成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養

要約

ここでは、成体マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、および長期培養のためのプロトコルを提示する。

要約

成人哺乳類心筋細胞(CM)のエクスビボ培養は、心臓生物学のインビトロ研究に最も関連する実験システムを提示する。成人哺乳類のCMは、増殖能力が最小の末端分化細胞である。成人CMのポストミトティック状態は、心筋細胞周期の進行を制限するだけでなく、CMの効率的な培養を制限します。また、CMの増殖や遺伝子発現の解析など、多くの研究には成人CMの長期培養が必要です。

マウスとラットは、心筋細胞の分離に使用される2つの最も好ましい実験動物である。ラットCMの長期培養は可能ですが、成虫マウスCMは死亡しやすく、通常の条件下では5日以上培養できません。したがって、成人マウスのCMの細胞分離および長期培養プロトコルを最適化する必要があります。この変更されたプロトコルを使用すると、成体マウスとラットの両方のCMを20日以上正常に分離および培養することが可能です。さらに、単離されたCMのsiRNAトランスフェクション効率は、以前の報告に比べて有意に増加する。成人マウスCMの分離のために、ランゲンドルフ灌流法は、最適な酵素溶液と完全な細胞外マトリックス解離のための十分な時間で利用される。純粋な心室CMを得るために、両方の心房を解剖し、解離およびめっきを進める前に廃棄した。細胞をラミニンコーティングされたプレート上に分散させ、効率的かつ迅速な付着を可能にした。CMは、siRNAトランスフェクションの前に4〜6時間沈着させた。培養培地を24時間ごとに20日間リフレッシュし、その後、トロポニンなどの心臓特異的マーカーやKI67などの細胞周期のマーカーについてCMを固定し染色した。

概要

心臓病は、世界中の主要な死因の一つです。ほとんどすべてのタイプの心障害は、成人心筋細胞(CM)の有意な喪失をもたらす。成人哺乳類の心臓は、成人のCM¹の老化性のために心臓損傷を修復することができない。したがって、成人哺乳類の心臓に対する侮辱は、CMの永久的な喪失をもたらし、心機能および心不全の減少をもたらす。成人哺乳類とは異なり、ゼブラフィッシュやイニュートハートのような小動物は、既存のCM増殖^{22、3、43,4}を通じて心臓損傷を再生することができる。世界的な取り組みは、増殖と不拡散の両方のアプローチを介して心臓傷害に対する新たな治療介入を見つけ出すために進行中である。過去数十年の間に、様々なタイプの遺伝的マウスモデルが心臓損傷および修復を研究するために開発された。しかし、in vivo動物モデルを使用することは、二次的な効果から細胞自律機構を解読するための追加の複雑さを伴う高価なアプローチであり続けています。また、生体内システムは、CMから心保護シグナル伝達を誘導する薬理学的介入のCM特異的効果を分析することは困難である。

さらに、CM増殖解析を行うためには、成人CMの長期培養が必要である。CM増殖アッセイは、細胞が細胞周期に誘導され、その後正確なデータを得るために最低4〜5日を必要とする。さらに、電気生理学的研究、薬物スクリーニング、毒性試験、およびCa⁺⁺ホメオスタシス研究のために単離されたCMを利用する研究は、すべて改善された培養系^5、6、76を必要^と7している。⁵さらに、最近の研究では、CM(カーディオカイン^)8,9,9から分泌されるサイトカインの心保護的意義を示す。心臓の修復と再生の間にこれらのカーディオキンの治療的役割と分子機構を調べるには、長期培養が必要である。

成人ラットのCMは、インビトロシステム^{10、11、12,11,12}における単細胞単細胞分離および長期培養に十分に堅牢である。しかし、成虫マウスCMは、ラットCM¹³では不可能な様々な革新的な分析の設計と実行を可能にする様々な遺伝子組み換えマウスモデルの入手可能性のために、インビトロアッセイに大きな関心を持っています。成体ラットCMの分離とは対照的に、成体マウスの心臓から単細胞懸濁液を得ることは非常に困難であり、培養中の成体マウスCMの長期的な培養はさらに困難である。

ランゲンドルフシステムを使用したマウスとラットの心臓からの成人のCM分離は、以前にCM機能^{55、14、1514,15}を研究するために確立されています。ここでは、ラットおよびマウスの両方からの成人CM単離のためのプロトコル、ならびに単離細胞の修飾された長期培養、トランスフェクション、およびCM増殖について詳細に説明した。

プロトコル

すべての実験は、米国国立衛生研究所(NIH)が発行する実験動物のケアと使用ガイドのガイドラインに従って行われるべきです。ビデオに表示されるすべてのプロトコルは、シンシナティ大学医学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 成体マウス(およびラット)からの心臓抽出前の調製

1. 対応する灌流、酵素、および停止液を、 表1 および 表2に示したレシピに従って、それぞれラットおよびマウスの単離のために調製する。0.22 μmフィルターでソリューションをフィルターし、汚染や未溶解の粒子を除去します。
2. 手術器具を70%アルコールに15分間浸して洗浄し、滅菌し、その後二重蒸留水で洗浄します。清潔なペーパータオルで空気乾燥するツールを残します。
3. 水浴を37ºCに予熱し、水浴中の水位を確認し、手順中に灌流装置を通して温水の中断のない循環を確認します。
4. 70%のアルコールを5分間実行して、灌流装置を洗浄します。
   注: 流量を増やすと、チューブのクリーニングに役立ちます。
5. アルコールの流れが通った後、二重蒸留水を10分間流してアルコールの残骸をきれいにします。
6. 切除後に心臓をきれいにするために、3つの中型使い捨てポリスチレン計量皿を設置します。20 mL のミオサイトバッファーで料理を満たします。
7. パスツールピペットの助けを借りて、各料理にヘパリンの2〜3滴を追加し、複数回ピペットすることによってよく混ぜます。
8. 鈍い針カニューレで10 mLの注射器を取ります。
   注:鈍い針カニューレは、清潔で無菌の針の先端を切断することによって調製することができます。マウスとラット用のカニューレをそれぞれ作るために21G針と14G針を用いた。
9. シリンジを灌流バッファーで満たす(表1)。シリンジから気泡を取り除き、斜めの位置で3番目の皿に入れます。テープで固定します。
   注:ラットの場合、溶液A(表2)は、筋細胞灌流バッファーの代わりに使用された。
10. 外科的縫合糸でゆるい結び目を準備し、針の周りに置きます。
11. 腹腔内注射でヘパリン(100 USP単位/マウス)をマウスに注入し、麻酔注射の20分前に注射します。
12. ミオサイト灌流緩衝液(表1)を灌流装置を通して循環させる。流量を3 mL/minに下げます。
    注:ラットの場合、溶液A(表2)は、筋細胞灌流バッファーの代わりに使用された。
13. 5分後、酵素溶液で灌流バッファーを交換する(表1)。プロセス中に酵素溶液を酸素で飽和させます。流量は3 mL/minで行います。
    注: ラット CM 分離の場合は、代わりにソリューション E (表 2) を使用してください。
14. 麻酔の腹腔内注射によりマウスを麻酔する。IACUCが推奨する麻酔の適切な用量を末端手術に使用する。
15. つま先ピンチに対する応答の欠如によって麻酔の十分な深さを確認します。次に、外科用プラットフォームにマウスを置きます。

2. 成体マウス(およびラット)からの心臓の抽出

1. 70%アルコールで拭いて皮膚を殺菌する。
2. 慎重に胸を開きます。
3. 心を物品切りする。切除中の非心臓組織は避けてください。
4. 灌流バッファーで満たされた最初の皿に心臓を置く(表1)。
   注: ラットのソリューション A を使用します (表 2)。
5. 穏やかに絞ることによって心臓から血液をクリアします。
6. ハートを2番目の料理に移します。
7. 心臓から血液をきれいにし、非心臓組織を除去します。その後、心臓を3番目の皿に移します。
8. 肺および他の周囲の組織を切り取り、上昇大陸を介してカニュール。CMの品質と量を改善するために、この手順はできるだけ迅速に(<5分)実行する必要があります。

3. 心の消化

1. マウス心臓の消化
   注:マウスの心臓を通して循環するすべてのソリューション/バッファは、手順全体で酸素化する必要があります。
   1. 慎重に注射器からカニューラシング針を取り出し、ランゲンドルフ灌流装置に接続します。
   2. 心臓に入る気泡を避け、酵素溶液の流れや消化に影響を与える可能性があります。
   3. ウォータージャケットを上に移動して、均質な環境を心臓に提供します。酵素溶液が2-3 mL/minの速度で心臓を流れるようにします。
      注: 通過ソリューションの速度は非常に重要であり、CMの量と品質の結果に大きな影響を与えます。
   4. 酵素溶液が心臓を2分間流します。
   5. 2分で、酵素溶液に40μLの100μM_CaCl2 溶液を加えて混合します。酵素溶液が心臓を通過してさらに10〜15分間通過させます。
      注:流れが滑らかになると、心臓は茶色く柔らかくなり、コラゲナーゼ酵素の均等な分布と心臓の適切な消化を示します。
2. ラット心臓の消化
   注:ラット心臓を通って循環するすべてのソリューション/バッファは、手順全体で酸素化する必要があります。
   1. 慎重に注射器からカニューラシング針を取り出し、ランゲンドルフ灌流装置に接続します。
   2. 心臓に入る気泡を避け、酵素溶液の流れや消化に影響を与える可能性があります。
   3. ウォータージャケットを上に移動して、均質な環境を心臓に提供します。
   4. 3-5分間の速度で2-3 mL/minの速度で溶液Aの流れを開始し、心臓から血液を除去します。
      注: 通過ソリューションの速度は非常に重要であり、CM品質の結果に大きな影響を与えます。
   5. 血液が心臓から取り除かれたら、溶液Aから溶液Eに切り替える(表2)。溶液中の0.1 mMの最終濃度のために以下に示すようにCaCl₂ とのTitrate溶液E:
      1. 10分の灌流の後、0.1 M CaCl₂の12.5 μLを加える。
      2. 15分の灌流の後、0.1 M CaCl₂の25 μLを加える。
   6. 酵素溶液は、流れが急速になり、心臓が柔軟になるまで、さらに30〜40分間心臓を通過させます。

4. CM単細胞懸濁液の調製

1. CM単細胞懸濁液(マウス)の調製
   1. ランゲンドルフ灌流システムから心臓を取り除きます。5 mLの酵素溶液を充填した60mmペトリ皿に移動し、バイオセーフティフードに皿を移します。
      注:ランゲンドルフ灌流システムから心臓を除去する前に、十分な心臓消化を確保してください。消化時間は、酵素活性、溶液の流れ、および心臓の大きさに依存します。
   2. バイオセーフティフードでさらなる機械的分解を行い、無菌性を確保し、汚染を回避します。
   3. 心房(基底心部の1/4^番目 )と余分な脂肪組織を慎重に取り除きます。
   4. 胸を鉗子で細かい部分にミンチ。
   5. 滅菌パスツールピペットを取り、45º角度でその先端をカットします。
   6. このパスツールピペットを使用して、穏やかなピペットによって単細胞懸濁液中の心臓組織を分配します。最適な消化は、単細胞心筋細胞の懸濁液を提供する。
      メモ:トランスファーパイプの狭い底部を取り外して、機械的なシーリングによるCMの損傷を減らします。
   7. 次いで、5 mLの停止溶液を加えて酵素活性を停止し、消化過剰の可能性を回避します。
   8. 新鮮な50 mL円錐形を取り、その上に無菌100 μmの細胞ストレーナーを置きます。
   9. 細胞ストレーナーを通して心筋細胞懸濁液を通過し、組織チャンクを除去する。ペトリ皿とストレーナーを別の5 mLの停止溶液で洗浄し(表1)、ストレーナーに取り付けられたままの心筋細胞を採取します。
2. CM単細胞懸濁液(ラット)の調製
   1. ランゲンドルフ灌流システムから心臓を取り除きます。5 mLの溶液Aを充填した100mmペトリ皿に心臓を移動し、バイオセーフティフードに皿を移動します。
      注:ランゲンドルフ灌流システムから心臓を除去する前に、十分な心臓消化を確保してください。消化時間は、酵素活性、溶液の流れ、および心臓の大きさに依存します。
   2. バイオセーフティフードでさらなる機械的分解を行い、無菌性を確保し、汚染を回避します。
   3. 心房(基底心部の1/4分の1)と余分な脂肪組織を慎重に取り除きます。
   4. 胸を鉗子で細かい部分にミンチ。
   5. 滅菌パスツールピペットを取り、45º角度でその先端をカットします。
   6. このパスツールピペットを使用して、穏やかなピペットによって単細胞懸濁液中の心臓組織を分配します。最適な消化は、単細胞心筋細胞の懸濁液を提供する。
      メモ:トランスファーパイプの狭い底部を取り外して、機械的なシーリングによるCMの損傷を減らします。
   7. 5 mLの溶液B(表2)をCM懸濁液に加え、100 μmの細胞ストレーナーを通して溶液を渡して、残りの脂肪または他の非消化組織を除去します。
   8. 新鮮な50 mL円錐バイアルで濾液を収集します。
   9. 別の5 mLの溶液Bを使用して、ペトリ皿および残りのCMを細胞ストレーナーで洗浄します。

5. 非CMの削除

1. 成体単細胞懸濁液(マウス)からの非CMの除去
   1. 細胞懸濁液を20xgで3g分間遠心分離する。
   2. 上清を捨て、細胞を停止液の10mLに再び懸濁させる(表1)。
      注:停止溶液中のBSA濃度を上げると、その粘度が増加し、非CMの沈め水速度が低下します。
   3. 管の穏やかな反転によってCMを3-5回再中断しなさい。
   4. 3分間隔で、100 μM CaCl₂ 溶液の10 μLを加えて混合します。3回繰り返します。
   5. 4回目の添加後、心筋細胞懸濁液を20xgで3分間g遠心分離する。
   6. 上清を捨てます。
   7. 事前に温めたCM(37 ºC)、成体マウスCMめっき媒体のCMを再中断する(表3)。
2. 成体単細胞懸濁液(ラット)からの非CMの除去
   1. 20 x g で 25 ºC で 3 分間ペレット細胞。
   2. 上清を捨て、細胞を溶液Bの25mLに再び懸濁させる(表2)。
   3. 穏やかな反転によって細胞を混合し、CMが重力下で落ち着くようにチューブスタンドに置きます。
   4. 上清を慎重に捨てなさい。
   5. 溶液Bの新鮮な25 mLで細胞を再懸濁し、3-5分間隔で50 μL、75 μL、および100 μLの0.1 M_CaCl2を段階的に添加して1.0 mM CaCl₂に滴下します。
      注: このステップでは、溶液 B の BSA 濃度が高くなります。溶液B中のBSA濃度を上昇させることで粘度が増加し、非CMの沈沈速度が低下します。
   6. ペレット細胞は25°Cgで3分間20xgで、上清を吸引し、成人ラット細胞培養培地の所望の体積を加える(表4)。
   7. ラミニンコーティングされたプレートにCMをシード。
      注:非被覆培養プレート上のCMのプレメッキは、非CM細胞の汚染を最小限に抑えるために使用することができます。

6. 成人CMめっき

1. プレメッキ
   1. 心筋細胞を培地に再中断する。
   2. マウスまたはラットCM用の60mmまたは100mm皿に細胞をプリプレートします。
   3. 37 ºCで5%CO2を補充インキュベーターで2時間の₂CMをインキュベートする。
   4. プレプレートインキュベーションの際に、細胞培養プレートにラミニン(PBSで10 μg/mL)を塗布し、CM培養を長期間行います。
2. プレメッキの2時間後、50 mL円錐バイアルにCMを集める。
3. 皿から細胞を収集し、トランスフェクション実験のためのラミニンコーティング24ウェル培養プレートに再プレートします。
4. 培養細胞は37ºCで培養細胞を5%CO2で補_った。4〜6時間は、表面と心筋細胞に付着するのに十分であり、したがって、トランスフェクションは、メッキ後6時間行うことができる。
   注:FBSを含むめっき媒体は一般的に使用され、拡散試験とのより良い適合性を示しています。しかし、無血清培地は、分泌因子が分析されている実験に使用することができます。

7. トランスフェクション

1. ラミニンでコーティングした細胞培養プレートにCMを4〜6時間インキュベートします。
2. CMがラミニンコーティングされたプレートに播種してから4時間後、製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクション試薬(例えば、リポフェクタミンRNAiMAX)を用いて関心のあるsiRNA(50nM)を有する細胞をトランスフェクトする。
3. トランスフェクションの24時間後、その後24時間ごとに最大20日間交換します。
4. 20日後、リンポニンなどの心臓特異的マーカーに対する免疫細胞化学を含む、下流の用途に対してPBSで4%PFAの細胞を固定し、生きた心筋細胞を長期培養することに成功した。

結果

現在の変更されたプロトコルは、ラットとマウスのCMを効率的に分離し培養することができます。ラットCM単離の場合、処置で合計3匹の成人(12週齢)の雄フィッシャー344匹を使用した。 図 1 は、手順に必要な手術装置と分離セットアップを示しています。各部分は、図の凡例にマークされ、説明されています。コラゲナーゼタイプ2は、正常な分離から高品質のCMの高い量...

ディスカッション

細胞特異的な機械学的研究を行うために、成人心筋細胞単離および長期培養のためのプロトコルを確立することが重要である。成人の CM 分離プロトコルについて説明する報告はごくわずかで、さらに少ない数が成体マウス CM^{15、16、1716,17}の長期培養に使用されます。¹⁵成体ラットCMは、成体マウス^{CM10、11、12}

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butane Dione monoxime	Sigma-Aldrich	B-0753
Blebbistatin	APExBIO	B1387
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709
Cell culture plate	Corning Costar	3526
Cell strainer	BD Biosciences	352360
Cel-miR-67	Dharmacon	CN-001000-01-50
Collagenase type2	Worthington	LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes	Sigma-Aldrich	Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Thermo Scientific	SH30022.01
EdU	Life Technologies	C10337
Fetal bovine serum	Corning	35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps	Fisherbrand	22-327379
Glucose	Sigma-Aldrich	G-5400
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	PSLAB-018285-02
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-128
Hyaluronidase	Sigma	H3506
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P-8281
KCl	Sigma-Aldrich	746436
Light Microscope	Nikon
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778-150
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-2643
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
Natural Mouse Laminin	Invitrogen	23017-015
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Pentobarbital	Henry Schein	24352
Phosphate buffered saline	Life Technologies	20012-027
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147-1G
Selenium	Sigma-Aldrich	229865+5G
siMeis2	Dharmacon	s161030
siRb1	Dharmacon	s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors	Fisher Scientific	28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-120
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor	Fisherbrand	22-079-747
Water Bath	Fisher Scientific	3006S