Isolamento, Transfecção e Cultura de Longo Prazo de Cardiomiócitos de Ratos Adultos e Ratos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, transfecção e cultura de longo prazo de cardiomiócitos adultos de camundongos e ratos.

Resumo

A cultura ex vivo dos cardiomiócitos mamíferos adultos (CMs) apresenta o sistema experimental mais relevante para o estudo in vitro da biologia cardíaca. Os CMs de mamíferos adultos são células terminais diferenciadas com capacidade proliferativa mínima. O estado pós-mitótico dos CMs adultos não só restringe a progressão do ciclo celular cardiomiócito, mas também limita a cultura eficiente dos CMs. Além disso, a cultura de longo prazo dos CMs adultos é necessária para muitos estudos, como a proliferação de CM e a análise da expressão genética.

O rato e o rato são os dois animais de laboratório mais preferidos para serem usados para o isolamento cardiomiócito. Embora a cultura de longo prazo dos CMs de ratos seja possível, os CMs de camundongos adultos são suscetíveis à morte e não podem ser cultivados por mais de cinco dias em condições normais. Portanto, há uma necessidade crítica de otimizar o isolamento celular e o protocolo de cultura de longo prazo para CMs murine adultos. Com este protocolo modificado, é possível isolar e cultivar com sucesso tanto os CMs de ratos adultos quanto os de ratos por mais de 20 dias. Além disso, a eficiência de transfecção do SIRNA de CM isolado é significativamente aumentada em relação aos relatórios anteriores. Para o isolamento cm do rato adulto, o método de perfusão langendorff é utilizado com uma solução enzimática ideal e tempo suficiente para dissociação completa da matriz extracelular. Para obter CMs ventriculares puros, ambos os átrios foram dissecados e descartados antes de prosseguir com a dissociação e o revestimento. As células foram dispersadas em uma placa revestida de laminina, o que permitiu uma fixação eficiente e rápida. Os CMs foram autorizados a se contentar com 4-6 h antes da transfecção do siRNA. A mídia cultural foi atualizada a cada 24 horas por 20 dias e, posteriormente, os CMs foram fixados e manchados para marcadores específicos cardíacos, como troponina e marcadores do ciclo celular, como KI67.

Introdução

As doenças cardíacas são uma das principais causas de morte em todo o mundo. Quase todos os tipos de lesão cardíaca resultam em uma perda significativa de cardiomiócitos adultos (CMs). Corações de mamíferos adultos são incapazes de reparar sua lesão cardíaca devido à natureza senescente do cm^{adulto 1}. Assim, qualquer insulto ao coração mamífero adulto resulta em uma perda permanente de CMs, levando à redução da função cardíaca e insuficiência cardíaca. Ao contrário dos mamíferos adultos, pequenos animais como zebrafish e newt hearts podem regenerar sua lesão cardíaca através da proliferação cm existente^2,3,4. Um esforço mundial está em andamento para encontrar uma nova intervenção terapêutica para lesões cardíacas através de abordagens proliferativas e não proliferativas. Nas últimas décadas, vários tipos de modelos genéticos de camundongos foram desenvolvidos para estudar lesões cardíacas e reparos. No entanto, o uso de modelos in vivo animal continua a ser uma abordagem cara com a complexidade adicional para decifrar um mecanismo de célula-autônoma a partir de efeitos secundários. Além disso, os sistemas in vivo são desafiadores para analisar os efeitos específicos do CM de uma intervenção farmacológica que induz a sinalização cardioprotetora do CM.

Além disso, a cultura de longo prazo dos CMs adultos é necessária para realizar análises de proliferação de CM. Os ensaios de proliferação de CM requerem um mínimo de 4-5 dias para que as células sejam induzidas no ciclo celular e obtenham dados precisos depois disso. Além disso, estudos que utilizam CMs isolados para estudos eletrofisiológicos, triagem de medicamentos, estudos de toxicidade e estudos de homeostase Ca⁺⁺ estão todos precisando de um sistema de cultura melhorado^5,,6,7. Além disso, estudos recentes mostram a significância cardioprotetora das citocinas secretadas dos CMs (cardiocinas)^8,9. Para investigar o papel terapêutico e o mecanismo molecular desses cardiocinas durante a reparação e regeneração cardíaca, é necessária uma cultura prolongada.

CMs de ratos adultos são robustos o suficiente para isolamento de células únicas e cultura de longo prazo em um sistema in vitro^10,,11,,12. No entanto, os CMs de mouse adultos são de grande interesse para ensaios in vitro, devido à disponibilidade de uma variedade de modelos de mouse geneticamente modificados, o que permite o design e a execução de várias análises inovadoras que não são possíveis com o rato CM¹³. Em contraste com o isolamento cm de ratos adultos, é bastante desafiador obter uma suspensão unicelular de corações de ratos adultos, e a cultura de longo prazo de CMs de camundongos adultos na cultura é ainda mais desafiadora.

O isolamento cm adulto de corações de camundongos e ratos usando um sistema Langendorff foi previamente estabelecido para estudar a função CM^5,,14,15. Aqui, descrevemos em detalhes os protocolos para o isolamento de CM adultos de ratos e camundongos, bem como uma cultura modificada a longo prazo, transfecção e proliferação de CM de células isoladas.

Protocolo

Todos os experimentos devem ser realizados de acordo com as diretrizes do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA (NIH). Todos os protocolos exibidos no vídeo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Cincinnati, Faculdade de Medicina.

1. Preparação antes da extração cardíaca de camundongos adultos (e ratos)

1. Prepare as soluções correspondentes de perfusão, enzima e parada, de acordo com as receitas dadas na Tabela 1 e Tabela 2, para isolamento de ratos e ratos, respectivamente. Filtre as soluções através de um filtro de 0,22 μm para remover qualquer contaminação ou partículas não resolvidas.
2. Limpe e esterilize os instrumentos cirúrgicos, absorvendo-os em 70% de álcool por 15 minutos e, posteriormente, lave com água destilada dupla. Deixe as ferramentas secas em uma toalha de papel limpa.
3. Pré-aqueça o banho de água a 37 ºC. Verifique o nível de água no banho de água para garantir uma circulação ininterrupta de água morna através do aparelho de perfusão durante o procedimento.
4. Limpe o aparelho de perfusão correndo com 70% de álcool por 5 minutos. Repita.
   NOTA: Aumente a vazão, o que ajuda a limpar a tubulação.
5. Após o fluxo de álcool, limpe os restos de álcool correndo água duplamente destilada por 10 minutos.
6. Configure 3 pratos descartáveis de poliestireno de tamanho médio para limpar o coração após a excisão. Encha os pratos com 20 mL de tampão de miócito.
7. Adicione 2-3 gotas de heparina em cada prato com a ajuda da pipeta Pasteur e misture bem por pipetar várias vezes.
8. Pegue uma seringa de 10 mL com uma cânula de agulha cega.
   NOTA: Uma cânula de agulha sem corte pode ser preparada cortando a ponta de uma agulha limpa e estéril. Uma agulha de 21 G e uma agulha de 14 G foram usadas para fazer a cânula para o rato e o rato, respectivamente.
9. Encha a seringa com tampão de perfusão(Tabela 1). Remova quaisquer bolhas de ar da seringa e coloque-a no terceiro prato em uma posição angular. Segure-o com fita adesiva.
   NOTA: Para ratos, a Solução A (Tabela 2) foi utilizada em vez de tampão de perfusão de miócito.
10. Prepare um nó solto com uma sutura cirúrgica e coloque-o ao redor da agulha.
11. Injete no camundongo heparina (100 unidades/rato) por injeção intraperitoneal, 20 minutos antes da injeção de anestesia.
12. Circule o tampão de perfusão do miócito(Tabela 1)através do aparelho de perfusão. Diminua a vazão para 3 mL/min.
    NOTA: Para ratos, a Solução A (Tabela 2) foi utilizada em vez de tampão de perfusão de miócito.
13. Após 5 min, substitua o tampão de perfusão pela solução enzimápica(Tabela 1). Saturar a solução enzimápica com oxigênio durante o processo. Use uma taxa de fluxo de 3 mL/min.
    NOTA: Para o isolamento cm do rato, use a solução E (Tabela 2) em vez disso.
14. Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal de anestesia. Use a dose apropriada de anestesia, recomendada pelo IACUC, para a cirurgia terminal.
15. Confirme a profundidade suficiente da anestesia pela falta de uma resposta a uma pitada de dedo do dedo do sol. Então, coloque o rato na plataforma cirúrgica.

2. Extração de coração de ratos adultos (e ratos)

1. Esterilize a pele limpando com 70% de álcool.
2. Abra cuidadosamente o peito.
3. Extir suascções o coração. Evite tecidos não cardíacos durante a excisão.
4. Coloque o coração no primeiro prato, recheado com tampão de perfusão(Tabela 1).
   NOTA: Use a solução A para o rato(Tabela 2).
5. Limpe o sangue do coração apertando suavemente.
6. Transfira o coração para o segundo prato.
7. Limpe o sangue do coração e remova tecidos não cardíacos. Posteriormente, transfira o coração para o terceiro prato.
8. Corte os pulmões e outros tecidos circundantes e cannulate através da aorta ascendente. Este procedimento deve ser realizado o mais rápido possível (<5 min) para melhorar a qualidade e quantidade de CM.

3. Digestão do coração

1. Digestão do coração do rato
   NOTA: Todas as soluções/buffers que circulam pelo coração do rato devem ser oxigenadas durante todo o procedimento.
   1. Remova cuidadosamente a agulha cannulante da seringa e conecte-a ao aparelho de perfusão langendorff.
   2. Evite que quaisquer bolhas de ar entrem no coração, o que pode afetar o fluxo da solução e digestão da enzima.
   3. Mova a jaqueta de água para fornecer um ambiente homogêneo ao coração. Permita que a solução enzimápica flua através do coração a uma velocidade de 2-3 mL/min.
      NOTA: A velocidade da solução de passagem é crítica e tem um impacto significativo no resultado da quantidade e qualidade do CM.
   4. Deixe a solução enzimápica fluir pelo coração por 2 minutos.
   5. Em 2 min, adicione 40 μL de solução cacl₂ de 100 μM à solução esticada e misture. Deixe a solução enzimánica passar pelo coração por mais 10-15 minutos.
      NOTA: Uma vez que o fluxo fica liso, o coração fica acastulico e macio, indicando a distribuição uniforme da enzima colagenase e a digestão adequada do coração.
2. Digestão do coração de rato
   NOTA: Todas as soluções/tampões que circulam pelo coração do rato devem ser oxigenadas durante todo o procedimento.
   1. Remova cuidadosamente a agulha cannulante da seringa e conecte-a ao aparelho de perfusão langendorff.
   2. Evite que quaisquer bolhas de ar entrem no coração, o que pode afetar o fluxo da solução e digestão da enzima.
   3. Mova a jaqueta de água para fornecer um ambiente homogêneo ao coração.
   4. Inicie o fluxo da solução A a uma velocidade de 2-3 mL/min por 3-5 min para remover qualquer sangue do coração.
      NOTA: A velocidade da solução de passagem é crítica e tem um impacto significativo no resultado da qualidade cm.
   5. Uma vez que o sangue seja retirado do coração, mude da solução A para a solução E(Tabela 2). Solução de titulação E com CaCl₂ como indicado abaixo para uma concentração final de 0,1 mM em solução:
      1. Após 10 min de perfusão, adicione 12,5 μL de 0,1 M CaCl₂.
      2. Após 15 min de perfusão, adicione 25 μL de 0,1 M CaCl₂.
   6. Deixe a solução enzimátil passar pelo coração por mais 30-40 minutos, até que o fluxo se torne rápido e o coração seja flexível.

4. Preparação da suspensão de célula única CM

1. Preparação da suspensão de célula única CM (mouse)
   1. Remova o coração do sistema de perfusão langendorff. Mova-o para uma placa de Petri de 60 mm cheia de 5 mL de solução enzimada e transfira o prato para um capô de biossegurança.
      NOTA: Certifique-se de digestão cardíaca suficiente antes de remover o coração do sistema de perfusão langendorff. O tempo de digestão depende da atividade enzimápica, do fluxo de solução e do tamanho do coração.
   2. Realize qualquer outra desagregação mecânica em um capô de biossegurança para garantir a esterilidade e evitar contaminação.
   3. Remova cuidadosamente a atria (1/4^th da porção do coração basal) e os tecidos de gordura extra.
   4. Pique o coração com fórceps em pedaços finos.
   5. Pegue uma pipeta Pasteur estéril e corte sua ponta em um ângulo de 45º.
   6. Use esta pipeta Pasteur para dispensar o tecido cardíaco em uma suspensão de célula única por pipetação suave. A digestão ideal proporciona uma suspensão de cardiomiócitos unicelulares.
      NOTA: Remova a porção estreita e inferior da tubulação de transferência para reduzir os danos de CM devido ao searing mecânico.
   7. Em seguida, adicione 5 mL de solução stop para parar a atividade enzimático, o que evita a possibilidade de superdigestão.
   8. Pegue um cônico de 50 mL fresco e coloque um coador de células de 100 μm estéril sobre ele.
   9. Passe a suspensão do cardiomiócito através do coador celular para remover o pedaço de tecido. Lave a placa de Petri e o coador com mais 5 mL de solução de parada(Tabela 1) para coletar quaisquer cardiomiócitos que permaneçam presos ao coador.
2. Preparação da suspensão de célula única CM (rato)
   1. Remova o coração do sistema de perfusão langendorff. Mova o coração para uma placa de Petri de 100 mm cheia de 5 mL de solução A e mova a placa para um capô de biossegurança.
      NOTA: Certifique-se de digestão cardíaca suficiente antes de remover o coração do sistema de perfusão langendorff. O tempo de digestão depende da atividade enzimápica, do fluxo de solução e do tamanho do coração.
   2. Realize qualquer outra desagregação mecânica em um capô de biossegurança para garantir a esterilidade e evitar contaminação.
   3. Remova cuidadosamente a atria (1/4 da porção do coração basal) e os tecidos de gordura extra.
   4. Pique o coração com fórceps em pedaços finos.
   5. Pegue uma pipeta Pasteur estéril e corte sua ponta em um ângulo de 45º.
   6. Use esta pipeta Pasteur para dispensar o tecido cardíaco em suspensão unicelular por tubulação suave. A digestão ideal proporciona uma suspensão de cardiomiócitos unicelulares.
      NOTA: Remova a porção estreita e inferior da tubulação de transferência para reduzir os danos de CM devido ao searing mecânico.
   7. Adicione 5 mL de solução B(Tabela 2) à suspensão CM e passe a solução através de um coador de células de 100 μm para remover quaisquer pedaços restantes de gordura ou outro tecido não digerido.
   8. Colete filtrado em um frasco cônico fresco de 50 mL.
   9. Use outros 5 mL de solução B para lavar a placa de Petri e qualquer CM restante através do coador celular.

5. Remoção de não-CMs

1. Remoção de não-CMs da suspensão de célula única adulta (mouse)
   1. Centrifugar a suspensão da célula a 20 x g por 3 min.
   2. Descarte o supernasce e resuspenque as células em 10 mL de solução stop(Tabela 1).
      NOTA: Aumentar a concentração de BSA na solução stop aumentará sua viscosidade e reduzirá a taxa de sedimentação de não-CMs.
   3. Resuspenda os CMs por inversão suave do tubo 3-5 vezes.
   4. Em intervalos de 3 minutos, adicione 10 μL de solução cacl₂ de 100 μM e misture. Repita três vezes.
   5. Após a quarta adição, centrifugar a suspensão cardiomiocócica em 20 x g por 3 min.
   6. Descarte o supernaspeso.
   7. CMs de resuspend em pré-aquecido (37 ºC), mouse adulto CM plating media(Tabela 3).
2. Remoção de não-CMs das suspensões unicelulares adultas (rato)
   1. Células de pelota a 20 x g por 3 min a 25 ºC.
   2. Descarte o supernasce e resuspenque as células em 25 mL de solução B(Tabela 2).
   3. Misture as células por inversão suave e coloque-a em um suporte de tubo para permitir que o CM se instale sob gravidade.
   4. Descarte cuidadosamente o supernaspe.
   5. Resuspenncie as células em 25 mL frescos de solução B e titule-as a 1,0 mM CaCl₂ por adição stepwise de 50 μL, 75 μL e 100 μL de 0,1 M CaCl₂ em intervalos de 3-5 min.
      NOTA: Uma maior concentração de BSA na solução B poderia ser usada nesta etapa. O aumento da concentração de BSA na solução B aumenta a viscosidade e, portanto, reduz a taxa de sedimentação de não-CMs.
   6. Células de pelota a 20 x g por 3 min a 25 ºC, aspiram o supernasciente e adicionam o volume desejado de mídia de cultura de células de ratos adultos(Tabela 4).
   7. CMs de sementes em uma placa revestida de laminina.
      NOTA: O pré-revestimento de CMs em uma placa de cultura não revestida pode ser usado para minimizar a contaminação de células não-CM.

6. Chapeamento cm adulto

1. Pré-revestimento
   1. Resuspend os cardiomiócitos na mídia cultural.
   2. Pré-emplacar as células em uma placa de 60 mm ou 100 mm para o rato ou rato CM, respectivamente.
   3. Incubar CMs por 2h em uma incubadora suplementada com 5% de CO₂ a 37 ºC.
   4. Durante a incubação pré-placa, cubra as placas de cultura celular com laminina (10 μg/mL em PBS) para a cultura cm de longo prazo.
2. Após 2h de pré-revestimento, colete CMs em um frasco cônico de 50 mL.
3. Colete as células do prato e reempla-las em uma placa de cultura revestida de laminina 24 poços para experimentos de transfecção.
4. Células de cultura em uma incubadora a 37 ºC suplementadas com 5% com CO₂. 4-6 horas é suficiente para aderir aos cardiomiócitos com a superfície e, assim, a transfecção pode ser realizada 6 horas após o revestimento.
   NOTA: O meio de revestimento contendo FBS é comumente utilizado e mostra melhor compatibilidade com estudos de proliferação. No entanto, um meio livre de soro pode ser usado para experimentos onde fatores secretos estão sendo analisados.

7. Transfecção

1. Incubar os CMs nas placas de cultura celular revestidas com laminina por 4-6 horas.
2. Quatro horas após a semeadura cm na placa revestida de laminina, as células transfectam com siRNAs (50 nM) de interesse usando um reagente de transfecção (por exemplo, Lipofectamine RNAiMAX) de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Mude a mídia 24 horas após a transfecção e a cada 24 horas depois disso por até 20 dias.
4. Após 20 dias, fixe células com 4% de PFA em PBS para aplicações a jusante, incluindo imunocittoquímica para marcadores específicos cardíacos, como troponina, para garantir que cardiomiócitos vivos foram cultivados com sucesso a longo prazo.

Resultados

O protocolo modificado atual permite o isolamento eficiente e a cultura de CMs de ratos e ratos in vitro. Para o isolamento do CM do rato, foram utilizados no procedimento um total de 3 adultos (12 semanas de idade) macho Fischer 344 ratos. A Figura 1 mostra o aparelho cirúrgico e as configurações de isolamento que são necessárias no procedimento; cada parte foi marcada e descrita na lenda da figura. A colagenase tipo 2 foi utilizada para digestão, o que produz uma alta quantidade de C...

Discussão

Há uma necessidade crítica de estabelecer um protocolo para o isolamento do cardiomiócito adulto e cultura de longo prazo para realizar estudos mecanicistas específicos para células. Existem apenas alguns relatórios discutindo protocolos de isolamento cm adulto, e ainda menos deles são usados para a cultura de longo prazo de camundongos adultos CM^15,,16,17. É demonstrado que o cm de rato adulto tem maior tolerância à c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butane Dione monoxime	Sigma-Aldrich	B-0753
Blebbistatin	APExBIO	B1387
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709
Cell culture plate	Corning Costar	3526
Cell strainer	BD Biosciences	352360
Cel-miR-67	Dharmacon	CN-001000-01-50
Collagenase type2	Worthington	LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes	Sigma-Aldrich	Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Thermo Scientific	SH30022.01
EdU	Life Technologies	C10337
Fetal bovine serum	Corning	35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps	Fisherbrand	22-327379
Glucose	Sigma-Aldrich	G-5400
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	PSLAB-018285-02
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-128
Hyaluronidase	Sigma	H3506
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P-8281
KCl	Sigma-Aldrich	746436
Light Microscope	Nikon
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778-150
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-2643
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
Natural Mouse Laminin	Invitrogen	23017-015
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Pentobarbital	Henry Schein	24352
Phosphate buffered saline	Life Technologies	20012-027
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147-1G
Selenium	Sigma-Aldrich	229865+5G
siMeis2	Dharmacon	s161030
siRb1	Dharmacon	s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors	Fisher Scientific	28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-120
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor	Fisherbrand	22-079-747
Water Bath	Fisher Scientific	3006S