Aislamiento, Transfección y Cultura a Largo Plazo de Cardiomiocitos adultos de ratón y rata

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento, la transfección y el cultivo a largo plazo de los cardiomiocitos adultos de ratón y rata.

Resumen

El cultivo ex vivo de los cardiomiocitos de mamíferos adultos (CM) presenta el sistema experimental más relevante para el estudio in vitro de biología cardíaca. Los CM de mamíferos adultos son células diferenciadas terminalmente con una capacidad proliferativa mínima. El estado postmitético de los CM adultos no sólo restringe la progresión del ciclo celular de cardiomiocitos, sino que también limita el cultivo eficiente de los CM. Además, la cultura a largo plazo de los CM adultos es necesaria para muchos estudios, como la proliferación de CM y el análisis de la expresión génica.

El ratón y la rata son los dos animales de laboratorio preferidos para el aislamiento de cardiomiocitos. Si bien la cultura a largo plazo de los CM de rata es posible, los CM de ratón adultos son susceptibles a la muerte y no pueden ser cultivados más de cinco días en condiciones normales. Por lo tanto, hay una necesidad crítica de optimizar el aislamiento celular y el protocolo de cultivo a largo plazo para los CM murine adultos. Con este protocolo modificado, es posible aislar y cultivar con éxito tanto los CM adultos de ratón como de rata durante más de 20 días. Además, la eficiencia de la transfección de siRNA de CM aislada aumenta significativamente en comparación con los informes anteriores. Para el aislamiento CM de ratón adulto, el método de perfusión Langendorff se utiliza con una solución enzimática óptima y tiempo suficiente para la disociación completa de la matriz extracelular. Con el fin de obtener CM ventriculares puras, ambas aurículas fueron diseccionadas y descartadas antes de proceder con la disociación y ensuciamiento. Las células se dispersaron en una placa recubierta de laminina, lo que permitió una fijación eficiente y rápida. Se permitió que los CM se conforman con 4-6 h antes de la transfección del SIRNA. Los medios de cultivo se actualizaron cada 24 horas durante 20 días, y posteriormente, los CM se fijaron y se tiñeron para marcadores específicos de los cardiacos como troponina y marcadores del ciclo celular como KI67.

Introducción

Las enfermedades cardíacas son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Casi todos los tipos de lesiones cardíacas resultan en una pérdida significativa de cardiomiocitos adultos (CM). Los corazones de mamíferos adultos son incapaces de reparar su lesión cardíaca debido a la naturaleza senescente del CM¹adulto. Por lo tanto, cualquier insulto al corazón adulto de los mamíferos resulta en una pérdida permanente de CM, lo que conduce a una reducción de la función cardíaca y la insuficiencia cardíaca. A diferencia de los mamíferos adultos, los animales pequeños como el pez cebra y los corazones newt pueden regenerar su lesión cardíaca a través de la proliferación CM existente^2,,3,,4. Se está llevando a cabo un esfuerzo mundial para encontrar una nueva intervención terapéutica para lesiones cardíacas a través de enfoques proliferativos y no proliferativos. En las últimas décadas, se han desarrollado varios tipos de modelos genéticos de ratón para estudiar lesiones cardíacas y reparación. Sin embargo, el uso de modelos animales in vivo sigue siendo un enfoque costoso con la complejidad adicional para descifrar un mecanismo autónomo celular de los efectos secundarios. Además, los sistemas in vivo son difíciles de analizar los efectos específicos de CM de una intervención farmacológica que induce la señalización cardioprotectora de la CM.

Además, la cultura a largo plazo de los CM adultos es necesaria para realizar análisis de proliferación de CM. Los ensayos de proliferación de CM requieren un mínimo de 4-5 días para que las células se induzcan en el ciclo celular y obtengan datos precisos después de eso. Además, los estudios que utilizan CM aislados para estudios electrofisiológicos, cribado de fármacos, estudios de toxicidad y estudios de homeostasis Ca⁺⁺ necesitan un sistema de cultivo mejorado^5,,6,,7. Además, estudios recientes muestran la importancia cardioprotectora de las citoquinas secretadas de los CM (cardioquinas)^8,9. Con el fin de investigar el papel terapéutico y el mecanismo molecular de estas cardioquinas durante la reparación y regeneración del corazón, se requiere un cultivo prolongado.

Los CM de ratas adultos son lo suficientemente robustos para el aislamiento de una sola célula y el cultivo a largo plazo en un sistema in vitro^10,11,12. Sin embargo, los CM de ratón para adultos son de gran interés para los ensayos in vitro, debido a la disponibilidad de una variedad de modelos de ratón modificados genéticamente, lo que permite el diseño y ejecución de diversos análisis innovadores que no son posibles con la rata CM^13. En contraste con el aislamiento CM de rata adulta, es bastante difícil obtener una suspensión de una sola célula de corazones de ratón adultos, y el cultivo a largo plazo de los CM de ratón adultos en el cultivo es aún más difícil.

El aislamiento CM adulto de los corazones de ratón y rata utilizando un sistema Langendorff se ha establecido previamente para estudiar la función CM^5,14,15. Aquí, hemos descrito en detalle los protocolos para el aislamiento CM adulto de ratas y ratones, así como un cultivo modificado a largo plazo, transfección y proliferación CM de células aisladas.

Protocolo

Todos los experimentos deben realizarse de acuerdo con las directrices de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (NIH). Todos los protocolos mostrados en el video fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Cincinnati, Facultad de Medicina.

1. Preparación antes de la extracción cardíaca de ratones adultos (y ratas)

1. Preparar las soluciones de perfusión, enzima y parada correspondientes, de acuerdo con las recetas indicadas en la Tabla 1 y la Tabla 2,para el aislamiento de ratas y ratón, respectivamente. Filtrar las soluciones a través de un filtro de 0,22 m para eliminar cualquier contaminación o partículas no disueltos.
2. Limpiar y esterilizar los instrumentos quirúrgicos remojando en 70% de alcohol durante 15 min, y posteriormente lavar con agua destilada doble. Deje que las herramientas se sequen al aire sobre una toalla de papel limpia.
3. Precalentar el baño de agua a 37 oC. Compruebe el nivel de agua en el baño de agua para asegurar una circulación ininterrumpida de agua tibia a través del aparato de perfusión durante el procedimiento.
4. Limpie el aparato de perfusión corriendo con un 70% de alcohol durante 5 min. Repita.
   NOTA: Aumente el caudal, lo que ayuda a limpiar el tubo.
5. Después del flujo de alcohol, limpie los restos de alcohol corriendo doble agua destilada durante 10 min.
6. Configure 3 platos desechables de peso de poliestireno desechables de tamaño mediano para limpiar el corazón después de la escisión. Llene los platos con 20 ml de tampón de miocitos.
7. Añadir 2-3 gotas de heparina a cada plato con la ayuda de la pipeta Pasteur y mezclar bien pipeteando varias veces.
8. Tome una jeringa de 10 ml con una cánula de aguja contundente.
   NOTA: Se puede preparar una cánula de aguja contundente cortando la punta de una aguja limpia y estéril. Se utilizaron una aguja de 21 G y una aguja de 14 G para hacer la cánula para el ratón y la rata, respectivamente.
9. Llene la jeringa con tampón de perfusión (Tabla 1). Retire las burbujas de aire de la jeringa y colóquela en el tercer plato en una posición en ángulo. Asegúrelo con cinta adhesiva.
   NOTA: Para ratas, se utilizó la Solución A (Tabla 2) en lugar del tampón de perfusión de miocitos.
10. Prepare un nudo suelto con una sutura quirúrgica y colóquelo alrededor de la aguja.
11. Inyectar el ratón con heparina (100 unidades USP/ratón) mediante inyección intraperitoneal, 20 min antes de la inyección de anestesia.
12. Circule el tampón de perfusión de miocitos(Tabla 1) a través del aparato de perfusión. Disminuya el caudal a 3 ml/min.
    NOTA: Para ratas, se utilizó la Solución A (Tabla 2) en lugar del tampón de perfusión de miocitos.
13. Después de 5 min, sustituya el tampón de perfusión por la solución enzimática(Tabla 1). Saturar la solución enzimática con oxígeno durante el proceso. Utilice un caudal de 3 ml/min.
    NOTA: Para el aislamiento de LA RATA CM, utilice la solución E (Tabla 2) en su lugar.
14. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de anestesia. Utilice la dosis adecuada de anestesia, recomendada por el IACUC, para la cirugía terminal.
15. Confirme la profundidad suficiente de la anestesia por la falta de respuesta a un pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo. A continuación, coloque el ratón en la plataforma quirúrgica.

2. Extracción del corazón de ratones adultos (y ratas)

1. Esterilice la piel limpiando con 70% de alcohol.
2. Abra cuidadosamente el pecho.
3. Excós del corazón. Evite los tejidos no cardíacos durante la escisión.
4. Poner el corazón en el primer plato, lleno de tampón de perfusión (Tabla 1).
   NOTA: Utilice la solución A para la rata (Tabla 2).
5. Limpie la sangre del corazón apretando suavemente.
6. Transfiera el corazón al segundo plato.
7. Limpie la sangre del corazón y extraiga los tejidos no cardíacos. Posteriormente, transfiera el corazón al tercer plato.
8. Recortar los pulmones y otros tejidos circundantes y cannular a través de la aorta ascendente. Este procedimiento debe realizarse lo más rápido posible (<5 min) para mejorar la calidad y la cantidad de CM.

3. Digestión del corazón

1. Digestión del corazón del ratón
   NOTA: Todas las soluciones/buffers que circulan a través del corazón del ratón deben ser oxigenados durante todo el procedimiento.
   1. Retire con cuidado la aguja cánula de la jeringa y conéctela al aparato de perfusión de Langendorff.
   2. Evite cualquier burbuja de aire que entre en el corazón, lo que puede afectar el flujo a través de la solución enzimática y la digestión.
   3. Mueva la chaqueta de agua hacia arriba para proporcionar un ambiente homogéneo al corazón. Permita que la solución enzimática fluya a través del corazón a una velocidad de 2-3 ml/min.
      NOTA: La velocidad de la solución que pasa es crítica y tiene un impacto significativo en el resultado de la cantidad y la calidad de CM.
   4. Deje que la solución enzimática fluya a través del corazón durante 2 minutos.
   5. A 2 min, añadir 40 l de 100 m de solución de CaCl₂ a la solución enzimática y mezclar. Deje que la solución enzimática pase a través del corazón durante otros 10-15 min.
      NOTA: Una vez que el flujo se vuelve suave, el corazón se vuelve marrón y suave, lo que indica la distribución uniforme de la enzima colagenasa y la digestión adecuada del corazón.
2. Digestión del corazón de la rata
   NOTA: Todas las soluciones/buffers que circulen a través del corazón de la rata deben ser oxigenados durante todo el procedimiento.
   1. Retire con cuidado la aguja cánula de la jeringa y conéctela al aparato de perfusión de Langendorff.
   2. Evite cualquier burbuja de aire que entre en el corazón, lo que puede afectar el flujo a través de la solución enzimática y la digestión.
   3. Mueva la chaqueta de agua hacia arriba para proporcionar un ambiente homogéneo al corazón.
   4. Iniciar el flujo de la solución A a una velocidad de 2-3 mL/min durante 3-5 min para eliminar cualquier sangre del corazón.
      NOTA: La velocidad de la solución de paso es crítica y tiene un impacto significativo en el resultado de la calidad CM.
   5. Una vez que la sangre se despeje del corazón, cambie de la solución A a la solución E (Tabla 2). Valorar la solución E con CaCl₂ como se indica a continuación para una concentración final de 0,1 mM en solución:
      1. Después de 10 min de perfusión, añadir 12,5 l de 0,1 M CaCl₂.
      2. Después de 15 min de perfusión, añadir 25 l de 0,1 M CaCl₂.
   6. Deje que la solución enzimática pase a través del corazón durante otros 30-40 minutos, hasta que el flujo se vuelva rápido y el corazón sea flexible.

4. Preparación de la suspensión de una sola célula CM

1. Preparación de la suspensión de una sola célula CM (ratón)
   1. Retire el corazón del sistema de perfusión Langendorff. Muévelo a un plato Petri de 60 mm lleno de 5 ml de solución enzimática y transfila el plato a una capucha de bioseguridad.
      NOTA: Asegúrese de una suficiente digestión cardíaca antes de extraer el corazón del sistema de perfusión Langendorff. El tiempo de digestión depende de la actividad enzimática, el flujo de solución y el tamaño del corazón.
   2. Realice cualquier desagregación mecánica adicional en una campana de bioseguridad para garantizar la esterilidad y evitar la contaminación.
   3. Retire cuidadosamente las aurículas^th (1/4 de la porción basal del corazón) y los tejidos extra grasos.
   4. Picar el corazón con fórceps en trozos finos.
   5. Tome una pipeta Pasteur estéril y corte su punta en un ángulo de 45o.
   6. Utilice esta pipeta Pasteur para dispensar el tejido cardíaco en una suspensión de una sola célula por pipeteo suave. La digestión óptima proporciona una suspensión de cardiomiocitos de una sola célula.
      NOTA: Retire la parte inferior estrecha de la tubería de transferencia para reducir el daño de CM debido al sellado mecánico.
   7. A continuación, añadir 5 ml de solución de parada para detener la actividad enzimática, lo que evita la posibilidad de sobredigestión.
   8. Tome un cónico fresco de 50 ml y coloque un colador celular estéril de 100 m sobre él.
   9. Pasar la suspensión del cardiomiocitos a través del colador celular para eliminar el trozo de tejido. Lavar el plato y el colador de Petri con otros 5 ml de solución de parada (Tabla 1) para recoger los cardiomiocitos que permanezcan unidos al colador.
2. Preparación de la suspensión de una sola célula CM (rata)
   1. Retire el corazón del sistema de perfusión Langendorff. Mueva el corazón a un plato Petri de 100 mm lleno de 5 ml de solución A y mueva el plato a una capucha de bioseguridad.
      NOTA: Asegúrese de una suficiente digestión cardíaca antes de extraer el corazón del sistema de perfusión Langendorff. El tiempo de digestión depende de la actividad enzimática, el flujo de solución y el tamaño del corazón.
   2. Realice cualquier desagregación mecánica adicional en una campana de bioseguridad para garantizar la esterilidad y evitar la contaminación.
   3. Retire cuidadosamente las aurículas (1/4 de la porción basal del corazón) y los tejidos extra grasos.
   4. Picar el corazón con fórceps en trozos finos.
   5. Tome una pipeta Pasteur estéril y corte su punta en un ángulo de 45o.
   6. Utilice esta pipeta Pasteur para dispensar el tejido cardíaco en suspensión de una sola célula mediante pipeteo suave. La digestión óptima proporciona una suspensión de cardiomiocitos de una sola célula.
      NOTA: Retire la parte inferior estrecha de la tubería de transferencia para reducir el daño de CM debido al sellado mecánico.
   7. Añadir 5 ml de solución B(Tabla 2) a la suspensión CM y pasar la solución a través de un colador celular de 100 m para eliminar cualquier trozo restante de grasa u otro tejido no digerido.
   8. Recoger el filtrado en un vial cónico fresco de 50 ml.
   9. Utilice otros 5 ml de solución B para lavar el plato De Petri y cualquier CM restante a través del colador celular.

5. Eliminación de los no MC

1. Eliminación de los no MC de la suspensión adulta de una sola célula (ratón)
   1. Centrifugar la suspensión celular a 20 x g durante 3 min.
   2. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de solución de parada (Tabla 1).
      NOTA: El aumento de la concentración de BSA en la solución de parada aumentará su viscosidad y reducirá la tasa de sedimentación de los no MC.
   3. Resuspender los CM por inversión suave del tubo 3-5 veces.
   4. A intervalos de 3 min, agregue 10 l de 100 m de solución de CaCl₂ y mezcle. Repite tres veces.
   5. Después de la cuarta adición, centrifugar la suspensión de cardiomiocitos a 20 x g durante 3 min.
   6. Deseche el sobrenadante.
   7. Resuspend CM en precalegado (37 oC), medios de revestimiento CM de ratón para adultos (Tabla 3).
2. Eliminación de los no MC de las suspensiones adultas de una sola célula (rata)
   1. Células de pellets a 20 x g durante 3 min a 25 oC.
   2. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 25 ml de la solución B (Tabla 2).
   3. Mezcle las células por inversión suave y colóquelas en un soporte de tubo para permitir que el CM se asiente bajo la gravedad.
   4. Deseche cuidadosamente el sobrenadante.
   5. Resuspender las células en 25 ml frescos de la solución B y valorarlas a 1,0 mM de CaCl_{2 mediante} la adición escalonada de 50 l, 75 l y 100 l de 0,1 M de CaCl₂ a intervalos de 3-5 min.
      NOTA: Se podría utilizar una mayor concentración de BSA en la solución B en este paso. El aumento de la concentración de BSA en la solución B aumenta la viscosidad y, por lo tanto, reduce la tasa de sedimentación de los no MC.
   6. Células de pellets a 20 x g durante 3 min a 25 oC, aspirar el sobrenadante, y añadir el volumen deseado de medios de cultivo de células de ratas adultas (Tabla 4).
   7. CMs de semillas en una placa recubierta de laminina.
      NOTA: El recubrimiento previo de los CM en una placa de cultivo no recubierta se puede utilizar para minimizar la contaminación de las células no CM.

6. Revestimiento CM para adultos

1. Pre-plating
   1. Resuspender a los cardiomiocitos en medios de cultivo.
   2. Pre-placar las células en un plato de 60 mm o 100 mm para ratón o rata CM, respectivamente.
   3. Incubar los CM durante 2 h en una incubadora suplementada con 5% de CO₂ a 37 oC.
   4. Durante la incubación previa a la placa, recubre las placas de cultivo celular con laminina (10 g/ml en PBS) para el cultivo de CM a largo plazo.
2. Después de 2 horas de pre-enchapar, recoger los CM en un vial cónico de 50 ml.
3. Recoger las células del plato y volver a plancharlas en una placa de cultivo de 24 pozos recubierto de laminina para experimentos de transfección.
4. Células de cultivo en una incubadora a 37 oC complementadas con 5% con CO_2. 4-6 horas es suficiente para adherirse a los cardiomiocitos con la superficie, y por lo tanto, la transfección se puede realizar 6 horas después del blindaje.
   NOTA: El medio de chapado que contiene FBS se utiliza comúnmente y muestra una mejor compatibilidad con los estudios de proliferación. Sin embargo, un medio libre de suero se puede utilizar para experimentos en los que se están analizando factores secretores.

7. Transfección

1. Incubar los CM a las placas de cultivo celular recubiertas con laminina durante 4-6 horas.
2. Cuatro horas después de la siembra de CM en la placa recubierta de laminina, células transfectadas con siRNAs (50 nM) de interés utilizando un reactivo de transfección (por ejemplo, Lipofectamine RNAiMAX) según el protocolo del fabricante.
3. Cambie los medios 24 horas después de la transfección y cada 24 horas después de eso durante un máximo de 20 días.
4. Después de 20 días, células fijas con 4% PFA en PBS para aplicaciones posteriores, incluyendo inmunocitoquímica para marcadores específicos de cardiacos como troponina para asegurar que los cardiomiocitos vivos se cultivaron con éxito a largo plazo.

Resultados

El protocolo modificado actual permite el aislamiento eficiente y el cultivo de LOS CM de ratas y ratones in vitro. Para el aislamiento de la RATA CM, se utilizaron un total de 3 ratas macho Fischer 344 adultas adultas (de 12 semanas de edad) en el procedimiento. La Figura 1 muestra el aparato quirúrgico y las configuraciones de aislamiento que se requieren en el procedimiento; cada parte ha sido marcada y descrita en la leyenda de la figura. La collagenasa tipo 2 se utilizó para la digest...

Discusión

Existe una necesidad crítica de establecer un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos adultos y el cultivo a largo plazo para realizar estudios mecánicos específicos de la célula. Sólo hay unos pocos informes que discuten los protocolos de aislamiento CM adultos, y aún menos de ellos se utilizan para el cultivo a largo plazo de ratones adultos CM^15,,16,,17. Se ha demostrado que la rata adulta CM tiene una mayor tol...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butane Dione monoxime	Sigma-Aldrich	B-0753
Blebbistatin	APExBIO	B1387
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709
Cell culture plate	Corning Costar	3526
Cell strainer	BD Biosciences	352360
Cel-miR-67	Dharmacon	CN-001000-01-50
Collagenase type2	Worthington	LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes	Sigma-Aldrich	Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Thermo Scientific	SH30022.01
EdU	Life Technologies	C10337
Fetal bovine serum	Corning	35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps	Fisherbrand	22-327379
Glucose	Sigma-Aldrich	G-5400
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	PSLAB-018285-02
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-128
Hyaluronidase	Sigma	H3506
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P-8281
KCl	Sigma-Aldrich	746436
Light Microscope	Nikon
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778-150
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-2643
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
Natural Mouse Laminin	Invitrogen	23017-015
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Pentobarbital	Henry Schein	24352
Phosphate buffered saline	Life Technologies	20012-027
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147-1G
Selenium	Sigma-Aldrich	229865+5G
siMeis2	Dharmacon	s161030
siRb1	Dharmacon	s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors	Fisher Scientific	28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-120
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor	Fisherbrand	22-079-747
Water Bath	Fisher Scientific	3006S