor multicanale. Sigillare la piastra e incubare per 1 h con agitazione costante a 800 giri/min a temperatura ambiente.
8. Lettura della piastra
   1. Rimuovere l'anticorpo coniugato gratuito (Tabella dei materiali) facendolo scorrere nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta.
   2. Lavare la piastra 3volte con 150 l di soluzione di lavaggio.
   3. Aggiungete 150 l di 1x buffer di lettura oro a base di Tris (Tabella dei materiali) con un surfactant contenente tripropylamine come co-reattore per la generazione di luce alla piastra. Evitare eventuali bolle d'aria utilizzando tecniche di reverse pipetting.
   4. Posizionare la piastra sulla piattaforma di rilevamento della micropiastra (Table of Materials) e avviare immediatamente la misurazione. Utilizzare le impostazioni per l'acquisizione di piastre di 96 pozze.
   5. Catturare i segnali di elettrochemiluminescenza da una telecamera CCD integrata in un sistema di rilevamento dell'elettrochemiluminescenza (Tabella dei materiali) e registrare i conteggi dei segnali, che corrispondono alle unità di luce relativa (RLU) e sono direttamente proporzionali all'intensità della luce.
      NOTA: Dopo la stimolazione elettrochimica, l'etichetta del rutenio legata all'elettrodo di carbonio emette luce di luminescenza a 620 nm. Analizzare i dati con il software accompagnato dallo strumento (Tabella dei Materiali).

Risultati

Il principio del sistema ECLIA è descritto nella Figura 1. Le curve standard per due varianti MeCP2 sono mostrate nella Figura 2. La quantificazione accurata è stata possibile su un'ampia gamma di concentrazioni (1,800 ng/mL). Nella Figura 3,sono stati analizzati i livelli MeCP2 di lismi derivati dal cervello di topo e dall'HDF. Espressione MeCP2 in lisati nucleari cerebrali da topi eterozici, wildtype e knockout sono stati confro...

Discussione

Per misurare i livelli endogeni MeCP2, ricombinanti MeCP2 e TAT-MeCP2, è stato sviluppato un ECLIA a 96 pozzetti. È stato dimostrato che la perdita della funzione della proteina MeCP2 porta alla sindrome RTT⁶, per la quale il trattamento è attualmente limitato alla gestione dei sintomi e alla terapia fisica. Un promettente viale di trattamento è la cosiddetta terapia sostitutiva delle proteine, dove i livelli di MeCP2 possono essere titolati fino alla loro concentrazione necessaria

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad Laboratories Inc.	500-0006	Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit	Meso Scale Diagnostics	R32AB-1	Antibody
Discovery workbench 4.0	Meso Scale Discovery		Software
DMEM (1X)	gibco by Life Technologies	41966-029	Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Sample preperation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant	Meso Scale Diagnostics	R92TG	MeCP2 ECLIA protocol
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)	GFL	3014	MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)	Sigma-Aldrich	M2670	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)	Abnova Corporation	H00004204-P01	Cell treatment
Microseal B seal	Bio-Rad Laboratories Inc.	MSB1001	for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin	Sigma-Aldrich	M6818-100UL; RRID:AB_262075	Antibody, Coating solution
MSD Blocker A	Meso Scale Diagnostics	R93BA-4	Blocker
MSD SECTOR Imager 2400	Meso Scale Diagnostics	I30AA-0	MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate	Meso Scale Diagnostics	L15XB-3/L11BX-3	MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin	gibco by Life Technologies	15140122	Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit	Eurogentec S.A.	custom-designed	Antibody
Potassium chloride (KCl)	Merck KGaA	1049361000	Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)	Sigma-Aldrich	SAB1404063; RRID:AB_10737296	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)	Sigma-Aldrich	WH0004204M1; RRID:AB_1842411	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)	Sigma-Aldrich	M6818; RRID:AB_262075	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)	Sigma-Aldrich	M7443; RRID:AB_477235	Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)	Cell Signaling Technology	3456S; RRID:AB_2143849	Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Sigma-Aldrich	8340	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Eurogentec S.A.	custom	Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Merck	07-013	Antibody
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014	Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)	Meso Scale Diagnostics	W0015528S	Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein	in-house production		Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X)	gibco by Life Technologies	25200-056	Cell treatment
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Washing solution