בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, טרנס-תירטוי ותרבות ארוכת טווח של עכבר בוגר וקרדיומיוציטים של חולדות.

Abstract

תרבות החיים לשעבר של קרדיומיוציטים יונקים בוגרים (CMs) מציגה את המערכת הניסיונית הרלוונטית ביותר למחקר במבחנה של ביולוגיה לבבית. CMs יונקים בוגרים הם תאים מובדילים סופנית עם קיבולת התפשטות מינימלית. המצב שלאחר המיטוטיקה של CMs למבוגרים לא רק מגביל את התקדמות מחזור תא cardiomyocyte, אלא גם מגביל את התרבות היעילה של CMs. יתר על כן, התרבות ארוכת הטווח של CMs למבוגרים היא הכרחית עבור מחקרים רבים, כגון התפשטות CM וניתוח של ביטוי גנים.

העכבר והעכברוש הם שתי חיות המעבדה המועדפות ביותר שישמשו לבידוד קרדיומיוציט. בעוד התרבות ארוכת הטווח של CMs חולדה אפשרית, CMs עכבר מבוגר רגישים למוות ולא ניתן לתרע יותר מחמישה ימים בתנאים נורמליים. לכן, יש צורך קריטי לייעל את בידוד התא ואת פרוטוקול תרבות לטווח ארוך עבור CMs murine למבוגרים. עם פרוטוקול זה שונה, ניתן לבודד בהצלחה ותרבות הן עכבר בוגר ועכברוש CMs במשך יותר מ 20 ימים. יתר על כן, יעילות הטרנס-תום-רוחב של סי.אם מבודד גדלה באופן משמעותי בהשוואה לדוחות קודמים. עבור בידוד CM עכבר מבוגר, שיטת perfusion Langendorff מנוצל עם פתרון אנזים אופטימלי ומספיק זמן עבור דיסוציאציה מטריצה extracellular מלא. על מנת להשיג CMs חדרי טהור, שני atria נותקו והושלכו לפני שהמשיך עם ההתנתקות והציפוי. התאים פוזרו על צלחת מצופה למימינין, מה שאפשר חיבור יעיל ומהיר. CMs הורשו להסתפק 4-6 שעות לפני תירגם siRNA. מדיה תרבות היה רענן כל 24 שעות במשך 20 ימים, ולאחר מכן, CMs היו קבועים ומוכתמים עבור סמנים ספציפיים לב כגון טרופונין סמנים של מחזור תא כגון KI67.

Introduction

מחלות לב הן אחת הסיבות המובילות למוות ברחבי העולם. כמעט כל סוגי פגיעת לב לגרום לאובדן משמעותי של cardiomyocytes למבוגרים (CMs). לבבות יונקים בוגרים אינם מסוגלים לתקן את פציעת הלב שלהם בשל אופיו הרגיש של CM^{1 הבוגר}. לכן, כל עלבון ללב היונקים הבוגרים גורם לאובדן קבוע של CMs, המוביל לתפקוד לב מופחת ואי ספיקת לב. שלא כמו יונקים בוגרים, בעלי חיים קטנים כמו דגי זברה ולבבות ניוט יכולים לחדש את פגיעת הלב שלהם^{באמצעות התפשטות}CM קיימת 2^,3,4. מאמץ עולמי הוא מתמשך למצוא התערבות טיפולית חדשנית עבור פגיעה לב באמצעות גישות הן proliferative ולא התפשטות. בעשורים האחרונים פותחו סוגים שונים של מודלים של עכברים גנטיים כדי ללמוד פגיעה ותיקון לב. עם זאת, השימוש במודלים של בעלי חיים vivo ממשיך להיות גישה יקרה עם המורכבות הנוספת כדי לפענח מנגנון תא אוטונומי מאפקטים משניים. חוץ מזה, במערכות vivo מאתגרים לנתח CM השפעות ספציפיות של התערבות תרופתית הגורם איתות cardioprotective מן CM.

יתר על כן, התרבות ארוכת הטווח של CMs למבוגרים יש צורך לבצע ניתוחי התפשטות CM. CM התפשטות assays דורשים מינימום של 4-5 ימים עבור תאים להיות מושרה לתוך מחזור התא ולקבל נתונים מדויקים לאחר מכן. בנוסף, מחקרים המשתמשים CMs מבודדים עבור מחקרים אלקטרופיזיולוגיים, סינון סמים, מחקרי רעילות, ו Ca⁺⁺ מחקרי הומסטאזיס כולם זקוקים למערכת תרבות משופרת^5,6,7. יתר על כן, מחקרים אחרונים מראים את המשמעות cardioprotective של ציטוקינות הפרשת CMs (cardiokines)^8,,9. על מנת לחקור את התפקיד הטיפולי ואת המנגנון המולקולרי של קרדיוקין אלה במהלך תיקון לב והתחדשות, נדרשת תרבות ממושכת.

מלשינים של חולדות בוגרות חזקים מספיק לבידוד חד-תאי ולתרבות ארוכת טווח^{במערכת חוץ-חוץ-10,,11,,12}. עם זאת, CMs עכבר מבוגר הם עניין רב עבור חוץ חוץ, בשל הזמינות של מגוון רחב של מודלים עכבר מהונדסים גנטית, המאפשר עיצוב וביצוע של ניתוחים חדשניים שונים שאינם אפשריים עם חולדה CM¹³. בניגוד לבידוד CM חולדה למבוגרים, זה די מאתגר לקבל השעיה חד-תאית מלבבות עכבר מבוגר, ואת התרבות לטווח ארוך של CMs עכבר מבוגר בתרבות הוא אפילו יותר מאתגר.

בידוד CM למבוגרים מלבבות עכבר וחולדות באמצעות מערכת Langendorff הוקמה בעבר כדי ללמוד CM^{פונקציה 5,14,15}. כאן, תיארנו בפירוט את הפרוטוקולים לבידוד CM למבוגרים הן חולדות ועכברים, כמו גם תרבות ארוכת טווח שונה, transfection, והתפשטות CM של תאים מבודדים.

Protocol

כל הניסויים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות של המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסמו על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH). כל הפרוטוקולים המוצגים בסרטון אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת סינסינטי, המכללה לרפואה.

1. הכנה לפני חילוץ לב מעכברים בוגרים (וחולדות)

1. הכינו את הפתרונות המתאימים, האנזימים והפסקת הפתרונות, בהתאם למתכונים שניתנו בטבלה 1 ובטבלה 2, לבידוד חולדות ועכברים, בהתאמה. לסנן את הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 μm כדי להסיר כל זיהום או חלקיקים לא פתורים.
2. נקה וחטא את כלי הניתוח על ידי השריה ב-70% אלכוהול במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים כפולים. השאירו את הכלים לאוויר יבש על מגבת נייר נקייה.
3. מחממים מראש את אמבט המים ל-37 מעלות צלזיוס.
4. נקה את אפליקציית ההתבות על-ידי ריצה עם 70% אלכוהול למשך 5 דקות.
   הערה: הגדל את קצב הזרימה, המסייע לנקות את הצינורות.
5. לאחר זרימת האלכוהול, נקה את שאריות האלכוהול על ידי הפעלת מים מזוקקים כפולים במשך 10 דקות.
6. להגדיר 3 פוליסטירן חד פעמי בגודל בינוני שוקל כלים כדי לנקות את הלב לאחר החתך. מלאו את הכלים ב-20 מ"ל של חוצץ מיוצ'יט.
7. מוסיפים 2-3 טיפות של הפרין לכל מנה בעזרת פסטר פיפטה ומערבבים היטב על ידי התזת מספר פעמים.
8. קח מזרק של 10 מ"ל עם נולה מחט קהה.
   הערה: ניתן להכין חוט מחט קהה על ידי חיתוך קצה מחט נקייה וסטרילית. מחט 21 G ומחט 14 G שימשו כדי להפוך את הנולה עבור העכבר והעכברוש, בהתאמה.
9. מלא את המזרק במאגר סב(טבלה 1). מוציאים את כל בועות האוויר מהמזרק וממקמים אותו במנה השלישית בתנוחה זוויתית. תאבטחו את זה עם סרט הדבקה.
   הערה: עבור חולדות, פתרון A (טבלה 2) שימש במקום מאגר התזת מיוצייט.
10. הכן קשר רופף עם תפר כירורגי והניע אותו סביב המחט.
11. להזריק את העכבר עם הפרין (100 יחידות USP / עכבר) על ידי הזרקת תוך אפרטינול, 20 דקות לפני הזרקת ההרדמה.
12. הפיצו את מאגר התזת המיוציטים (טבלה 1) דרך מערכת ההתזמה. הפחת את קצב הזרימה ל- 3 מ"ל/דקה.
    הערה: עבור חולדות, פתרון A (טבלה 2) שימש במקום מאגר התזת מיוצייט.
13. לאחר 5 דקות, החלף את מאגר הזיתות בתמיסת האנזים(טבלה 1). הרוויה בתמיסת האנזימים בחמצן במהלך התהליך. השתמש בקצב זרימה של 3 מ"ל/דקה.
    הערה: עבור בידוד CM חולדה, השתמש בפתרון E (טבלה 2) במקום זאת.
14. להרדים את העכבר על ידי הזרקת הרדמה תוך-אפרטונית. השתמש במינון המתאים של הרדמה, מומלץ על ידי IACUC, לניתוח מסוף.
15. אשר עומק מספיק של הרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטת בהון. לאחר מכן, שים את העכבר על הפלטפורמה הכירורגית.

2. חילוץ לב מעכברים בוגרים (וחולדות)

1. לחטא את העור על ידי ניגוב עם 70% אלכוהול.
2. פתח בזהירות את התיבה.
3. תמחק את הלב. הימנע מרקמות שאינן לב במהלך החתך.
4. מניחים את הלב על המנה הראשונה, מלאה במאגר התועה(שולחן 1).
   הערה: השתמש בפתרון A עבור החולדה (טבלה 2).
5. לנקות את הדם מהלב על ידי לסחוט בעדינות.
6. מעבירים את הלב למנה השנייה.
7. לנקות את הדם מהלב ולהסיר רקמות שאינן לב. לאחר מכן, להעביר את הלב למנה השלישית.
8. לקצץ את הריאות ורקמות אחרות שמסביב ולנקות דרך עורקים עולה. יש לבצע הליך זה במהירות האפשרית (<5 דקות) כדי לשפר את האיכות והכמות של CM.

3. עיכול הלב

1. עיכול לב העכבר
   הערה: כל הפתרונות/מאגרים המוסדורים דרך לב העכבר צריכים להיות מחומצנים לאורך כל ההליך.
   1. בזהירות להסיר את מחט הקנולטה מהמזרק ולחבר אותו ל-Langendorff perfusion app app apparatus.
   2. הימנע מבועות אוויר שנכנסות ללב, מה שעשוי להשפיע על הזרימה של תמיסת האנזים והעיכול.
   3. הזז את מעיל המים למעלה כדי לספק סביבה הומוגנית ללב. אפשר לתמיסת האנזים לזרום דרך הלב במהירות של 2-3 מ"ל/דקה.
      הערה: המהירות של הפתרון החולף היא קריטית ויש לה השפעה משמעותית על התוצאה של כמות ואיכות CM.
   4. תן לתמיסת האנזים לזרום דרך הלב במשך 2 דקות.
   5. ב 2 דקות, להוסיף 40 μL של 100 μM CaCl_{2 פתרון} אנזים ולערבב. תנו לתמיסת האנזים לעבור דרך הלב עוד 10-15 דקות.
      הערה: ברגע שהזרימה הופכת חלקה, הלב הופך חום ורך, מה שמצביע על התפלגות שווה של אנזים הקולגן ועיכול תקין של הלב.
2. עיכול לב העכברוש
   הערה: כל הפתרונות/מאגרים המסתובבים דרך לב החולדה צריכים להיות מחומצנים לאורך כל ההליך.
   1. בזהירות להסיר את מחט הקנולטה מהמזרק ולחבר אותו ל-Langendorff perfusion app app apparatus.
   2. הימנע מבועות אוויר שנכנסות ללב, מה שעשוי להשפיע על הזרימה של תמיסת האנזים והעיכול.
   3. הזז את מעיל המים למעלה כדי לספק סביבה הומוגנית ללב.
   4. התחל את זרימת תמיסה A במהירות של 2-3 מ"ל/דקה למשך 3-5 דקות כדי להסיר דם מהלב.
      הערה: מהירות הפתרון העובר היא קריטית ויש לה השפעה משמעותית על התוצאה של איכות CM.
   5. לאחר ניקוי הדם מהלב, עבור מפתרון א' לפתרון E(שולחן 2). תמיסת Titrate E עם CaCl₂ כפי שצוין להלן עבור ריכוז סופי של 0.1 mM בפתרון:
      1. לאחר 10 דקות של עירוי, להוסיף 12.5 μL של 0.1 M CaCl₂.
      2. לאחר 15 דקות של תב, להוסיף 25 μL של 0.1 M CaCl₂.
   6. תנו לתמיסת האנזים לעבור דרך הלב עוד 30-40 דקות, עד שהזרימה הופכת מהירה והלב גמיש.

4. הכנת מתלה חד-תאי CM

1. הכנת מתלה חד-תאי CM (עכבר)
   1. הסר את הלב ממערכת התזת לנגנדורף. מעבירים אותה לצלחת פטרי 60 מ"מ מלאה בתמיסת אנזימים ב-5 מ"ל ומעבירים את המנה למכסה המנוע של ה-biosafety.
      הערה: הקפיטו עיכול לב מספיק לפני הסרת הלב ממערכת ההתזמה לנגנדורף. זמן העיכול תלוי בפעילות האנזימים, בזרימת התמיסה ובגודל הלב.
   2. לבצע כל הפרדה מכנית נוספת בשכונה בטיחות ביולוגית כדי להבטיח עקירות ולהימנע מזיהום.
   3. בזהירות להסיר את atria (1/4^th של חלק הלב בסיס) ורקמות שומן נוספות.
   4. טחון את הלב עם מפס לחתיכות בסדר.
   5. קח פיפטת פסטר סטרילית וחתוך את הקצה שלה בזווית של 45º.
   6. השתמש פיפטה פסטר זה כדי לחלק את רקמת הלב בהשעיה של תא יחיד על ידי pipetting עדין. עיכול אופטימלי מספק השעיה של קרדיומיוקיטים חד-תאיים.
      הערה: הסר את החלק התחתון הצר של צינור ההעברה כדי להפחית את נזקי CM עקב צנרת מכנית.
   7. לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל של פתרון עצירה כדי לעצור את פעילות האנזימים, אשר מונע את האפשרות של עיכול יתר.
   8. קח חסום 50 מ"ל טרי ולהניח מסננת תא סטרילית 100 μm על זה.
   9. להעביר את מתלה cardiomyocyte דרך מסננת התא כדי להסיר את נתח הרקמה. שוטפים את צלחת פטרי ומסננת עם עוד 5 מ"לשל תמיסת עצירה ( שולחן 1) כדי לאסוף את כל cardiomyocytes שנשאר מחובר מסננת.
2. הכנת מתלה חד-תאי CM (חולדה)
   1. הסר את הלב ממערכת התזת לנגנדורף. מעבירים את הלב לצלחת פטרי 100 מ"מ מלאה ב-5 מ"ל של תמיסה א' ומעבירים את המנה למכסה המנוע של ה-biosafety.
      הערה: הקפיטו עיכול לב מספיק לפני הסרת הלב ממערכת ההתזמה לנגנדורף. זמן העיכול תלוי בפעילות האנזימים, בזרימת התמיסה ובגודל הלב.
   2. לבצע כל הפרדה מכנית נוספת בשכונה בטיחות ביולוגית כדי להבטיח עקירות ולהימנע מזיהום.
   3. בזהירות להסיר את atria (1/4th של חלק הלב בסיס) ורקמות שומן נוספות.
   4. טחון את הלב עם מפס לחתיכות בסדר.
   5. קח פיפטת פסטר סטרילית וחתוך את הקצה שלה בזווית של 45º.
   6. השתמש פיפטה פסטר זה כדי לחלק את רקמת הלב בהשעיה חד-תאית על ידי pipetting עדין. עיכול אופטימלי מספק השעיה של קרדיומיוקיטים חד-תאיים.
      הערה: הסר את החלק התחתון הצר של צינור ההעברה כדי להפחית את נזקי CM עקב צנרת מכנית.
   7. הוסף 5 מ"ל של פתרון B(טבלה 2)להתליית CM ולהעביר את הפתרון דרך מסננת תא 100 μm כדי להסיר את כל חתיכות שנותרו של שומן או רקמה אחרת שאינה מעכלת.
   8. לאסוף את הסינון בבקתון חרסי טרי 50 מ"ל.
   9. השתמש עוד 5 מ"ל של פתרון B כדי לשטוף את צלחת פטרי וכל CM שנותר דרך מסננת התא.

5. הסרת הודעות שאינן CMs

1. הסרת הודעות שאינן הודעות CMs מהמתלה של תא יחיד למבוגרים (עכבר)
   1. צנטריפוגה מתלה התא ב 20 x g במשך 3 דקות.
   2. בטל את supernatant והשתמש מחדש את התאים ב- 10 מ"ל של פתרון עצירה (טבלה 1).
      הערה: הגדלת הריכוז של BSA בפתרון העצירה תגביר את צמיגותה ותפחית את קצב המפסקים של משתמשים שאינם CMs.
   3. תוסתר מחדש את נותן MS על ידי היפוך עדין של הצינור 3-5 פעמים.
   4. במרווחי זמן של 3 דקות, הוסף 10 μL של 100 μM CaCl_{2 פתרון} ולערבב. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
   5. לאחר התוספת הרביעית, צנטריפוגה מתלה cardiomyocyte ב 20 x g במשך 3 דקות.
   6. זרוק את הסופרנטנט.
   7. תוסתור מחדש ב-CMs מחום מראש (37 ºC), מדיית ציפוי CM עכבר מבוגר(טבלה 3).
2. הסרת הודעות שאינן הודעות מ- CMs מהמתלים של תאים בודדים למבוגרים (חולדה)
   1. כדורי ב 20 x g במשך 3 דקות ב 25 ºC.
   2. בטל את supernatant וכנס מחדש את התאים לתוך 25 מ"ל של פתרון B(טבלה 2).
   3. מערבבים את התאים על ידי היפוך עדין ולמקם אותו בעמדה צינור כדי לאפשר CM להתיישב תחת כוח הכבידה.
   4. השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
   5. לתוספות מחדש את התאים טרי 25 מ"ל של פתרון B ו titrate זה 1.0 mM CaCl_{2 על} ידי תוספת צעד של 50 μL, 75 μL, ו 100 μL של 0.1 M CaCl₂ במרווחי 3-5 דקות.
      הערה: בשלב זה ניתן להשתמש בריכוז גבוה יותר של BSA בפתרון B. הגדלת הריכוז של BSA בפתרון B מגבירה את צמיגות ובכך, מפחיתה את קצב המ המום של משתמשים שאינם CMs.
   6. כדוריות ב 20 x g עבור 3 דקות ב 25 ºC, לשאוף supernatant, ולהוסיף את הנפח הרצוי של מדיה תרבות תא חולדה למבוגרים(טבלה 4).
   7. זרעים CMs על צלחת מצופה למימינין.
      הערה: ניתן להשתמש בציפוי מראש של CMs על לוח תרבות שאינו מצופה כדי למזער את הזיהום של תאים שאינם CM.

6. ציפוי CM למבוגרים

1. ציפוי מראש
   1. תוסתה מחדש את הקרדיומיוציטים לתקשורת התרבות.
   2. מראש צלחת התאים לתוך צלחת 60 מ"מ או 100 מ"מ עבור עכבר או חולדה CM, בהתאמה.
   3. דגירה CMs עבור 2 שעות באינקובטור בתוספת 5% CO₂ ב 37 ºC.
   4. במהלך הדגירה pre-plate, לכסות את צלחות תרבות התא עם למינין (10 μg / מ"ל ב PBS) עבור תרבות CM לטווח ארוך.
2. לאחר 2 שעות של ציפוי מראש, לאסוף CMs בבקתון חסוני 50 מ"ל.
3. לאסוף את התאים מהצלחת וצלחת מחדש אותם לתוך למינין מצופה 24 צלחת תרבות גם לניסויים טרנסאפציה.
4. תאי תרבות באינקובטור ב 37 ºC בתוספת 5% עם CO₂. 4-6 שעות מספיק כדי לדבוק cardiomyocytes עם פני השטח, ולכן, transfection יכול להתבצע 6 שעות לאחר ציפוי.
   הערה: מדיום הציפוי המכיל FBS משמש בדרך כלל ומראה תאימות טובה יותר עם מחקרי התפשטות. עם זאת, אמצעי ללא סרום יכול לשמש לניסויים שבהם גורמים הפרשה מנותחים.

7. תברה

1. דגירה CMs לצלחת תרבות התא מצופה למינין במשך 4-6 שעות.
2. ארבע שעות לאחר זריעת CM על הלוח מצופה למימינין, להחבת תאים עם siRNAs (50 nM) של עניין באמצעות ריאגנט transfection (למשל, Lipofectamine RNAiMAX) על פי פרוטוקול היצרן.
3. שנה מדיה 24 שעות לאחר הטרנס-תעבורה וכל 24 שעות לאחר מכן למשך עד 20 יום.
4. לאחר 20 ימים, לתקן תאים עם 4% PFA ב PBS עבור יישומים במורד הזרם, כולל immunocytochemistry עבור סמנים ספציפיים לב כגון Troponin כדי להבטיח cardiomyocytes חיים היו תרבותיים בהצלחה לטווח ארוך.

תוצאות

הפרוטוקול הנוכחי שונה מאפשר בידוד יעיל ותרבות של חולדות ועכברים CMs במבחנה. עבור חולדה CM בידוד, בסך הכל 3 מבוגר (12 שבועות) זכר פישר 344 חולדות שימשו בהליך. איור 1 מציג את הגדרות הציוד הכירורגי והבידוד הנדרשות בהליך; כל חלק סומן ותואר במקרא הדמות. קולגנס סוג 2 שימש לעיכול, אשר מניב ...

Discussion

יש צורך קריטי להקים פרוטוקול לבידוד cardiomyocyte למבוגרים ותרבות לטווח ארוך כדי לבצע מחקרים מכניים ספציפיים לתא. יש רק כמה דיווחים דנים פרוטוקולי בידוד CM למבוגרים, ואפילו פחות מהם משמשים לתרבות ארוכת טווח של עכברים בוגרים CM^15,16,17. זה הראו כי CM ח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butane Dione monoxime	Sigma-Aldrich	B-0753
Blebbistatin	APExBIO	B1387
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709
Cell culture plate	Corning Costar	3526
Cell strainer	BD Biosciences	352360
Cel-miR-67	Dharmacon	CN-001000-01-50
Collagenase type2	Worthington	LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes	Sigma-Aldrich	Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Thermo Scientific	SH30022.01
EdU	Life Technologies	C10337
Fetal bovine serum	Corning	35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps	Fisherbrand	22-327379
Glucose	Sigma-Aldrich	G-5400
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	PSLAB-018285-02
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-128
Hyaluronidase	Sigma	H3506
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P-8281
KCl	Sigma-Aldrich	746436
Light Microscope	Nikon
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778-150
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-2643
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
Natural Mouse Laminin	Invitrogen	23017-015
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Pentobarbital	Henry Schein	24352
Phosphate buffered saline	Life Technologies	20012-027
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147-1G
Selenium	Sigma-Aldrich	229865+5G
siMeis2	Dharmacon	s161030
siRb1	Dharmacon	s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors	Fisher Scientific	28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-120
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor	Fisherbrand	22-079-747
Water Bath	Fisher Scientific	3006S