العزلة، وTransfection، والثقافة طويلة الأجل من الماوس الكبار والجرذان Cardiomyocytes

Summary

هنا، نقدم بروتوكولاً للعزلة، وtransfection، والثقافة طويلة الأجل من الماوس الكبار والجرذان cardiomyocytes.

Abstract

السابقين فيفو ثقافة من الثدييات الكبار cardiomyocytes (CMs) يقدم النظام التجريبي الأكثر صلة للدراسة في المختبر من بيولوجيا القلب. إنّ تقانات الثدييات البالغة هي خلايا متمايزة بشكل نهائي ذات قدرة تكاثرية دنيا. لا تحد حالة ما بعد الميتكت من CMs الكبار من تقدم دورة خلايا القلب العضلي القلب فحسب، بل تحد أيضًا من ثقافة CMs الفعالة. وعلاوة على ذلك، فإن الثقافة الطويلة الأجل للبالغين من أجل إجراء دراسات كثيرة، مثل انتشار الـ CM وتحليل التعبير الجيني.

الفأر والفئران هما الأكثر تفضيلا الحيوانات المختبرية لاستخدامها في عزل cardiomyocyte. وفي حين أن الثقافة الطويلة الأجل لـ CMs الفئران ممكنة، فإن الماوس البالغ عرضة للموت ولا يمكن استزراعه أكثر من خمسة أيام في ظل الظروف العادية. ولذلك، هناك حاجة ماسة لتحسين عزل الخلية وبروتوكول الثقافة طويلة الأجل للبالغين مورين CMs. مع هذا البروتوكول المعدلة، فمن الممكن لعزل وثقافة كل من الماوس الكبار و CMs الفئران لأكثر من 20 يوما. وعلاوة على ذلك، فإن كفاءة نقل الـ(سيرنا) لـ CM المعزولة تزداد بشكل كبير مقارنة بالتقارير السابقة. لعزلة CM الماوس الكبار، يتم استخدام طريقة التحلل Langendorff مع حل انزيم الأمثل والوقت الكافي للتفكك المصفوفة خارج الخلية كاملة. من أجل الحصول على CMs البطين النقي ، تم تشريح كل من الأذينين والتخلص منه قبل الشروع في فصل وطلاء. وتفرقت الخلايا على لوحة مغلفة باللفين، مما سمح بتعلقها بكفاءة وسرعة. سُمح لـ CMs بتسوية 4-6 ساعات قبل نقل سيرنا. تم تحديث وسائل الإعلام الثقافة كل 24 ساعة لمدة 20 يوما، وبعد ذلك، تم إصلاح CMs وملطخة لعلامات القلب محددة مثل Troponin وعلامات دورة الخلية مثل KI67.

Introduction

أمراض القلب هي واحدة من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. تقريبا جميع أنواع الإصابة القلبية يؤدي إلى فقدان كبير من أمراض القلب الكبار (CMs). قلوب الثدييات الكبار غير قادرين على إصلاح إصابات القلب بسبب الطبيعة الشيخوخة لـ CM البالغ¹. وبالتالي، فإن أي إهانة للقلب الثديي البالغين يؤدي إلى فقدان دائم لـ CMs، مما يؤدي إلى انخفاض وظيفة القلب وفشل القلب. على عكس الثدييات الكبار، يمكن للحيوانات الصغيرة مثل حمار وحشي وقلوب نيوت تجديد إصابات القلب من خلال انتشار CM القائمة^2،3،4. ويجري بذل جهد عالمي لإيجاد تدخل علاجي جديد للإصابة بالقلب من خلال النهج التكاثرية وغير التكاثرية على حد سواء. في العقود الماضية، تم تطوير أنواع مختلفة من نماذج الماوس الجينية لدراسة إصابة القلب وإصلاح. ومع ذلك، فإن استخدام نماذج الحيوانات الحية في أن يكون نهجا مكلفا مع تعقيد إضافي لفك آلية الخلية المستقلة من الآثار الثانوية. إلى جانب ذلك، في نظم الجسم الحي هي صعبة لتحليل CM آثار محددة للتدخل الدوائية التي تحفز إشارات القلب من CM.

وعلاوة على ذلك، فإن الثقافة الطويلة الأجل للأجهزة الجماعية للبالغين ضرورية لإجراء تحليلات انتشار الأسلحة العنقودية. تتطلب فحوصات انتشار CM ما لا يقل عن 4-5 أيام حتى يتم تحريض الخلايا في دورة الخلية والحصول على بيانات دقيقة بعد ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الدراسات التي تستخدم CMs المعزولة للدراسات الفسيولوجية الكهربائية ، وفحص الأدوية ، ودراسات السمية ، ودراسات Ca⁺⁺ التوازن كلها في حاجة إلى نظام ثقافة محسن^5،6،7. وعلاوة على ذلك، تظهر الدراسات الحديثة أهمية القلبية من السيتوكينات يفرز من CMs (cardiokines)^8،9. من أجل التحقيق في الدور العلاجي والآلية الجزيئية لهذه القلب أثناء إصلاح القلب وتجديده ، هناك حاجة إلى ثقافة طويلة.

الكبار الجرذان CMs قوية بما فيه الكفاية لعزلة خلية واحدة والثقافة على المدى الطويل في نظام في المختبر^10،11،12. ومع ذلك ، فإن الماوس الكبار CMs هي ذات أهمية كبيرة في المختبرات ، وذلك بسبب توافر مجموعة متنوعة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا ، والذي يسمح لتصميم وتنفيذ مختلف التحليلات المبتكرة التي لا يمكن مع الفئران CM¹³. على النقيض من الكبار الجرذان CM العزلة ، فإنه من الصعب جدا الحصول على تعليق خلية واحدة من قلوب الماوس الكبار ، وثقافة طويلة الأجل من الكبار الماوس CMs في الثقافة هو أكثر تحديا.

الكبار CM العزلة من قلوب الفئران والماوس باستخدام نظام Langendorff سبق أن أنشئت لدراسة وظيفة CM^5،14،15. هنا، وصفنا بالتفصيل بروتوكولات لعزلة CM الكبار عن كل من الفئران والجرذان، فضلا عن الثقافة المعدلة على المدى الطويل، وتكاثر تكاثر CM للخلايا المعزولة.

Protocol

يجب أن يتم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية لدليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرها المعهد الوطني للصحة في الولايات المتحدة (NIH). وقد وافقت على جميع البروتوكولات المعروضة في الفيديو من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها (IACUC) في جامعة سينسيناتي، كلية الطب.

1. التحضير قبل استخراج القلب من الفئران البالغة (والجرذان)

1. إعداد الضخ المقابلة، والانزيم، وحلول وقف، وفقا لوصفات الواردة في الجدول 1 والجدول 2،لعزل الفئران والفأر، على التوالي. تصفية الحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة أي تلوث أو الجسيمات غير المُحلَّة.
2. تنظيف وتعقيم الأدوات الجراحية عن طريق نقعها في 70٪ الكحول لمدة 15 دقيقة، ثم يغسل بعد ذلك مع الماء المقطر مزدوجة. اترك الأدوات للهواء الجاف على منشفة ورقية نظيفة.
3. قبل تسخين حمام الماء إلى 37 درجة مئوية. تحقق من مستوى المياه في حمام الماء لضمان دوران المياه الدافئة دون انقطاع من خلال جهاز التسريب أثناء الإجراء.
4. تنظيف جهاز الضخ عن طريق تشغيل مع 70٪ الكحول لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: زيادة معدل التدفق، مما يساعد على تنظيف الأنابيب.
5. بعد تدفق الكحول من خلال، وتنظيف بقايا الكحول عن طريق تشغيل الماء المقطر مزدوجة لمدة 10 دقيقة.
6. إعداد 3 البوليسترين متوسطة الحجم يمكن التخلص منها وزنها أطباق لتنظيف القلب بعد الختان. ملء الأطباق مع 20 مل من المخزن المؤقت myocyte.
7. إضافة 2-3 قطرات من الهيبارين إلى كل طبق مع مساعدة من ماصة باستور ويخلط جيدا عن طريق الأنابيب عدة مرات.
8. خذ حقنة 10 مل مع قنية إبرة حادة.
   ملاحظة: يمكن تحضير قنية إبرة حادة بقطع طرف إبرة نظيفة ومعقمة. واستخدمت إبرة 21 G وإبرة 14 G لصنع القنية للفأر والجرذ، على التوالي.
9. ملء حقنة مع المخزن المؤقت perfusion(الجدول 1). إزالة أي فقاعات الهواء من الحقنة ووضعه في الطبق الثالث في موقف الزاوية. تأمينه مع الشريط.
   ملاحظة: بالنسبة للفئران، تم استخدام الحل A(الجدول 2)بدلاً من المخزن المؤقت للضخ.
10. إعداد عقدة فضفاضة مع خياطة الجراحية ووضعها حول الإبرة.
11. حقن الماوس مع الهيبارين (100 وحدة USP / الماوس) عن طريق الحقن داخل الصفاق، 20 دقيقة قبل حقن التخدير.
12. تعميم المخزن المؤقت الضخ(الجدول 1)من خلال جهاز الضخ. خفض معدل التدفق إلى 3 مل / دقيقة.
    ملاحظة: بالنسبة للفئران، تم استخدام الحل A(الجدول 2)بدلاً من المخزن المؤقت للضخ.
13. بعد 5 دقائق، استبدال المخزن المؤقت perfusion مع محلول انزيم(الجدول 1). تشبع محلول الإنزيم بالأكسجين أثناء العملية. استخدم معدل تدفق 3 مل/دقيقة.
    ملاحظة: بالنسبة لعزلة CM الجرذان، استخدم الحل E(الجدول 2)بدلاً من ذلك.
14. تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من التخدير. استخدم الجرعة المناسبة من التخدير، التي أوصت بها IACUC، لإجراء الجراحة النهائية.
15. تأكيد عمق كافية من التخدير من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع. ثم، وضع الماوس على منصة الجراحية.

2. استخراج القلب من الفئران البالغة (والجرذان)

1. تعقيم الجلد عن طريق مسح مع 70٪ من الكحول.
2. فتح بعناية الصدر.
3. اُكَسَر القلب تجنب الأنسجة غير القلبية أثناء الختان.
4. وضع القلب على الطبق الأول، مليئة عازلة perfusion(الجدول 1).
   ملاحظة: استخدم الحل A للفئران(الجدول 2).
5. مسح الدم من القلب عن طريق الضغط بلطف.
6. نقل القلب إلى الطبق الثاني.
7. تنظيف الدم من القلب وإزالة الأنسجة غير القلبية. في وقت لاحق، نقل القلب إلى الطبق الثالث.
8. تقليم قبالة الرئتين والأنسجة المحيطة الأخرى وقنينة عن طريق الشريان الأورطي التصاعدي. يجب تنفيذ هذا الإجراء بأسرع وقت ممكن (<5 دقيقة) لتحسين جودة CM وكميته.

3. هضم القلب

1. هضم قلب الفأر
   ملاحظة: يجب أن تكون جميع الحلول/ المخازن المؤقتة التي تدور من خلال قلب الماوس أكسجين طوال الإجراء.
   1. قم بإزالة الإبرة التكمع بعناية من الحقنة وتوصيلها بجهاز قذف Langendorff.
   2. تجنب أي فقاعات الهواء الخوض في القلب، والتي قد تؤثر على تدفق من خلال محلول الانزيم والهضم.
   3. حرك سترة الماء لأعلى لتوفير بيئة متجانسة للقلب. السماح لمحلول انزيم للتدفق من خلال القلب بسرعة 2-3 مل / دقيقة.
      ملاحظة: سرعة تمرير الحل أمر بالغ الأهمية ولها تأثير كبير على نتائج CM الكمية والنوعية.
   4. دع محلول الإنزيم يتدفق عبر القلب لمدة 2 دقيقة.
   5. في 2 دقيقة، إضافة 40 ميكرولتر من 100 μM CaCl₂ حل لمحلول انزيم ومزيج. السماح لمحلول انزيم تمر عبر القلب لآخر 10-15 دقيقة.
      ملاحظة: بمجرد أن يصبح التدفق سلسًا ، يصبح القلب بنيًا وناعمًا ، مما يشير إلى التوزيع المتعادل لأنزيم الكولاجين والهضم السليم للقلب.
2. هضم قلب الفئران
   ملاحظة: يجب أن تكون جميع الحلول / المخازن المؤقتة التي تدور من خلال قلب الفئران أكسجين طوال العملية.
   1. قم بإزالة الإبرة التكمع بعناية من الحقنة وتوصيلها بجهاز قذف Langendorff.
   2. تجنب أي فقاعات الهواء الخوض في القلب، والتي قد تؤثر على تدفق من خلال محلول الانزيم والهضم.
   3. حرك سترة الماء لأعلى لتوفير بيئة متجانسة للقلب.
   4. بدء تدفق الحل A بسرعة 2-3 مل / دقيقة لمدة 3-5 دقائق لإزالة أي دم من القلب.
      ملاحظة: سرعة تمرير الحل أمر بالغ الأهمية ولها تأثير كبير على نتيجة جودة CM.
   5. بمجرد تطهير الدم من القلب، والتحول من الحل A إلى الحل E(الجدول 2). Titrate الحل E مع CaCl₂ كما هو مبين أدناه لتركيز النهائي من 0.1 mM في الحل:
      1. بعد 10 دقيقة من الضخ، إضافة 12.5 ميكرولتر من 0.1 م CaCl₂.
      2. بعد 15 دقيقة من الضخ، إضافة 25 ميكرولتر من 0.1 م CaCl₂.
   6. السماح لمحلول انزيم تمر عبر القلب لمدة 30-40 دقيقة أخرى، حتى يصبح تدفق سريع والقلب هو مرنة.

4. إعداد CM تعليق وحيد الخلية

1. إعداد التعليق أحادي الخلية CM (الماوس)
   1. إزالة القلب من نظام الضخ Langendorff. نقله إلى طبق بيتري 60 مم مليئة 5 مل من محلول انزيم ونقل الطبق إلى غطاء محرك السيارة السلامة الأحيائية.
      ملاحظة: ضمان هضم القلب كافية قبل إزالة القلب من نظام الضخ Langendorff. يعتمد وقت الهضم على نشاط الإنزيم وتدفق المحلّل وحجم القلب.
   2. إجراء أي مزيد من التفصيل الميكانيكية في غطاء غطاء السلامة البيولوجية لضمان العقم وتجنب التلوث.
   3. إزالة بعناية الأذين (1/4^th من الجزء القاعدي القلب) والأنسجة الدهنية الزائدة.
   4. اِنقط القلب بالملقط إلى قطع دقيقة
   5. خذ ماصة باستور العقيمة وقطع طرفها بزاوية 45º.
   6. استخدام هذه الماصات باستور للاستغناء عن أنسجة القلب في تعليق خلية واحدة عن طريق الأنابيب لطيف. الهضم الأمثل يوفر تعليق من خلايا القلب وحيدة الخلية.
      ملاحظة: إزالة ضيق، الجزء السفلي من الأنابيب نقل للحد من الضرر CM بسبب البح الميكانيكية.
   7. ثم، إضافة 5 مل من وقف الحل لوقف نشاط الانزيم، الذي يتجنب إمكانية عسر الهضم المفرط.
   8. اتخاذ جديدة 50 مل مخروطية ووضع مصفاة 100 ميكرومتر خلية معقمة على ذلك.
   9. تمرير تعليق cardiomyocyte من خلال مصفاة الخلية لإزالة قطعة الأنسجة. غسل طبق بيتري ومصفاة مع آخر 5 مل من حل وقف(الجدول 1) لجمع أي cardiomyocytes التي لا تزال تعلق على مصفاة.
2. إعداد التعليق أحادي الخلية CM (الجرذان)
   1. إزالة القلب من نظام الضخ Langendorff. نقل القلب إلى طبق بيتري 100 مم مليئة 5 مل من الحل A ونقل الطبق إلى غطاء محرك السيارة السلامة الأحيائية.
      ملاحظة: ضمان هضم القلب كافية قبل إزالة القلب من نظام الضخ Langendorff. يعتمد وقت الهضم على نشاط الإنزيم وتدفق المحلّل وحجم القلب.
   2. إجراء أي مزيد من التفصيل الميكانيكية في غطاء غطاء السلامة البيولوجية لضمان العقم وتجنب التلوث.
   3. إزالة بعناية الأذين (1/4th من الجزء القاعدي القلب) والأنسجة الدهنية الزائدة.
   4. اِنقط القلب بالملقط إلى قطع دقيقة
   5. خذ ماصة باستور العقيمة وقطع طرفها بزاوية 45º.
   6. استخدام هذه الماصات باستور للاستغناء عن أنسجة القلب في تعليق خلية واحدة عن طريق الأنابيب لطيف. الهضم الأمثل يوفر تعليق من خلايا القلب وحيدة الخلية.
      ملاحظة: إزالة ضيق، الجزء السفلي من الأنابيب نقل للحد من الضرر CM بسبب البح الميكانيكية.
   7. إضافة 5 مل من الحل ب(الجدول 2)إلى التعليق CM وتمرير الحل من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر لإزالة أي قطع المتبقية من الدهون أو الأنسجة الأخرى غير هضم.
   8. جمع الترشيح في قارورة مخروطية 50 مل جديدة.
   9. استخدام آخر 5 مل من الحل باء لغسل طبق بيتري وأي CM المتبقية من خلال مصفاة الخلية.

5- إزالة غير الـ CMs

1. إزالة غير CMs من تعليق خلية واحدة للبالغين (الماوس)
   1. الطرد المركزي تعليق الخلية في 20 × ز لمدة 3 دقائق.
   2. تجاهل عظمى و resuspend الخلايا في 10 مل من وقف الحل (الجدول 1).
      ملاحظة: زيادة تركيز BSA في محلول التوقف سيزيد من لزوجته ويقلل من معدل الترسيب من غير CMs.
   3. resuspend CMs عن طريق عكس لطيف من الأنبوب 3-5 مرات.
   4. في 3 دقائق، إضافة 10 ميكرولتر من 100 μM CaCl₂ الحل ومزيج. كرر ثلاث مرات.
   5. بعد الإضافة الرابعة، الطرد المركزي تعليق cardiomyocyte في 20 × ز لمدة 3 دقائق.
   6. تجاهل المُندفع.
   7. Resuspend CMs في درجة حرارة مسبقة (37 درجة مئوية)، ماوس بالغ 2000 سم تصفيح الوسائط (الجدول 3).
2. إزالة غير CMs من تعليق خلية واحدة للبالغين (فئران)
   1. خلايا بيليه في 20 × ز لمدة 3 دقائق في 25 درجة مئوية.
   2. تجاهل افرا و resuspend الخلايا في 25 مل من الحل باء(الجدول 2).
   3. اخلط الخلايا عن طريق انعكاس لطيف ووضعها في موقف أنبوب للسماح لـ CM بالاستقرار تحت الجاذبية.
   4. تجاهل بعناية فائقة.
   5. Resuspend الخلايا في 25 مل جديدة من الحل B و titrate ذلك إلى 1.0 mM CaCl₂ بإضافة خطوة من 50 ميكرولتر، 75 ميكرولتر، و 100 ميكرولتر من 0.1 MCl₂ في 3-5 دقائق.
      ملاحظة: يمكن استخدام تركيز أعلى من BSA في الحل B في هذه الخطوة. وزيادة تركيز الـ BSA في الحل باء يزيد من اللزوجة وبالتالي، يقلل من معدل الترسيب في غير CMs.
   6. بيليه الخلايا في 20 × ز لمدة 3 دقائق في 25 درجة مئوية، وpirate supernatant، وإضافة الحجم المطلوب من الكبار خلية الفئران وسائل الإعلام ثقافة(الجدول 4).
   7. بذور CMs على لوحة مغلفة لامينين.
      ملاحظة: يمكن استخدام الطلاء المسبق لـ CMs على لوحة استزراع غير مغلفة لتقليل تلوث الخلايا غير CM.

6. الكبار CM الطلاء

1. قبل الطلاء
   1. إعادة تعليق عضلة القلب في وسائل الإعلام الثقافة.
   2. قبل لوحة الخلايا في طبق 60 مم أو 100 ملم للفأر أو الفئران CM، على التوالي.
   3. احتضان CMs لمدة 2 ساعة في ح ح مع 5٪ CO₂ في 37 ºC.
   4. أثناء الحضانة قبل لوحة، معطف لوحات ثقافة الخلية مع laminin (10 ميكروغرام / مل في PBS) لثقافة CM على المدى الطويل.
2. بعد 2 ساعة من الطلاء المسبق، وجمع CMs في 50 مل قارورة مخروطية.
3. جمع الخلايا من الطبق وإعادة لوحة لهم في laminin المغلفة 24 لوحة ثقافة جيدا لتجارب transfection.
4. الخلايا الثقافية في حاضنة في 37 درجة مئوية تكملها بنسبة 5٪ مع CO₂. 4-6 ساعات كافية للتمسك cardiomyocytes مع السطح، وبالتالي، يمكن تنفيذ transfection 6 ساعات بعد الطلاء.
   ملاحظة: تستخدم عادةً الوسيلة التي تحتوي على FBS، وهي تظهر توافقًا أفضل مع دراسات الانتشار. ومع ذلك، يمكن استخدام وسيط خال من المصل للتجارب حيث يتم تحليل العوامل السرية.

7. نقل

1. احتضان CMs إلى لوحات ثقافة الخلية المغلفة مع اللامينيين لمدة 4-6 ساعات.
2. أربع ساعات بعد البذر CM على لوحة المغلفة laminin، الخلايا transfect مع siRNAs (50 nM) من الفائدة باستخدام مُكْشف transfection (على سبيل المثال، RNAiMAX RNAiMAX الدهنية) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
3. تغيير الوسائط 24 ساعة بعد عملية نقل و 24 ساعة بعد ذلك لمدة تصل إلى 20 يومًا.
4. بعد 20 يوما، وإصلاح الخلايا مع 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني لتطبيقات المصب، بما في ذلك الكيمياء المناعية لعلامات القلب محددة مثل تروبونين لضمان أمراض القلب الحية كانت مستزرعة بنجاح على المدى الطويل.

النتائج

البروتوكول المعدل الحالي يسمح العزلة الفعالة وثقافة الفئران والفئران CMs في المختبر. لعزل الفئران CM، ما مجموعه 3 الكبار (12 أسبوعا) ذكر فيشر 344 الفئران استخدمت في هذا الإجراء. ويبين الشكل 1 الجهاز الجراحي والاجهزة العزلة المطلوبة في العملية؛ وقد تم وضع علامة على كل جزء ووصفها ?...

Discussion

هناك حاجة ماسة إلى إنشاء بروتوكول لعزلة القلب و الثقافة طويلة الأجل لإجراء دراسات ميكانيكية خاصة بالخلايا. هناك فقط عدد قليل من التقارير التي تناقش الكبار CM بروتوكولات العزل، وتستخدم أقل منهم حتى لثقافة طويلة الأجل من الفئران الكبار CM^{15،16،17...}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butane Dione monoxime	Sigma-Aldrich	B-0753
Blebbistatin	APExBIO	B1387
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709
Cell culture plate	Corning Costar	3526
Cell strainer	BD Biosciences	352360
Cel-miR-67	Dharmacon	CN-001000-01-50
Collagenase type2	Worthington	LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes	Sigma-Aldrich	Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Thermo Scientific	SH30022.01
EdU	Life Technologies	C10337
Fetal bovine serum	Corning	35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps	Fisherbrand	22-327379
Glucose	Sigma-Aldrich	G-5400
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	PSLAB-018285-02
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-128
Hyaluronidase	Sigma	H3506
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P-8281
KCl	Sigma-Aldrich	746436
Light Microscope	Nikon
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778-150
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-2643
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
Natural Mouse Laminin	Invitrogen	23017-015
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Pentobarbital	Henry Schein	24352
Phosphate buffered saline	Life Technologies	20012-027
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147-1G
Selenium	Sigma-Aldrich	229865+5G
siMeis2	Dharmacon	s161030
siRb1	Dharmacon	s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors	Fisher Scientific	28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-120
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor	Fisherbrand	22-079-747
Water Bath	Fisher Scientific	3006S