成年小鼠和大鼠心肌细胞的隔离、转染和长期培养

摘要

在这里，我们提出了成人小鼠和大鼠心肌细胞的分离、转染和长期培养的协议。

摘要

成年哺乳动物心肌细胞（CMs）的外体培养是心脏生物学体外研究最相关的实验系统。成年哺乳动物CMs是端端分化的细胞，繁殖能力最小。成人CMs的后位位状态不仅限制了心肌细胞周期的进展，也限制了CMs的高效培养。此外，成人CM的长期培养对于许多研究是必要的，如CM增殖和基因表达分析。

老鼠和老鼠是两个最喜欢用于心肌细胞分离的实验室动物。虽然大鼠CMs的长期培养是可能的，但成年小鼠CMs很容易死亡，在正常情况下不能培养超过五天。因此，迫切需要优化成人 murine CMs 的细胞隔离和长期培养协议。通过此修改后的协议，可以成功地分离和培养成年小鼠和大鼠的 VM 超过 20 天。此外，与之前的报告相比，分离CM的siRNA转染效率显著提高。对于成年小鼠CM分离，Langendorf灌注方法采用最佳酶溶液和足够的时间进行完整的细胞外基质分离。为了获得纯心室的CMs，在进行分离和电镀之前，对两个腹膜进行解剖和丢弃。细胞分散在层压涂层板上，从而能够高效、快速地连接。在SIRNA转染之前，CMs被允许在4-6小时内安顿下来。培养基每24小时刷新20天，随后，CMs被固定和染色的心脏特异性标记，如肌龙宁和细胞周期标记，如KI67。

引言

心脏病是全世界主要死亡原因之一。几乎所有类型的心脏损伤都会导致成人心肌细胞 （CMs） 的显著损失。由于成人CM¹的衰老性质，成年哺乳动物的心脏无法修复其心脏损伤。因此，任何对成年哺乳动物心脏的侮辱都会导致CMs的永久丧失，导致心脏功能下降和心力衰竭。与成年哺乳动物不同，斑马鱼和纽特心脏等小动物可以通过现有的CM增殖^{2、3、43再生心脏损伤}。²正在全球范围内努力通过增殖和非增殖方法寻找一种新的治疗性治疗性治疗性治疗性治疗手段。在过去的几十年里，已经开发出各种基因小鼠模型来研究心脏损伤和修复。然而，在体内使用动物模型仍然是一种昂贵的方法，从二次效应中破译细胞自主机制的复杂性更高。此外，体内系统很难分析从CM诱导心脏保护信号的药理干预的CM特异性效果。

此外，成人CM的长期文化对于进行CM增殖分析是必要的。CM增殖检测需要至少4-5天细胞被诱导到细胞周期，并在此之后获得准确的数据。此外，利用分离的CMs进行电生理学研究、药物筛选、毒性研究和^Ca+平衡研究的研究都需要改进培养系统^{5、6、7。,6,7}此外，最近的研究表明，从CMs（心因子^）8，9中分泌的细胞因子^{具有心脏保护意义}。为了研究这些心因子在心脏修复和再生过程中的治疗作用和分子机制，需要长期培养。

成年大鼠CMs在体外系统^10、11、12中，足够坚固^，可以进行单^{细胞分离和长期培养}。然而，成人小鼠CM是极大的兴趣的体外测定，由于各种转基因小鼠模型的可用性，这允许设计和执行各种创新分析，这是不可能与大鼠CM^13。与成年大鼠CM分离相比，从成年小鼠心脏获得单细胞悬浮是相当具有挑战性的，成人小鼠CM在培养中的长期培养更具挑战性。

成人CM隔离从老鼠和老鼠的心脏使用兰根多夫系统已经建立，以研究CM功能^{5,5，14，15。,15}在这里，我们详细介绍了成人CM从大鼠和小鼠分离的协议，以及经过修改的长期培养，转染和CM增殖的分离细胞。

研究方案

所有实验都应按照美国国家卫生研究院（NIH）发布的《实验室动物护理和使用指南》的指南进行。视频中显示的所有协议都经过了辛辛那提大学医学院动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. 从成年小鼠（和大鼠）中提取心脏前的准备

1. 根据表 1 和表2中给出的小鼠和小鼠隔离 的配方，准备相应的灌注、酶和停止溶液。通过 0.22 μm 过滤器过滤溶液，以去除任何污染或未溶解颗粒。
2. 清洁和消毒手术器械，浸泡在70%酒精15分钟，然后用双蒸馏水清洗。将工具放在干净的纸巾上晾干。
3. 将水浴预热至37°C。检查水浴中的水位，确保在手术过程中通过灌注装置不间断地循环温水。
4. 用70%的酒精清洁灌注装置5分钟。
   注:提高流量，这有助于清洁油管。
5. 酒精流经后，通过运行双蒸馏水10分钟，清洁酒精残留物。
6. 设置 3 个中型一次性聚苯乙烯称重盘，以清洁切除后的心脏。用20 mL的菌细胞缓冲液填充盘子。
7. 在巴斯德移液器的帮助下，将2-3滴肝素加入到每道菜中，并多次通过移液混合。
8. 用钝针管拿一个10毫升的注射器。
   注:通过切割清洁无菌针头的尖端，可以准备钝针管。分别使用21G针和14G针为小鼠和大鼠制作藤管。
9. 用灌注缓冲液填充注射器（表1）。从注射器中去除任何气泡，并将其放在第三盘中，处于倾斜位置。用胶带固定它。
   注:对于大鼠，使用溶液 A （ 表2） 代替菌细胞灌注缓冲液.
10. 用手术缝合线准备一个松散的结，并放在针头周围。
11. 注射内丙酮注射给小鼠注射肝素（100 USP 单位/小鼠），麻醉注射前 20 分钟。
12. 通过灌注装置循环菌细胞灌注缓冲液 （ 表1.将流量降低至 3 mL/min。
    注:对于大鼠，使用溶液 A （ 表2） 代替菌细胞灌注缓冲液.
13. 5分钟后，用酶溶液代替灌注缓冲液（表1）。在这个过程中用氧气使酶溶液饱和。使用 3 mL/min 的流速。
    注: 对于大鼠 CM 隔离，请改为使用解决方案 E （表 2） 。
14. 麻醉内针注射麻醉小鼠。使用 IACUC 推荐的适当剂量麻醉进行末期手术。
15. 由于对手趾捏没有反应，确认麻醉深度足够。然后，把鼠标放在手术平台上。

2. 从成年小鼠（和大鼠）中提取心脏

1. 用70%的酒精擦拭皮肤消毒。
2. 小心地打开胸部。
3. 切除心脏。切除过程中避免非心脏组织。
4. 把心脏放在第一盘，装满灌注缓冲液（表1）。
   注:对大鼠使用溶液A（表2）。
5. 轻轻挤压，清除心脏的血。
6. 将心转移到第二道菜。
7. 清洁心脏的血液，去除非心脏组织。随后，将心脏转移到第三道菜。
8. 修剪掉肺和其他周围组织，通过上升大管进行调节。应尽快执行此过程（<5 分钟），以提高 CM 的质量和数量。

3. 心脏的消化

1. 消化老鼠心
   注:所有通过小鼠心脏循环的解决方案/缓冲液应在整个过程中进行氧合。
   1. 小心地从注射器中取出凝固针，并将其连接到兰根多夫灌注器。
   2. 避免任何气泡进入心脏，这可能会影响酶溶液的流经和消化。
   3. 将水套向上移动，为心脏提供均匀的环境。让酶溶液以2-3 mL/min的速度流过心脏。
      注:通过解决方案的速度至关重要，对 CM 数量和质量的结果有显著影响。
   4. 让酶溶液流过心脏2分钟。
   5. 在2分钟内，加入40μL的100μM CaCl₂ 溶液到酶溶液中并混合。让酶溶液通过心脏再用10-15分钟。
      注:一旦流动变得光滑，心脏变得棕色和柔软，表明胶原酶的均匀分布和心脏的适当消化。
2. 老鼠心的消化
   注:所有通过大鼠心脏循环的溶液/缓冲液应在整个过程中进行氧气。
   1. 小心地从注射器中取出凝固针，并将其连接到兰根多夫灌注器。
   2. 避免任何气泡进入心脏，这可能会影响酶溶液的流经和消化。
   3. 将水套向上移动，为心脏提供均匀的环境。
   4. 以 2-3 mL/min 的速度启动溶液 A 的流动 3-5 分钟，以清除心脏的任何血液。
      注:通过解决方案的速度至关重要，对 CM 质量的结果有显著影响。
   5. 一旦血液从心脏中清除，从溶液A切换到溶液E（表2）。使用 CaCl₂ 的滴定溶液 E，如下所示，最终溶液浓度为 0.1 mM:
      1. 灌注10分钟后，加入12.5μL的0.1M CaCl₂。
      2. 灌注15分钟后，加入25μL的0.1 M CaCl₂。
   6. 让酶溶液通过心脏再持续30-40分钟，直到水流变得快，心脏柔韧。

4. CM单细胞悬浮液的制备

1. CM 单单元悬架的制备（鼠标）
   1. 从兰根多夫灌注系统中取出心脏。将其移动到一个 60 mm Petri 盘中填充 5 mL 酶溶液，然后将该培养皿转移到生物安全罩中。
      注:在从兰根多夫灌注系统取出心脏之前，确保足够的心脏消化。消化时间取决于酶活性、溶液的流动和心脏的大小。
   2. 在生物安全罩中执行任何进一步的机械分解，以确保无菌并避免污染。
   3. 小心地去除阿片（基础心脏^{部分的1/4）} 和额外的脂肪组织。
   4. 用钳子把心切成细块。
   5. 拿一个无菌的巴斯德移液器，以45o角切开其尖端。
   6. 使用这种巴斯德移液器通过温和移液在单细胞悬浮液中分配心脏组织。最佳消化提供单细胞心肌细胞的悬浮液。
      注:拆下传输移液器的狭窄底部，以减少因机械灼热造成的 CM 损坏。
   7. 然后，加入5 mL的停止溶液，以停止酶活性，从而避免过度消化的可能性。
   8. 拿一个新鲜的50 mL圆锥形，并放置一个无菌的100μm细胞过滤器。
   9. 通过细胞过滤器通过心肌细胞悬浮液，去除组织块。用另外5mL的止损溶液（表1）清洗培养皿和过滤器，收集任何仍然附着在过滤器上的心细胞。
2. CM 单细胞悬浮液的制备（大鼠）
   1. 从兰根多夫灌注系统中取出心脏。将心脏移动到充满 5 mL 溶液 A 的 100 mm Petri 盘中，然后将该盘移动到生物安全罩。
      注:在从兰根多夫灌注系统取出心脏之前，确保足够的心脏消化。消化时间取决于酶活性、溶液的流动和心脏的大小。
   2. 在生物安全罩中执行任何进一步的机械分解，以确保无菌并避免污染。
   3. 小心地去除阿片（基底心脏部分的1/4）和额外的脂肪组织。
   4. 用钳子把心切成细块。
   5. 拿一个无菌的巴斯德移液器，以45o角切开其尖端。
   6. 使用这种巴斯德移液器通过温和移液在单细胞悬浮液中分配心脏组织。最佳消化提供单细胞心肌细胞的悬浮液。
      注:拆下传输移液器的狭窄底部，以减少因机械灼热造成的 CM 损坏。
   7. 将 5 mL 溶液 B （表 2） 添加到 CM 悬浮液中，并通过 100 μm 细胞过滤器将溶液取出任何剩余的脂肪或其他未消化组织。
   8. 在新鲜的 50 mL 圆锥瓶中收集滤物。
   9. 使用另外 5 mL 溶液 B 通过细胞过滤器清洗培养皿和任何剩余的 CM。

5. 删除非 VM

1. 从成人单细胞悬浮液（鼠标）中去除非 VM
   1. 将电池悬浮液在 20 x g 下 离心 3 分钟。
   2. 丢弃上一液，在10 mL的停止溶液中重新暂停细胞（表1）。
      注:增加停止溶液中BSA的浓度将增加其粘度，降低非MS的沉积率。
   3. 通过轻轻反转管3-5次，重新暂停CMs。
   4. 每隔 3 分钟加入 10 μL 的 100 μM CaCl₂ 溶液并混合。重复三次。
   5. 第四次添加后，将心肌细胞悬浮液在20xg下离 心 3分钟。
   6. 丢弃上一杯。
   7. 在预热 （37 oC） 中重新暂停 CM，成人鼠标 CM 电镀介质 （表 3）
2. 从成人单细胞悬浮液（大鼠）中去除非 CMs
   1. 在20 x g的颗粒细胞 ，在25°C下3分钟。
   2. 丢弃上一液，将细胞重新放入溶液B的25 mL中（表2）。
   3. 通过温和的反转混合细胞，并放在一个管架，让CM在重力下沉淀。
   4. 小心丢弃上看液。
   5. 将细胞重新在新鲜 25 mL 溶液 B 中，以 3-5 分钟间隔逐步添加 50 μL、75 μL 和 100 μL 0.1 M CaCl_2，将细胞滴定到 1.0 mM CaCl_2。
      注:在此步骤中可以使用解决方案 B 中 BSA 浓度较高的 BSA。增加溶液B中BSA的浓度会增加粘度，从而降低非MS的沉积率。
   6. 在20 x g的 颗粒细胞在25oC下3分钟，吸上心，并添加所需的成人大鼠细胞培养培养量（表4）。
   7. 层压涂层板上的种子 CMs。
      注:在非涂层培养板上预镀CM，可用于最大限度地减少非CM细胞的污染。

6. 成人 CM 电镀

1. 预镀
   1. 将心肌细胞重新放入文化媒体中。
   2. 将细胞分别预镀为60毫米或100毫米的小鼠或大鼠CM。
   3. 在孵化器中孵育 2 小时，在 37 oC 时辅以 5% CO_2。
   4. 在板前孵育过程中，用层压素（PBS中的10微克/mL）涂覆细胞培养板，用于长期CM培养。
2. 预镀 2 小时后，在 50 mL 锥形小瓶中收集 1M。
3. 从培养皿中收集细胞，再将它们重新镀入层压涂层的24井培养板，用于转染实验。
4. 在37oC的培养箱中培养细胞，辅以_CO2的5%。4-6小时足以粘附与表面的心肌细胞，因此，转染可以在电镀后6小时进行。
   注:通常使用含有FBS的电镀介质，与增殖研究具有更好的兼容性。然而，无血清介质可用于分析分泌因子的实验。

7. 感染

1. 将CMs孵育到涂有层压素的细胞培养板4-6小时。
2. CM在层压涂层板上播种4小时后，根据制造商的协议，使用转染试剂（例如，利波卡胺RNAIMAX）使用具有感兴趣的siRNA（50 nM）的转染细胞。
3. 转染后 24 小时更换介质，感染后每 24 小时更换一次介质，更换介质长达 20 天。
4. 20天后，将PBS中具有4%PFA的细胞修复为下游应用，包括用于心脏特异性标记物（如Troponin）的免疫细胞化学，以确保活体心肌细胞长期成功培养。

结果

当前修改的协议允许在体外有效地隔离和培养大鼠和小鼠的 CMs。对于大鼠CM分离，共有3只成年（12周大）雄性菲舍尔344只大鼠被使用。图 1显示了手术过程中所需的手术器械和隔离装置;每个部件都已标记并描述在图例中。胶原酶类型2用于消化，从成功分离中产生大量高质量的CMS（图2A）。分离后24小时，这些细胞被转染细胞周期诱导特定的siRNA对Rb1

讨论

迫切需要建立成人心肌细胞分离和长期培养的规程，以进行细胞特定的机械研究。只有少数报告讨论成人CM隔离协议，甚至更少用于成人小鼠^{CM15，16，17,16,的长期培养}。研究表明，成年大鼠CM对体外培养的耐受性比成年大鼠^{CM10、11、12,11,高}。在这份报告中，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butane Dione monoxime	Sigma-Aldrich	B-0753
Blebbistatin	APExBIO	B1387
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709
Cell culture plate	Corning Costar	3526
Cell strainer	BD Biosciences	352360
Cel-miR-67	Dharmacon	CN-001000-01-50
Collagenase type2	Worthington	LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes	Sigma-Aldrich	Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Thermo Scientific	SH30022.01
EdU	Life Technologies	C10337
Fetal bovine serum	Corning	35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps	Fisherbrand	22-327379
Glucose	Sigma-Aldrich	G-5400
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	PSLAB-018285-02
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-128
Hyaluronidase	Sigma	H3506
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P-8281
KCl	Sigma-Aldrich	746436
Light Microscope	Nikon
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778-150
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-2643
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
Natural Mouse Laminin	Invitrogen	23017-015
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Pentobarbital	Henry Schein	24352
Phosphate buffered saline	Life Technologies	20012-027
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147-1G
Selenium	Sigma-Aldrich	229865+5G
siMeis2	Dharmacon	s161030
siRb1	Dharmacon	s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors	Fisher Scientific	28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-120
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor	Fisherbrand	22-079-747
Water Bath	Fisher Scientific	3006S