Isolation, transfection et culture à long terme des cardiomyocytes adultes de souris et de rats

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement, la transfection, et la culture à long terme de la souris adulte et les cardiomyocytes de rat.

Résumé

La culture ex vivo des cardiomyocytes mammifères adultes (CM) présente le système expérimental le plus pertinent pour l’étude in vitro de la biologie cardiaque. Les CMs des mammifères adultes sont des cellules différenciées en phase terminale avec une capacité proliférative minimale. L’état post-mitotique des MCM adultes non seulement limite la progression du cycle cellulaire cardiomyocyte, mais limite également la culture efficace des CM. En outre, la culture à long terme des MC adultes est nécessaire pour de nombreuses études, telles que la prolifération cm et l’analyse de l’expression des gènes.

La souris et le rat sont les deux animaux de laboratoire les plus préférés à être utilisés pour l’isolement cardiomyocyte. Bien que la culture à long terme des CMs de rat soit possible, les CMs adultes de souris sont sensibles à la mort et ne peuvent pas être cultivés plus de cinq jours dans des conditions normales. Par conséquent, il est essentiel d’optimiser l’isolement cellulaire et le protocole de culture à long terme pour les CM murines adultes. Avec ce protocole modifié, il est possible d’isoler et de culture avec succès les CM adultes de souris et de rats pendant plus de 20 jours. De plus, l’efficacité de la transfection du SIRNA du CM isolé est considérablement augmentée par rapport aux rapports précédents. Pour l’isolement cm de souris adulte, la méthode de perfusion de Langendorff est employée avec une solution enzymatique optimale et le temps suffisant pour la dissociation complète de matrice extracellulaire. Afin d’obtenir des MC ventriculaires purs, les deux atrias ont été disséqués et jetés avant de procéder à la dissociation et au placage. Les cellules ont été dispersées sur une plaque enduite de laminine, ce qui a permis un attachement efficace et rapide. Les CM ont été autorisés à se contenter de 4-6 h avant la transfection de siRNA. Les médias culturels ont été rafraîchis tous les 24 h pendant 20 jours, et par la suite, les CM ont été fixés et tachés pour des marqueurs cardiaques spécifiques tels que la troponine et des marqueurs du cycle cellulaire tels que KI67.

Introduction

Les maladies cardiaques sont l’une des principales causes de décès dans le monde. Presque tous les types de lésions cardiaques entraînent une perte importante de cardiomyocytes adultes (CM). Les cœurs de mammifères adultes sont incapables de réparer leurs lésions cardiaques en raison de la nature sénescente du CM¹adulte. Ainsi, toute insulte au cœur des mammifères adultes entraîne une perte permanente de CMs, conduisant à une diminution de la fonction cardiaque et l’insuffisance cardiaque. Contrairement aux mammifères adultes, les petits animaux comme le poisson zèbre et les cœurs de newt peuvent régénérer leurs lésions cardiaques par la prolifération existante cm^2,3,4. Un effort mondial est en cours pour trouver une nouvelle intervention thérapeutique pour les lésions cardiaques par le biais d’approches prolifératives et non prolifératives. Au cours des dernières décennies, divers types de modèles génétiques de souris ont été développés pour étudier les lésions cardiaques et la réparation. Cependant, l’utilisation de modèles animaux in vivo continue d’être une approche coûteuse avec la complexité supplémentaire pour déchiffrer un mécanisme cellulaire autonome à partir d’effets secondaires. En outre, les systèmes in vivo sont difficiles à analyser les effets spécifiques cm d’une intervention pharmacologique qui induit la signalisation cardioprotectrice de la CM.

De plus, la culture à long terme des MC adultes est nécessaire pour effectuer des analyses de prolifération des CM. Les tests de prolifération cm nécessitent un minimum de 4-5 jours pour que les cellules soient induites dans le cycle cellulaire et pour obtenir des données précises par la suite. En outre, les études qui utilisent des CM isolés pour des études électrophysiologiques, le dépistage des médicaments, les études de toxicité, et les études d’homéostasie Ca⁺⁺ ont tous besoin d’un système de culture amélioré^5,6,7. En outre, des études récentes montrent l’importance cardioprotectrice des cytokines sécrétées par les CMs (cardiokines)^8,9. Afin d’étudier le rôle thérapeutique et le mécanisme moléculaire de ces cardiokines pendant la réparation et la régénération de coeur, une culture prolongée est exigée.

Les CMs adultes de rat sont assez robustes pour l’isolement unicellulaire et la culture à long terme dans un système in vitro^10,11,12. Cependant, les CM de souris adultes sont d’un grand intérêt pour les tests in vitro, en raison de la disponibilité d’une variété de modèles de souris génétiquement modifiés, ce qui permet la conception et l’exécution de diverses analyses innovantes qui ne sont pas possibles avec le rat CM¹³. Contrairement à l’isolement adulte de CM de rat, il est assez difficile d’obtenir une suspension d’une seule cellule des coeurs de souris adultes, et la culture à long terme des CM de souris adultes dans la culture est encore plus difficile.

L’isolement adulte de CM des coeurs de souris et de rat utilisant un système de Langendorff a précédemment été établi pour étudier la fonction de CM^5,14,15. Ici, nous avons décrit en détail les protocoles pour l’isolement adulte de CM des rats et des souris, aussi bien qu’une culture modifiée à long terme, la transfection, et la prolifération de CM des cellules isolées.

Protocole

Toutes les expériences doivent être réalisées conformément aux lignes directrices du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publié par le National Institute of Health (NIH) des États-Unis. Tous les protocoles affichés dans la vidéo ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Cincinnati, College of Medicine.

1. Préparation avant l’extraction cardiaque de souris adultes (et rats)

1. Préparer les solutions de perfusion, d’enzyme et d’arrêt correspondantes, selon les recettes données respectivement aux tableaux 1 et 2, pour l’isolement des rats et des souris. Filtrer les solutions à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer toute contamination ou particules non déguisées.
2. Nettoyez et stérilisez les instruments chirurgicaux en les trempant dans 70% d’alcool pendant 15 min, puis lavez-les avec de l’eau distillée double. Laissez les outils sécher à l’air sur une serviette en papier propre.
3. Préchauffer le bain d’eau à 37 ºC. Vérifiez le niveau d’eau dans le bain d’eau pour assurer une circulation ininterrompue de l’eau chaude à travers l’appareil de perfusion pendant la procédure.
4. Nettoyez l’appareil de perfusion en courant avec 70% d’alcool pendant 5 min. Répétez.
   REMARQUE : Augmentez le débit, ce qui aide à nettoyer le tube.
5. Après le débit d’alcool, nettoyer les restes d’alcool en exécutant de l’eau distillée double pendant 10 min.
6. Mettre en place 3 plats jetables de taille moyenne pesant des plats pour nettoyer le cœur après l’excision. Remplissez les plats de 20 mL de tampon de myocyte.
7. Ajouter 2 à 3 gouttes d’héparine dans chaque plat à l’aide de la pipette Pasteur et bien mélanger en pipeting plusieurs fois.
8. Prenez une seringue de 10 mL avec une canule à aiguille émoussée.
   REMARQUE : Une canule à aiguille émoussée peut être préparée en coupant la pointe d’une aiguille propre et stérile. Une aiguille de 21 G et une aiguille de 14 G ont été utilisées pour fabriquer la canule de la souris et du rat, respectivement.
9. Remplissez la seringue avec un tampon de perfusion (tableau 1). Retirez les bulles d’air de la seringue et placez-la dans le troisième plat à une position inclinée. Fixez-le avec du ruban adhésif.
   REMARQUE : Pour les rats, la solution A (tableau 2) a été utilisée au lieu de la tampon de perfusion de myocyte.
10. Préparer un nœud lâche avec une suture chirurgicale et le placer autour de l’aiguille.
11. Injectez la souris avec de l’héparine (100 unités USP/souris) par injection intrapéritonéale, 20 min avant l’injection d’anesthésie.
12. Faire circuler la tampon de perfusion de myocyte (tableau 1) à travers l’appareil de perfusion. Diminuer le débit à 3 mL/min.
    REMARQUE : Pour les rats, la solution A (tableau 2) a été utilisée au lieu de la tampon de perfusion de myocyte.
13. Après 5 min, remplacer le tampon de perfusion par la solution enzymatique (tableau 1). Saturer la solution enzymatique avec de l’oxygène pendant le processus. Utilisez un débit de 3 mL/min.
    REMARQUE : Pour l’isolement de cm de rat, utilisez la solution E (Tableau 2) à la place.
14. Anesthésiez la souris par injection intrapéritonéale d’anesthésie. Utilisez la dose appropriée d’anesthésie, recommandée par l’IACUC, pour la chirurgie terminale.
15. Confirmer une profondeur suffisante de l’anesthésie par l’absence d’une réponse à une pincée d’orteil. Ensuite, mettez la souris sur la plate-forme chirurgicale.

2. Extraction du cœur de souris adultes (et de rats)

1. Stériliser la peau en essuyant avec 70% d’alcool.
2. Ouvrez soigneusement la poitrine.
3. Exciser le cœur. Évitez les tissus non cardiaques pendant l’excision.
4. Mettez le cœur sur le premier plat, rempli de tampon de perfusion (Tableau 1).
   REMARQUE : Utiliser la solution A pour le rat (tableau 2).
5. Dégagez le sang du cœur en serrant doucement.
6. Transférer le cœur dans le deuxième plat.
7. Nettoyez le sang du cœur et retirez les tissus non cardiaques. Par la suite, transférer le cœur dans le troisième plat.
8. Coupez les poumons et les autres tissus environnants et cannulez par l’intermédiaire de l’aorte ascendante. Cette procédure doit être effectuée aussi rapidement que possible (<5 min) afin d’améliorer la qualité et la quantité de CM.

3. Digestion du cœur

1. Digestion du cœur de souris
   REMARQUE : Toutes les solutions/tampons qui circulent dans le cœur de la souris doivent être oxygénées tout au long de la procédure.
   1. Retirez soigneusement l’aiguille cannuillante de la seringue et connectez-la à l’appareil de perfusion de Langendorff.
   2. Évitez toute bulle d’air entrant dans le cœur, ce qui peut affecter le flux à travers la solution enzymatique et la digestion.
   3. Déplacez la veste d’eau vers le haut pour fournir un environnement homogène au coeur. Permettre à la solution enzymatique de circuler dans le cœur à une vitesse de 2-3 mL/min.
      REMARQUE : La vitesse de la solution de dépassement est critique et a un impact significatif sur le résultat de la quantité et de la qualité cm.
   4. Laissez la solution enzymatique circuler dans le cœur pendant 2 min.
   5. À 2 min, ajouter 40 μL de 100 μM CaCl₂ solution à la solution enzymatique et mélanger. Laissez passer la solution enzymatique dans le cœur pendant encore 10-15 min.
      REMARQUE : Une fois que le flux devient lisse, le cœur devient brunâtre et doux, indiquant la distribution uniforme de l’enzyme de collagènease et la bonne digestion du cœur.
2. Digestion du cœur de rat
   REMARQUE : Toutes les solutions/tampons qui circulent dans le cœur du rat doivent être oxygénées tout au long de la procédure.
   1. Retirez soigneusement l’aiguille cannuillante de la seringue et connectez-la à l’appareil de perfusion de Langendorff.
   2. Évitez toute bulle d’air entrant dans le cœur, ce qui peut affecter le flux à travers la solution enzymatique et la digestion.
   3. Déplacez la veste d’eau vers le haut pour fournir un environnement homogène au coeur.
   4. Démarrer le flux de la solution A à une vitesse de 2-3 mL/min pendant 3-5 min pour enlever tout sang du cœur.
      REMARQUE : La vitesse de la solution de dépassement est critique et a un impact significatif sur le résultat de la qualité CM.
   5. Une fois le sang dégagé du cœur, passez de la solution A à la solution E (Tableau 2). Solution de titrage E avec CaCl₂ comme indiqué ci-dessous pour une concentration finale de 0,1 mM en solution :
      1. Après 10 min de perfusion, ajouter 12,5 μL de 0,1 M CaCl₂.
      2. Après 15 min de perfusion, ajouter 25 μL de 0,1 M CaCl₂.
   6. Laissez la solution enzymatique passer à travers le cœur pendant encore 30-40 min, jusqu’à ce que le flux devient rapide et le cœur est souple.

4. Préparation de la suspension à cellule unique CM

1. Préparation de la suspension à cellule unique CM (souris)
   1. Retirer le cœur du système de perfusion langendorff. Déplacez-le dans une boîte de Pétri de 60 mm remplie de 5 mL de solution enzymatique et transférez le plat sur une hotte de biosécurité.
      REMARQUE : Assurer une digestion cardiaque suffisante avant d’enlever le cœur du système de perfusion de Langendorff. Le temps de digestion dépend de l’activité enzymatique, le flux de la solution, et la taille du cœur.
   2. Effectuer toute autre désagrégation mécanique dans un capot de biosécurité pour assurer la stérilité et éviter la contamination.
   3. Retirez soigneusement les atrias^{(1/4 e} de la partie du cœur basal) et les tissus adipeux supplémentaires.
   4. Hacher le cœur avec des forceps en morceaux fins.
   5. Prenez une pipette Pasteur stérile et coupez sa pointe à un angle de 45º.
   6. Utilisez cette pipette Pasteur pour distribuer le tissu cardiaque dans une suspension unicellulaire par pipetage doux. La digestion optimale fournit une suspension des cardiomyocytes unicellulaires.
      REMARQUE : Retirez la partie étroite et inférieure du tuyau de transfert pour réduire les dommages causés par cm en raison de l’entrage mécanique.
   7. Ensuite, ajouter 5 mL de solution d’arrêt pour arrêter l’activité enzymatique, ce qui évite la possibilité de surdigestion.
   8. Prenez un produit conique frais de 50 mL et placez-le sur une passoire à cellules stérile de 100 μm.
   9. Passer la suspension cardiomyocyte à travers la passoire cellulaire pour enlever le morceau de tissu. Laver la boîte et la passoire Petri avec une autre solution d’arrêt de 5 mL (tableau 1)pour recueillir les cardiomyocytes qui restent attachés à la passoire.
2. Préparation de la suspension à cellule unique CM (rat)
   1. Retirer le cœur du système de perfusion langendorff. Déplacez le cœur vers une boîte de Pétri de 100 mm remplie de 5 mL de solution A et déplacez le plat vers une hotte de biosécurité.
      REMARQUE : Assurer une digestion cardiaque suffisante avant d’enlever le cœur du système de perfusion de Langendorff. Le temps de digestion dépend de l’activité enzymatique, le flux de la solution, et la taille du cœur.
   2. Effectuer toute autre désagrégation mécanique dans un capot de biosécurité pour assurer la stérilité et éviter la contamination.
   3. Retirez soigneusement les atrias (1/4e de la partie du cœur basal) et les tissus adipeux supplémentaires.
   4. Hacher le cœur avec des forceps en morceaux fins.
   5. Prenez une pipette Pasteur stérile et coupez sa pointe à un angle de 45º.
   6. Utilisez cette pipette Pasteur pour distribuer le tissu cardiaque en suspension unicellulaire par pipetage doux. La digestion optimale fournit une suspension des cardiomyocytes unicellulaires.
      REMARQUE : Retirez la partie étroite et inférieure du tuyau de transfert pour réduire les dommages causés par cm en raison de l’entrage mécanique.
   7. Ajouter 5 mL de solution B (tableau 2) à la suspension CM et passer la solution à travers une passoire à cellules de 100 μm pour enlever les morceaux restants de graisse ou d’autres tissus non digérés.
   8. Recueillir le filtrate dans un flacon conique frais de 50 mL.
   9. Utilisez un autre 5 mL de solution B pour laver la boîte de Pétri et tout cm restant à travers la passoire cellulaire.

5. Suppression des non-CM

1. Retrait des non-CM de la suspension adulte à cellule unique (souris)
   1. Centrifuge la suspension cellulaire à 20 x g pendant 3 min.
   2. Jeter le supernatant et resuspender les cellules dans 10 mL de solution d’arrêt (Tableau 1).
      REMARQUE : L’augmentation de la concentration de BSA dans la solution d’arrêt augmentera sa viscosité et réduira le taux de sédimentation des non-MC.
   3. Resuspendez les CM par l’inversion douce du tube 3-5 fois.
   4. À intervalles de 3 min, ajouter 10 μL de 100 μM CaCl₂ solution et mélanger. Répétez trois fois.
   5. Après le quatrième ajout, centrifuge la suspension cardiomyocyte à 20 x g pendant 3 min.
   6. Jetez le supernatant.
   7. Resuspend les MC en préchauffés (37 ºC), les supports de placage CM de souris adultes (tableau 3).
2. Retrait des non-CM des suspensions adultes à cellule unique (rat)
   1. Cellules de granulés à 20 x g pendant 3 min à 25 ºC.
   2. Jeter le supernatant et resuspender les cellules en 25 mL de solution B (Tableau 2).
   3. Mélanger les cellules par une légère inversion et les placer dans un support de tube pour permettre au CM de s’installer sous la gravité.
   4. Jeter soigneusement le supernatant.
   5. Resuspendez les cellules dans 25 mL frais de la solution B et titrez-les à 1,0 mM CaCl₂ par addition progressive de 50 μL, 75 μL et 100 μL de 0,1 M CaCl₂ à intervalles de 3 à 5 min.
      REMARQUE : Une concentration plus élevée de BSA dans la solution B pourrait être utilisée à cette étape. L’augmentation de la concentration de BSA dans la solution B augmente la viscosité et, par conséquent, réduit le taux de sédimentation des non-MC.
   6. Cellules de granulés à 20 x g pendant 3 min à 25 ºC, aspirant le supernatant, et ajouter le volume désiré de la culture de cellules de rat adultes (tableau 4).
   7. Semer les CM sur une plaque enduite de laminine.
      REMARQUE : Le pré-placage des MC sur une plaque de culture non enduite peut être utilisé pour minimiser la contamination des cellules non CM.

6. Placage CM adulte

1. Pré-placage
   1. Resuspend les cardiomyocytes dans les médias culturels.
   2. Pré-plaquer les cellules dans un plat de 60 mm ou 100 mm pour la souris ou le rat CM, respectivement.
   3. Incuber les CM pendant 2 h dans un incubateur complété par 5% de CO₂ à 37 ºC.
   4. Pendant l’incubation pré-plaque, enduisez les plaques de culture cellulaire de laminine (10 μg/mL en PBS) pour la culture CM à long terme.
2. Après 2 h de pré-placage, recueillir les CM dans un flacon conique de 50 mL.
3. Recueillir les cellules du plat et les re-plaquer dans une plaque de culture de 24 puits enduit de laminine pour des expériences de transfection.
4. Cellules de culture dans un incubateur à 37 ºC complétés par 5% avec CO₂. 4-6 heures est suffisante pour adhérer aux cardiomyocytes avec la surface, et donc, la transfection peut être effectuée 6 heures après le placage.
   REMARQUE : Le milieu de placage contenant FBS est couramment utilisé et montre une meilleure compatibilité avec les études de prolifération. Cependant, un milieu sans sérum peut être utilisé pour des expériences où des facteurs sécrétoires sont analysés.

7. Transfection

1. Incuber les MC aux plaques de culture cellulaire recouvertes de laminine pendant 4-6 heures.
2. Quatre heures après l’ensemencement cm sur la plaque enduite de laminine, les cellules transfectées avec des siARN (50 nM) d’intérêt à l’aide d’un réactif transfection (par exemple, lipofectamine RNAiMAX) selon le protocole du fabricant.
3. Changez de support 24 heures après la transfection et toutes les 24 heures après cela pendant jusqu’à 20 jours.
4. Après 20 jours, fixer les cellules avec 4% PFA dans PBS pour les applications en aval, y compris l’immunocytochimie pour les marqueurs cardiaques spécifiques tels que troponine pour assurer cardiomyocytes vivants ont été cultivés avec succès à long terme.

Résultats

Le protocole modifié actuel permet l’isolement efficace et la culture des rats et des souris CMs in vitro. Pour l’isolement de CM de rat, un total de 3 adultes (12 semaines)mâle Fischer 344 rats ont été utilisés dans la procédure. La figure 1 montre l’appareil chirurgical et les configurations d’isolement requises dans la procédure; chaque partie a été marquée et décrite dans la légende de la figure. Collagène de type 2 a été utilisé pour la digestion, ce qui donne un...

Discussion

Il est essentiel d’établir un protocole pour l’isolement cardiomyocyte adulte et la culture à long terme pour effectuer des études mécanistes spécifiques aux cellules. Il n’y a que quelques rapports discutant des protocoles adultes d’isolement cm, et encore moins d’entre eux sont utilisés pour la culture à long terme des souris adultes CM^15,16,17. Il est démontré que le rat adulte CM a une plus grande toléran...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butane Dione monoxime	Sigma-Aldrich	B-0753
Blebbistatin	APExBIO	B1387
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709
Cell culture plate	Corning Costar	3526
Cell strainer	BD Biosciences	352360
Cel-miR-67	Dharmacon	CN-001000-01-50
Collagenase type2	Worthington	LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes	Sigma-Aldrich	Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Thermo Scientific	SH30022.01
EdU	Life Technologies	C10337
Fetal bovine serum	Corning	35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps	Fisherbrand	22-327379
Glucose	Sigma-Aldrich	G-5400
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	PSLAB-018285-02
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-128
Hyaluronidase	Sigma	H3506
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P-8281
KCl	Sigma-Aldrich	746436
Light Microscope	Nikon
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778-150
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-2643
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
Natural Mouse Laminin	Invitrogen	23017-015
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Pentobarbital	Henry Schein	24352
Phosphate buffered saline	Life Technologies	20012-027
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147-1G
Selenium	Sigma-Aldrich	229865+5G
siMeis2	Dharmacon	s161030
siRb1	Dharmacon	s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors	Fisher Scientific	28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-120
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor	Fisherbrand	22-079-747
Water Bath	Fisher Scientific	3006S