MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test

Özet

Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), geniş bir çalışma aralığında düşük intra ve inter-assay hatası ile yüksek nicel, doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üreten endojen ve eksojen olarak uygulanan MeCP2 protein varyantlarının kantitatif tespiti için yeni bir yaklaşımdır. Burada, 96-iyi formatta MeCP2-ECLIA için protokol açıklanmıştır.

Özet

ECLIA, endojen ve rekombinant protein miktarlarını 96-iyi formatta ölçebilen çok yönlü bir yöntemdir. ECLIA verimliliğini göstermek için bu analiz, fare beyin dokusundaki MeCP2'nin içsel düzeylerini ve insan dermal fibroblastlarında TAT-MeCP2 alımını analiz etmek için kullanılmıştır. MeCP2-ECLIA, düşük intra ve inter-assay hatası ile son derece doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üretir. Özetle, yüksek iş itme ekranlarında kullanılabilen MeCP2 protein varyantlarının değerlendirilmesi için nicel bir yöntem geliştirdik.

Giriş

Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), elektrokimyasal olarak uyarıldığında lüminesans yayan etiketleri kullanan bir işleme dayanmaktadır. Bu temel sanayi ve akademik araştırma, gıda endüstrisi nin yanı sıra klinik tanı¹biyolojik analitlerin kantitatif tespiti için geniş bir uygulama tekniğidir. Genellikle karbon mürekkep elektrotlu tek kullanımlık 96 kuyuluk bir plaka kullanılır. Bu elektrotlar immünoassay için katı faz taşıyıcı olarak hareket. İkincil bir antikor elektromilüminesans etikete konjuge edilir ve sisteme elektrik uygulandığında kimyasal etiketin ışık salınımı tetiklenir. Ultra düşük gürültü şarj lı bir cihaz (CCD) ışık yoğunluğunu kaydeder ve bu durum, yakalama antikoruna bağlı antijenle doğru orantılıdır ve bu da numunenin hedeflenen analitinin sayısallaştırılmasıile sonuçlanır^2. Enzime bağlı immünosorbent çıktısı (ELISA) ile karşılaştırıldığında, ECLIA daha yüksek duyarlılık ve tekrarlanabilirlik yanı sıra daha iyi otomasyon ve^tutarlılık3 sunduğu için avantajlı olarak kabul edilir.

Burada insan ve mürin kökenli örneklerde metil-CpG bağlayıcı protein 2 (MeCP2) düzeyleri nin yanı sıra yeni geliştirilen ECLIA sistemini kullanarak rekombinant proteinin farklı varyantlarını analiz ettik. MecP2, metillenmiş DNA dizileri ile etkileşime girdiği bilinen X'e bağlı bir nükleik asit bağlayıcı proteindir. Bu protein gen ekspresyonunun düzenlenmesinde yer almıştır^4,5. Bu proteini kodlayan gendeki fonksiyon kaybı mutasyonları, ciddi bir nörogelişimsel bozukluk olan Rett sendromuna (RTT) neden olan başlıca suçlulardır⁶. Başka bir MeCP2 ile ilgili bozukluk, MECP2 çoğaltma sendromu, aynı zamanda RTT ile örtüşebilir nörolojik belirtilere yol açar⁷. Özellikle, erkekler çoğunlukla MECP2 çoğaltma sendromu^6,,⁷etkilenir ken özellikle, kadınlar çoğunlukla RTT etkilenir.

Bu bozukluklar merkezi sinir sisteminde (CNS) sırasıyla yetersiz veya fazla MeCP2 düzeyleri ile ilişkilidir. Bu nedenle, CNS artan MeCP2 düzeylerini içeren RTT için tedavi seçenekleri MeCP2⁷aşırı ile ilişkili zararlı etkileri önlemek gerekir. Bu nedenle, ECLIA sistemi tarafından sağlanan MeCP2 protein düzeylerinin son derece hassas ve doğru bir niceliği, RTT'nin ilerlemesi ve MECP2 tekrar sendromu araştırması için çok önemlidir. İnsan hücre hatları ve fare doku örneklerinden endojen ve eksojen MeCP2 düzeylerinin kesin ölçümleri ve insan MeCP2 izoform B 'den (izoform e1 olarak da bilinir) oluşan rekombinant protein ve kan-beyin bariyerini aşma potansiyeline sahip minimal N-terminal HIV-TAT transdüksiyon etki alanı (TAT-MeCP2) bu çalışmada^{8,sunulmuştur.}

Protokol

Araştırma amaçlı cilt biyopsisi alımı için onay Westmead, Avustralya Çocuk Hastanesi İnsan Araştırma Etik Komitesi'nden alındı. Hayvan deneyleri için onay, yerel hayvan refahı yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilen Avusturya Federal Bilim, Araştırma ve Ekonomi Bakanlığı'ndan alındı (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

NOT: ECLIA sisteminin prensibi Şekil 1'degösterilmiştir.

1. Antikor seçimi

1. Çeşitli MeCP2 antikorları bir dizi için sinyal-gürültü oranı değerlendirmek ve birincil fare monoklonal MeCP2 antikor kombinasyonu içinde en iyi sinyal gücü ve en yüksek özgüllük belirlemek (klon Mec-168) ve tavşan poliklonal MeCP2 algılama antikor (özel yapılmış). İkincil antikor için, aynı zamanda deneysel olarak doğrulanmış bir sisteme özgü antikor(Malzeme Tablosu)kullanın.
   NOT: Tablo 1, MeCP2-ECLIA gelişimi sırasında doğrulanmış tüm antikorların ve test edilmiş seyreltme aralıklarına genel bir bakış sunar.

Işlev	Adı	Klon	Seyreltme
Birincil	Fare, MeCP2 karşıtı	Mec-168	1:500−1:10.000
Birincil	Fare, MeCP2 karşıtı	4B6	1:250−1:4,000
Birincil	Fare, MeCP2 karşıtı	Erkekler-8	1:500−1:4,000
Birincil	Fare, MeCP2 karşıtı	1B11	1:500−1:4,000
Birincil	Tavşan, anti-MeCP2	D4F3	1:500−1:4,000
Ikincil	Tavşan, anti-MeCP2	Poliklonal	1:2.000−1:20.000
Ikincil	Tavşan, anti-MeCP2	Poliklonal	1:2.000−1:20.000
Algılama	SULFO-TAG anti-tavşan etiketli	Poliklonal	1:500−1:1.000

Tablo 1: Antikorlar ve kullanılan çalışma seyreltmeleri listesi.

2. Alternatif olarak, geleneksel ELISA ile iyi çalışan mecp2 antikorlarının her bir çiftini kullanın.

2. TAT-MeCP2 füzyon proteini ile HDF tedavisi

NOT: TAT-MeCP2, Escherichia coli ile rekombinant olarak ifade edilmiş ve daha önce^8'de açıklandığı gibi standart kromatografik teknikler kullanılarak saflaştırılmış ve -80 °C'de depolanmıştır.

1. Plaka 1 x 10⁶ insan dermal fibroblast (HDF) hücreleri 100 mm tabaklarda ve hücreleri bir gecede 37 °C'de %5 CO₂ ile %90 biraraya gelene kadar büyütür.
2. Bir şişe TAT-MeCP2 füzyon proteinini çıkar. Buz üzerinde çözülün ve yavaşça karıştırın.
3. TAT-MeCP2'yi 50 mL HDF kültür medyasında 500 nM'lik son konsantrasyona seyreltin.
4. Ortamı 100 mm'lik tabaklardan çıkarın ve hücreleri 37 °C'de 500 nM TAT-MeCP2 ile 24 saate kadar çeşitli kuluçka süreleri için kuluçkaya yatırın.
5. TAT-MeCP2 çözeltisini hücrelerden çıkarın. Hücreleri önceden ısıtılmış Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile 2 kat yıkayın.
6. Hücreleri 2 mL %0,05 tripsin-EDTA çözeltisi ile 37 °C^10'da5 dk tedavi edin.
7. Tripsini inaktive etmek ve hücreleri 15 mL tüplerde toplamak için 6 mL HDF kültür ortamı ekleyin.
8. Hücreyi 500 x g'da oda sıcaklığında 5 dk santrifüj ile peletleyin.
9. Supernatant çıkarın ve buz gibi DPBS ile hücreleri 2x yıkayın. Peleti buz üzerinde saklayın ve numune hazırlamaya devam edin.

3. Örnek hazırlama

1. HDF lysates
   1. Suzuki ve ark.^11'egöre sitoplazmik ve nükleer hücre altı bölmelerine subsellüler fraksiyonu için REAP yöntemini kullanarak MeCP2'nin en yüksek protein düzeylerini belirleyin. Kesirlendirmeyi deney başına en fazla altı örnekle sınırlandırın.
2. Fare beyin lysates
   1. Her hipotonik lisis reaktifi ve ekstraksiyon tamponunun 100 mL'sini hazırlayın.
      1. Hipotonik lisis reaktifi için 10 mM HEPES, 1,5 mM magnezyum klorür ve 10 mM potasyum klorür karıştırın.
      2. Ekstraksiyon tamponu için, iyi karıştırın 20 mM HEPES, 1.5 mM magnezyum klorür, 0.42 M sodyum klorür, 0.2 mM EDTA, ve 25% (v / v) gliserol.
      3. Her iki arabellekteki pH'ı 7,9 olarak ayarlayın.
      4. Her iki tampona da 1 mM dithiothreitol (DTT) ve 1x proteaz inhibitör kokteyli ekleyin. Kullanmadan önce buz üzerinde soğutun.
   2. Toplam fare beyninin 100 mg'ını askıya alın (zorlanma: C57BL/6J, yabani tip erkek ve dişi ve B6.129P2(C)-Mecp2^tm1.1Bird/J, hemizygous erkek ve heterozigot kadın; yaş: 4−8 haftalık) 1 mL buz gibi hipotonik lisis reaktifinde.
   3. Homogenizer A (gevşek, büyük açıklık için) ve B (sıkı, küçük açıklık için), sırasıyla 15 vuruş ile önceden soğutulmuş dounce tüm cam doku homogenizer ile beyni homojenize.
   4. Homojenize edilmiş hücreleri temiz bir tüpe ve 4 °C'de 20 dk için 10.000 x g'de santrifüje aktarın. Supernatant atın (veya daha fazla kullanım için sitoplazmatik fraksiyonu olarak tutun).
   5. 100 mg başlangıç malzemesi başına 140 μL çıkarma tamponu içinde peleti yeniden askıya alın. Tüpü önceden soğutulmuş bir termoblok içine yerleştirin ve 4 °C'de 30 dk hafifçe karıştırın.
   6. Tüpü 16.000 g'da 10 dakika 4 °C'de santrifüj edin. Supernatant'ı (yani nükleer fraksiyonu) yeni bir önceden soğutulmuş tüpe aktarın ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
      NOT: Fare beyni ve HDF'lerden elde edilen lysatların protein konsantrasyonu BCA protein teşbiile değerlendirilebilir.

4. MeCP2-ECLIA protokolü

1. Yıkama çözeltisinin hazırlanması, tampon ve artüytümün engellenmesi (gün 1)
   1. PBS çözeltisinde %0,05 Ara 20 hazırlamak için 500 ila 1 L PBS arasında 500 l'lik PBS ekleyin, şiddetle karıştırın ve "yıkama solüsyonu" olarak etiketlendirin.
      NOT: Sadece taze hazırlanmış yıkama tamponu kullanıldığından emin olun.
   2. Fosfat tamponlu salinde (PBS) %3 bloker A(Malzeme Tablosu)blokaj çözeltisi hazırlayın. Hafifçe karıştırarak karıştırın, sterilize filtre ve en fazla iki hafta boyunca kullanıma kadar buzdolabında saklayın.
   3. 10 mL PBS'ye 5 mL engelleme çözeltisi ekleyerek, atojen dilüent çözeltisi (PBS'de %1 bloker A) hazırlayın.
2. Yüksek bağlama plakalarının kaplaması
   1. 96-iyi çok dizili tek nokta yüksek bağlama plaka sı.
      NOT: Yüksek bağlama plakaları daha büyük bir bağlama kapasitesine ve dolayısıyla hidrofobik yüzeylere sahip standart plakalardan daha büyük bir dinamik aralıktadır.
   2. Monoklonal fare anti-MeCP2 antikorunu buz üzerinde eritin ve antikordan 0.67 μL'lik pbs (PBS'de 1:6.000 antikor seyreltme) ile karıştırın. Girdap iyi karıştırmak ve "kaplama çözeltisi" olarak tüp etiket antikor çözeltisi.
   3. Çok kanallı bir pipettor kullanarak her kuyunun alt köşesinde 25 μL kaplama çözeltisi dikkatlice dağıtın; buna çözelti kaplama yöntemi denir. Kaplama çözeltisinin her kuyunun altını kapladığından emin olmak için her iki taraftaki 96 kuyulu tablaya hafifçe dokunun.
   4. Plakayı yapışkan folyo ile kapatın ve tabağı buzdolabında gece leme (12−16 saat) 4 °C'de inküleyin.
3. Engelleme (gün 2)
   1. Buzdolabından tabağı çıkarın ve folyo çıkarın.
   2. Antikor kaplama çözeltisini atık sepetine basarak çıkarın ve kuyulardan tüm kaplama çözümlerini çıkarmak için plakayı kağıt havluya dokunun.
   3. Kuyu başına 125 μL engelleme çözeltisi ekleyin. Plakayı tekrar kapatın ve yörüngesel bir mikroplaka çalkalayıcısının üzerine yerleştirin.
   4. 800 rpm sürekli sallayarak oda sıcaklığında 90 dakika boyunca plaka kuluçka.
4. Standartların ve numunelerin hazırlıkları
   1. Kuluçka süresi boyunca MeCP2 ve/veya TAT-MeCP2 protein standartlarını ve çeşitli numuneleri hazırlayın.
      NOT: Standart seyreltme için kullanılan lysis tamponu, analiz edilen numunelerde kullanılanla aynı olmalıdır.
   2. Bir şişe MePC2 ve/veya TAT-MeCP2 protein stok çözeltisi (250 μg/mL), fare beyin lisatları ve -80 °C'den HDF lysates alın. Onları buzda erit.
   3. Standart stok çözeltisini (MeCP2 ve/veya TAT-MeCP2) temiz tüplerde Tablo 2'yegöre seyreltin.
   4. Örnekleri lysis tamponunda şu şekilde seyreltin: 25 μL lysis tamponu başına 1−20 μg fare beyni lysate ve 25 μL lysis tamponbaşına 0,25−1 g HDF lysate. Her numunenin yeterli hacimli hazırlayın triplicate analizi yürütmek için.

Standart	Konsantrasyon	Seyreltme
Standart 1	1.800 ng/mL	1.08 μL Standart stok çözeltisi + 148,92 μL Lysis tampon
Standart 2	600 ng/mL	50 μL Standart 1 + 100 μL Lysis tampon
Standart 3	200 ng/mL	50 μL Standart 2 + 100 μL Lysis tampon
Standart 4	66,67 ng/mL	50 μL Standart 3 + 100 μL Lysis tampon
Standart 5	22.22 ng/mL	50 μL Standart 4 + 100 μL Lysis tampon
Standart 6	7.41 ng/mL	50 μL Standart 5 + 100 μL Lysis tampon
Standart 7	2.47 ng/mL	50 μL Standart 6 + 100 μL Lysis tampon
Standart 8	0.82 ng/mL	50 μL Standart 7 + 100 μL Lysis tampon
Standart 9	0.27 ng/mL	50 μL Standart 8 + 100 μL Lysis tampon
Standart 10	0 ng/mL	150 μL Lysis tamponu

Tablo 2: Standart seri 0 ile 1.800 ng/mL arasındadır.

5. Numunelerin ve standart çözümlerin eklenmesi
   1. Atık sepetine basarak engelleme çözeltisini çıkarın ve kuyulardan tüm engelleme çözümlerini çıkarmak için plakayı kağıt havluya dokunun.
   2. Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak plakayı 3x 150 μL yıkama çözeltisi ile yıkayın.
   3. Tek bir kanallı pipet kullanarak kuyunun alt köşesine 25 ul standart ve numune ekleyin.
   4. Plakayı kapatın ve 800 rpm'de sürekli sallayarak oda sıcaklığında 4 saat boyunca plakayı kuluçkaya yatırın.
6. Etiketsiz algılama antikor
   1. Çok klonal tavşan anti-MeCP2 antikorbuz üzerinde eritin. Antikor 1:6,000'i tazyikli seyreltme çözeltisi.
   2. Atık sepetine basarak standartları ve numuneleri çıkarın ve plakayı kağıt havluya dokunun.
   3. Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak plakayı 3x 150 μL yıkama çözeltisi ile yıkayın.
   4. Çok kanallı pipettor ile her kuyuya 25 μL etiketsiz algılama antikorekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında 800 rpm'de sürekli sallayarak 1 saat kuluçkaya yatırın.
7. Spesifik konjuge antikor
   1. Buzdolabından belirli ikincil antikor(Malzeme Tablosu)alın ve buz üzerine yerleştirin. Antikor 1:666.67'yi tazyik seyreltme çözeltisinde seyreltin ve hafifçe karıştırın.
   2. Atık sepetine basarak ücretsiz etiketsiz ikincil antikor çıkarın ve bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun.
   3. Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak plakayı 3x 150 μL yıkama çözeltisi ile yıkayın.
   4. Çok kanallı pipettor ile her kuyuya 25°L spesifik konjuge antikor(Malzeme Tablosu)ekleyin. Oda sıcaklığında 800 rpm sürekli sallayarak 1 saat için plaka ve kuluçka mühür.
8. Plakayı okuma
   1. Ücretsiz konjuge antikor(Tablo Malzemeler)atık sepeti içine flicking ve bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun çıkarın.
   2. Plakayı 150 μL yıkama çözeltisi ile 3x yıkayın.
   3. 150 μL 1x Tris tabanlı Altın okuma tamponu ekleyin(Tablo Malzemeler)plaka ışık üretimi için bir co-reatoant olarak tripropylamin içeren sürfaktan ile. Ters pipetleme teknikleri kullanarak herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.
   4. Plakayı mikro plaka algılama platformuna(Malzeme Tablosu)yerleştirin ve hemen ölçüme başlayın. 96-iyi plaka edinimi için ayarları kullanın.
   5. Elektromilüminesans sinyallerini, yerleşik bir CCD kamera ile elektrokemilüminesans algılama sisteminde(Malzeme Tablosu)yakalayın ve göreceli ışık birimlerine (RLU) karşılık gelen ve ışığın yoğunluğuyla doğru orantılı olan sinyal sayılarını kaydedin.
      NOT: Elektrokimyasal stimülasyon üzerine karbon elektrota bağlanan rutenyum etiketi 620 nm'de parlak ışık yayır. Alet eşliğinde yazılım(Malzeme Tablosu)ile verileri analiz edin.

Sonuçlar

ECLIA sisteminin prensibi Şekil 1'deaçıklanmıştır. İki MeCP2 varyantı için standart eğriler Şekil 2'degösterilmiştir. Çok çeşitli konsantrasyonlarda (1−1.800 ng/mL) doğru niceleme mümkün oldu. Şekil 3'tefare beyni ve HDF'lerden elde edilen LYSAt'ların MeCP2 düzeyleri analiz edildi. Beyinde mecp2 ekspresyonu heterozigot, yabani tip ve nakavt farelerden karşılaştırıldı, Şekil

Tartışmalar

Endojen MeCP2, rekombinant MeCP2 ve TAT-MeCP2 düzeylerini ölçmek için 96 kuyulu bir eclia plaka geliştirilmiştir. Bu MeCP2 protein fonksiyonukaybı RTT sendromu yol açtığı gösterilmiştir⁶, hangi tedavi şu anda semptom yönetimi ve fizik tedavi ile sınırlıdır. Bir umut verici tedavi cadde sözde protein replasman tedavisi, MeCP2 düzeyleri kendi ihtiyaç duydukları konsantrasyon¹²kadar titrated olabilir^{12 ,13,}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad Laboratories Inc.	500-0006	Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit	Meso Scale Diagnostics	R32AB-1	Antibody
Discovery workbench 4.0	Meso Scale Discovery		Software
DMEM (1X)	gibco by Life Technologies	41966-029	Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Sample preperation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant	Meso Scale Diagnostics	R92TG	MeCP2 ECLIA protocol
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)	GFL	3014	MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)	Sigma-Aldrich	M2670	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)	Abnova Corporation	H00004204-P01	Cell treatment
Microseal B seal	Bio-Rad Laboratories Inc.	MSB1001	for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin	Sigma-Aldrich	M6818-100UL; RRID:AB_262075	Antibody, Coating solution
MSD Blocker A	Meso Scale Diagnostics	R93BA-4	Blocker
MSD SECTOR Imager 2400	Meso Scale Diagnostics	I30AA-0	MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate	Meso Scale Diagnostics	L15XB-3/L11BX-3	MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin	gibco by Life Technologies	15140122	Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit	Eurogentec S.A.	custom-designed	Antibody
Potassium chloride (KCl)	Merck KGaA	1049361000	Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)	Sigma-Aldrich	SAB1404063; RRID:AB_10737296	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)	Sigma-Aldrich	WH0004204M1; RRID:AB_1842411	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)	Sigma-Aldrich	M6818; RRID:AB_262075	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)	Sigma-Aldrich	M7443; RRID:AB_477235	Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)	Cell Signaling Technology	3456S; RRID:AB_2143849	Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Sigma-Aldrich	8340	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Eurogentec S.A.	custom	Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Merck	07-013	Antibody
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014	Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)	Meso Scale Diagnostics	W0015528S	Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein	in-house production		Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X)	gibco by Life Technologies	25200-056	Cell treatment
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Washing solution