MeCP2 단백질 변이체에 대한 전기 화학 발광 기반 분석

요약

전기 화학 발광 면역 분석 (ECLIA)은 내인성 및 외인성 적용 MeCP2 단백질 변이체의 정량적 검출을위한 새로운 접근법으로, 광범위한 작업 범위에 걸쳐 낮은 인트라 및 분석 오류로 높은 정량적, 정확하고 재현 가능한 측정을 생성합니다. 여기서, MeCP2-ECLIA에 대한 프로토콜을 96웰 형식으로 설명한다.

초록

ECLIA는 96 웰 포맷으로 내인성 및 재조합 단백질 양을 정량화할 수 있는 다목적 방법입니다. ECLIA 효율성을 입증하기 위해, 이 분석은 마우스 뇌 조직에서 MeCP2의 본질적인 수준을 분석하고 인간 진피 섬유아세포에서 TAT-MeCP2의 섭취를 분석하는 데 사용되었다. MeCP2-ECLIA는 낮은 분석 및 분석 간 오류로 매우 정확하고 재현 가능한 측정을 생성합니다. 요약하자면, 우리는 고처리량 스크린에서 이용될 수 있는 MeCP2 단백질 변이체의 평가를 위한 정량적인 방법을 개발했습니다.

서문

전기 화학 발광 면역 분석 (ECLIA)는 전기 화학적으로 자극 될 때 발광을 방출하도록 설계된 라벨을 활용하는 프로세스를 기반으로합니다. 그것은 임상 진단 1뿐만 아니라 기초 산업 및 학술 연구, 식품 산업에서 생물학적 분석물의 정량적 검출을 위한 광범위하게 적용 가능한^{기술이다.} 일반적으로 탄소 잉크 전극이 있는 일회용 96웰 플레이트가 사용됩니다. 이들 전극은 면역분석에 대한 고체상 담체로서 작용한다. 이차 항체는 전기 발광 라벨에 공액되고 전기가 시스템에 가해지면 화학 라벨의 발광이 트리거됩니다. 초저잡음 전하 결합 장치(CCD)는 포획 항체에 결합된 항원과 정비례하는 광 강도를 기록하여 샘플^2의표적 화된 공액을 정량화합니다. 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)에 비해 ECLIA는 더 높은 감도 및 재현성을 제공하며 더 나은 자동화 및 일관성^3을제공함에 있어 유리한 것으로 간주됩니다.

여기서 우리는 새로 개발된 ECLIA 시스템을 사용하여 인간 및 뮤린 기원의 샘플에서 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2) 수준뿐만 아니라 재조합 단백질의 상이한 변이체를 분석하였다. MecP2는 메틸화된 DNA 서열과 상호 작용하는 것으로 알려진 X-연결된 핵산 결합 단백질입니다. 이 단백질은 유전자^{발현4,,5의}조절에 연루되어 있다. 이 단백질을 부호 매코딩하는 유전자에 있는 기능 상실 돌연변이는 Rett 증후군 (RTT),⁶가혹한 신경 발달 무질서6를 일으키는 원인이 되는 주요 범인입니다. 또 다른 MeCP2 관련 장애, MECP2 중복 증후군, 또한 RTT의 그들과 겹칠 수 있는 신경 증상으로 이어질^7. 특히, 여성은 주로 RTT에 의해 영향을받는 반면 남성은 주로 MECP2 중복 증후군^6,,7에의해 고통받고 있습니다.

이러한 장애는 중추 신경계 (CNS)에서 각각 부족하거나 과잉 MeCP2 수준과 관련이 있습니다. 따라서, CNS에서 MeCP2 수준을 증가 포함 하는 RTT에 대 한 치료 옵션 MeCP2의 초과와 관련 된 해로운 효과 방지 해야 할 것 이다⁷. 이 사실로 인해 ECLIA 시스템에서 제공하는 MeCP2 단백질 수준의 매우 민감하고 정확한 정량화는 RTT의 발전과 MECP2 중복 증후군 연구에 매우 중요합니다. 인간 세포주 및 마우스 조직 샘플로부터 내인성 및 외인성 MeCP2 수준의 정밀한 측정은 인간 MeCP2 이소폼 B(또한 이소폼 e1라고도 함)로 구성된 재조합 단백질뿐만 아니라, 혈액-뇌^장벽을,교차시킬 가능성이 있는 최소한의 N-말단 HIV-TAT 트랜스듀션 도메인(TAT-MeCP2)이 이 작업에서^{제시된다.}

프로토콜

연구 목적을 위한 피부 생검 조달을 위한 승인은 웨스트미드에 있는 아동 병원의 인간 연구 윤리 위원회에서, 오스트레일리아에서 얻었습니다. 동물 실험에 대한 동의는 오스트리아 연방 과학 경제부에서 얻어졌으며, 이는 현지 동물 복지 규정에 따라 수행되었습니다(GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

참고: ECLIA 시스템의 원리는 그림 1에설명되어 있습니다.

1. 항체 선택

1. 다양한 MeCP2 항체의 범위에 대한 신호 대 잡음 비를 평가하고 1차 마우스 모노클로날 MeCP2 항체(클론 Mec-168) 및 토끼 폴리클로날 MeCP2 검출 항체(맞춤형)의 조합 내에서 최고의 신호 강도 및 최고 특이성을 식별한다. 이차 항체의 경우, 시스템 특이적항체(물자 표)를사용하며, 이는 또한 실험적으로 검증되었다.
   참고: 표 1은 MeCP2-ECLIA 개발 및 이들의 시험된 희석 범위 동안 검증된 모든 항체에 대한 개요를 제공합니다.

함수	이름	복제	희석
기본	마우스, 안티 MeCP2	멕-168	1:500−-1:10,000
기본	마우스, 안티 MeCP2	4B6	1:250-1:4,000
기본	마우스, 안티 MeCP2	남성 8	1:500-1:4,000
기본	마우스, 안티 MeCP2	1B11	1:500-1:4,000
기본	토끼, 안티 MeCP2	D4F3	1:500-1:4,000
보조	토끼, 안티 MeCP2	Polyclonal	1:2,000−1:20,000
보조	토끼, 안티 MeCP2	Polyclonal	1:2,000−1:20,000
검색	SULFO-TAG 라벨 안티 토끼	Polyclonal	1:500−-1:1,000

표 1: 항체 및 사용된 작용 희석의 목록.

2. 대안적으로, 기존의 ELISA와 잘 작동하는 각 쌍의 MeCP2 항체를 사용한다.

2. TAT-MeCP2 융합 단백질로 HDF 치료

참고: TAT-MeCP2는 대장균에서 재조합하여 발현하고, 앞서 설명한^바와 같이 표준 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제하고 -80°C에서 저장하였다.

1. 플레이트 1 x 10⁶ 인간 진피 섬유아세포(HDF) 세포를 100 mm 접시에 5%_CO2로 37°C에서 밤새 성장시키고 약 90% 동률에 도달할 때까지 세포를 성장시다.
2. TAT-MeCP2 융합 단백질 1병을 꺼내십시오. 얼음을 녹이고 부드럽게 섞어주세요.
3. TAT-MeCP2를 HDF 배양 배지의 50 mL에서 500 nM의 최종 농도로 희석한다.
4. 100 mm 접시에서 매체를 제거하고 최대 24 시간까지 다양한 잠복기 동안 37 °C에서 500 nM TAT-MeCP2로 세포를 배양합니다.
5. 셀에서 TAT-MeCP2 용액을 제거합니다. 미리 데운 덜베코의 인산완식염수(DPBS)로 세포를 2x 세척합니다.
6. 37 °C^10에서5 분 동안 0.05 % 트립신 -EDTA 용액의 2 mL로 세포를 치료하십시오.
7. 6 mL의 HDF 배양 배지를 추가하여 트립신을 비활성화하고 15 mL 튜브에서 세포를 수집합니다.
8. 실온에서 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.
9. 상한제를 제거하고 얼음으로 차가운 DPBS로 세포를 2x 씻어 내다. 펠릿을 얼음위에 보관하고 시료 준비를 진행합니다.

3. 견본 준비

1. HDF 리세이츠
   1. 스즈키 외^11에따르면 세포질 및 핵 세포 전구내의 세포분열에 대한 REAP 방법을 사용하여 MeCP2의 가장 높은 단백질 수준을 결정한다. 분획을 실험당 6개 이하로 제한합니다.
2. 마우스 뇌가 리세이트
   1. 각 저혈압 매리시스 시약 및 추출 완충제의 100 mL을 준비합니다.
      1. 저혈압 용염 시약의 경우, 잘 혼합 10 mM HEPES, 1.5 mM 염화 마그네슘 과 10 mM 염화 칼륨.
      2. 추출 버퍼의 경우, 잘 혼합 20 mM HEPES, 1.5 mM 염화 마그네슘, 0.42 M 염화 나트륨, 0.2 mM EDTA, 그리고 25% (v/v) 글리세롤.
      3. 두 버퍼의 pH를 7.9로 조정합니다.
      4. 1 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 프로테아제 억제제 칵테일 1m를 두 버퍼에 신선하게 첨가합니다. 사용하기 전에 얼음을 식히세요.
   2. 일시 중단 100 총 마우스 뇌의 mg (변형: C57BL/6J, 야생형 남성과 여성 및 B6.129P2 (C)-Mecp2^tm1.1Bird/J,hemizygous 남성 및 이종 시균의 1 mL에 4−8 주 령.
   3. 미리 냉각 된 Dounce 모든 유리 조직 균질화로 뇌를 균질화15 스트로크의 균질화 A (느슨한, 큰 클리어런스) 및 B (좁은 정리를 위해) 각각.
   4. 균질화된 세포를 4°C에서 20분 동안 10,000 x g에서 깨끗한 튜브 및 원심분리기로 옮긴다. 상급제를 폐기하십시오 (또는 추가 사용을 위해 세포 플라즈마 분획으로 보관하십시오).
   5. 시작 재료 100 mg당 추출 버퍼의 140 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 튜브를 예식된 열블록에 놓고 4°C에서 30분간 부드럽게 섞습니다.
   6. 4 °C에서 10 분 동안 16,000 g에서 튜브를 원심 분리합니다. 상층부(즉, 핵 분획)를 새로운 사전 냉각 튜브로 옮기고 사용 될 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.
      참고: 마우스 뇌및 HDF에서 유래한 리세이트의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석에 의해 평가될 수 있습니다.

4. MeCP2-ECLIA 프로토콜

1. 세척 용액, 차단 완충제 및 분석 희석제 용액의 준비 (1 일째)
   1. 500 μL의 Tween 20 ~1 L의 PBS를 추가하여 PBS 용액에 0.05 % 트웬 20을 준비하고 격렬하게 혼합하고 "세척 용액"으로 라벨을 붙입니다.
      참고: 갓 준비한 세척 버퍼만 사용해야 합니다.
   2. 인산완식염수(PBS)에서 3% 블로커A(재료표)의차단 용액을 준비한다. 부드럽게 저어서 섞고, 걸소 살균하고 최대 2주 동안 사용할 때까지 냉장고에 보관하세요.
   3. PBS 의 10 mL에 차단 용액 5 mL을 추가하여 분석 희석제 용액 (PBS에서 1 % 차단기 A)을 준비하십시오.
2. 높은 바인드 플레이트 코팅
   1. 96 웰 멀티 어레이 단일 스팟 높은 바인드 플레이트를 꺼낸다.
      참고: 높은 바인드 플레이트는 결합 능력이 크기 때문에 소수성 표면이 있는 표준 플레이트보다 동적 범위가 더 큽습니다.
   2. 단일클론 마우스 항-MeCP2 항체를 얼음 상에 해동하고 항체의 0.67 μL을 PBS의 4 mL(PBS에서 1:6,000 항체 희석)으로 혼합한다. 항체 용액을 잘 혼합하고 튜브를 "코팅 용액"으로 라벨링합니다.
   3. 다중 채널 피펫터를 사용하여 각 웰의 하단 모서리에 25 μL의 코팅 용액을 조심스럽게 분배하는 단계; 이를 용액 코팅 방법이라고 합니다. 양쪽의 96웰 플레이트를 부드럽게 눌러 코팅 용액이 각 우물의 바닥을 덮도록 합니다.
   4. 접착제 호일로 플레이트를 밀봉하고 밤새 4 °C (12−16 h)에서 냉장고에 접시를 인큐베이션.
3. 블로킹 (2일차)
   1. 냉장고에서 접시를 꺼내 호일을 제거합니다.
   2. 폐기 바구니에 던져 항체 코팅 용액을 제거하고 우물에서 모든 코팅 용액을 제거하기 위해 종이 타월에 접시를 누릅니다.
   3. 웰당 차단 용액 125 μL을 추가합니다. 플레이트를 다시 밀봉하고 궤도 마이크로 플레이트 셰이커에 놓습니다.
   4. 800 rpm에서 일정한 흔들림으로 실온에서 90 분 동안 접시를 배양하십시오.
4. 표준 및 시료 준비
   1. 인큐베이션 시간 동안 MeCP2 및/또는 TAT-MeCP2 단백질 표준 및 다양한 샘플을 준비합니다.
      참고: 표준 희석에 사용되는 용해 버퍼는 분석된 샘플에 사용되는 것과 동일해야 합니다.
   2. MePC2 및/또는 TAT-MeCP2 단백질 스톡 솔루션(250 μg/mL)의 유리병을 꺼내면 마우스 뇌가 용해되고 HDF가 -80°C에서 용해됩니다. 얼음에 그들을 해동.
   3. 표 2에따라 표준 스톡 솔루션(MeCP2 및/또는 TAT-MeCP2)을 깨끗한 튜브에 희석합니다.
   4. 다음과 같이 용해 완충액으로 샘플을 희석: 용해 완충액의 25 μL당 마우스 뇌 용해액의 1-20 μg, 용해 완충액의 25 μL 당 HDF 용해의 0.25-1 μg. 각 시료의 충분한 부피를 준비하여 삼중으로 분석을 수행합니다.

표준	농도	희석
표준 1	1,800 ng/mL	1.08 μL 표준 재고 솔루션 + 148.92 μL 용해 버퍼
표준 2	600 ng/mL	50 μL 표준 1 + 100 μL Lysis 버퍼
표준 3	200 ng/mL	50 μL 표준 2 + 100 μL Lysis 버퍼
표준 4	66.67 ng/mL	50 μL 표준 3 + 100 μL Lysis 버퍼
표준 5	22.22 ng/mL	50 μL 표준 4 + 100 μL Lysis 버퍼
표준 6	7.41 ng/mL	50 μL 표준 5 + 100 μL Lysis 버퍼
표준 7	2.47 ng/mL	50 μL 표준 6 + 100 μL Lysis 버퍼
표준 8	0.82 ng/mL	50 μL 표준 7 + 100 μL Lysis 버퍼
표준 9	0.27 ng/mL	50 μL 표준 8 + 100 μL Lysis 버퍼
표준 10	0 ng/mL	150 μL Lysis 버퍼

표 2: 0에서 1,800 ng/mL까지의 표준 시리즈.

5. 샘플 및 표준 솔루션 추가
   1. 폐바구니에 던져 서 차단 용액을 제거하고 우물에서 모든 차단 솔루션을 제거하기 위해 종이 타월에 접시를 누릅니다.
   2. 세척 용액을 추가하고 즉시 제거하여 150 μL의 세척 용액으로 플레이트를 3x 씻어 내보소.
   3. 단일 채널 파이펫을 사용하여 웰의 하단 모서리에 25 ul의 표준 및 샘플을 추가합니다.
   4. 접시를 밀봉하고 800 rpm에서 일정한 흔들림으로 실온에서 4 시간 동안 플레이트를 배양하십시오.
6. 표지되지 않은 검출 항체
   1. 얼음에 폴리 클론 토끼 항 MeCP2 항체를 해동. 분석 희석액으로 항체 1:6,000을 희석한다.
   2. 표준과 샘플을 쓰레기 바구니에 던져 서 제거하고 종이 타월에 접시를 누릅니다.
   3. 세척 용액을 추가하고 즉시 제거하여 150 μL의 세척 용액으로 플레이트를 3x 씻어 내보소.
   4. 다중 채널 파이펫터를 사용하여 각 우물에 25 μL의 라벨이 없는 검출 항체를 추가합니다. 접시를 밀봉하고 실온에서 800 rpm에서 일정한 흔들림으로 1 시간 동안 배양하십시오.
7. 특정 공액 항체
   1. 냉장고에서 특정 이차 항체(재료 표)를꺼내 얼음에 놓습니다. 항체를 희석시키는 분석액으로 1:666.67을 희석시키고 부드럽게 섞는다.
   2. 라벨이 부착되지 않은 이차 항체를 폐기 바구니에 넣고 종이 타월로 접시를 탭합니다.
   3. 세척 용액을 추가하고 즉시 제거하여 150 μL의 세척 용액으로 플레이트를 3x 씻어 내보소.
   4. 다중 채널 파이펫터를 사용하여 각각의 웰에 25 μL의 특정 공액 항체(재료 표)를추가합니다. 접시를 밀봉하고 실온에서 800 rpm에서 일정한 흔들림으로 1 시간 동안 배양하십시오.
8. 접시 읽기
   1. 자유 공액항체(재료 표)를폐기 바구니에 넣고 종이 타월로 접시를 탭합니다.
   2. 세척 용액 150 μL로 플레이트를 3x 씻으소서.
   3. 트리프로필라민을 함유하는 계면활성제와 함께 1x Tris 계금 판독버퍼(표)의150 μL을 플레이트에 광 발생을 위한 공동 반응제로 첨가한다. 역피케팅 기술을 사용하여 기포를 피하십시오.
   4. 플레이트를 마이크로 플레이트 검출플랫폼(재료 표)에놓고 즉시 측정을 시작합니다. 96웰 플레이트 수집을 위한 설정을 사용합니다.
   5. 전기 화학 발광 검출 시스템(재료표)에내장 된 CCD 카메라에 의해 전기 화학 발광 신호를 캡처하고 상대 광 단위 (RLU)에 해당하고 빛의 강도에 정비례하는 신호 수를 기록합니다.
      참고: 전기화학적 자극시, 탄소 전극에 결합된 루테늄 라벨은 620 nm에서 발광광을 방출한다. 계측기 와드소프트웨어(재료 표)로데이터를 분석합니다.

결과

ECLIA 시스템의 원리는 그림 1에설명되어 있습니다. 두 개의 MeCP2 변형에 대한 표준 곡선은 그림 2에나와 있습니다. 광범위한 농도(1-1,800 ng/mL)에서 정확한 정량화가 가능했습니다. 도 3에서마우스 뇌 및 HDF에서 유래된 메CP2 수준의 포액을 분석했습니다. 이형에서의 뇌 핵 용해물에서의 MeCP2 발현, 야생형 및 녹아웃 마우스는

토론

내인성 MeCP2, 재조합 MeCP2 및 TAT-MeCP2 수준을 측정하기 위해 96 웰 플레이트 ECLIA가 개발되었습니다. MeCP2 단백질 기능의 손실은 RTT 증후군^6으로이어지며, 치료는 현재 증상 관리 및 물리 치료로 제한됩니다. 1개의 유망한 처리 도로는 MeCP2 수준이 그들의 필요로 한 농도까지 적정될 수 있는 소위 단백질 대체 요법입니다^12,,13,,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad Laboratories Inc.	500-0006	Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit	Meso Scale Diagnostics	R32AB-1	Antibody
Discovery workbench 4.0	Meso Scale Discovery		Software
DMEM (1X)	gibco by Life Technologies	41966-029	Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Sample preperation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant	Meso Scale Diagnostics	R92TG	MeCP2 ECLIA protocol
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)	GFL	3014	MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)	Sigma-Aldrich	M2670	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)	Abnova Corporation	H00004204-P01	Cell treatment
Microseal B seal	Bio-Rad Laboratories Inc.	MSB1001	for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin	Sigma-Aldrich	M6818-100UL; RRID:AB_262075	Antibody, Coating solution
MSD Blocker A	Meso Scale Diagnostics	R93BA-4	Blocker
MSD SECTOR Imager 2400	Meso Scale Diagnostics	I30AA-0	MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate	Meso Scale Diagnostics	L15XB-3/L11BX-3	MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin	gibco by Life Technologies	15140122	Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit	Eurogentec S.A.	custom-designed	Antibody
Potassium chloride (KCl)	Merck KGaA	1049361000	Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)	Sigma-Aldrich	SAB1404063; RRID:AB_10737296	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)	Sigma-Aldrich	WH0004204M1; RRID:AB_1842411	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)	Sigma-Aldrich	M6818; RRID:AB_262075	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)	Sigma-Aldrich	M7443; RRID:AB_477235	Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)	Cell Signaling Technology	3456S; RRID:AB_2143849	Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Sigma-Aldrich	8340	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Eurogentec S.A.	custom	Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Merck	07-013	Antibody
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014	Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)	Meso Scale Diagnostics	W0015528S	Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein	in-house production		Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X)	gibco by Life Technologies	25200-056	Cell treatment
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Washing solution