Изоляция, трансфекция и долгосрочная культура взрослых мышей и крысиных кардиомиоцитов

Резюме

Здесь мы представляем протокол изоляции, трансфекции и долгосрочной культуры взрослых мышей и крыс кардиомиоцитов.

Аннотация

Ex vivo культуры взрослых млекопитающих кардиомиоцитов (CMs) представляет собой наиболее релевантную экспериментальную систему для in vitro исследования сердечной биологии. Взрослые млекопитающие СМ являются неизлечимо дифференцированными клетками с минимальной пролиферативной емкостью. Постмитотическое состояние взрослых CMs не только ограничивает прогрессирование цикла сердечно-миоцитов клеток, но и ограничивает эффективную культуру CMs. Кроме того, долгосрочная культура взрослых CMs необходима для многих исследований, таких как распространение СМ и анализ экспрессии генов.

Мышь и крыса являются двумя наиболее предпочтительными лабораторных животных, которые будут использоваться для кардиомиоцитов изоляции. В то время как долгосрочная культура крысЫ CMs возможно, взрослые мыши CMs восприимчивы к смерти и не могут быть культурно более пяти дней в нормальных условиях. Таким образом, существует критическая необходимость оптимизации изоляции клеток и долгосрочного протокола культуры для взрослых murine CMs. С помощью этого измененного протокола, можно успешно изолировать и культуры как взрослых мыши и крысы CMs в течение более 20 дней. Кроме того, эффективность трансфекции siRNA изолированных СМ значительно возросла по сравнению с предыдущими докладами. Для изоляции мышей-мышей метод перфузии Langendorff используется с оптимальным ферментным раствором и достаточным временем для полной внеклеточной диссоциации матрицы. Для того, чтобы получить чистые желудочковые CMs, как atria были вскрыты и отброшены, прежде чем приступить к разъединению и покрытие. Клетки рассеивались на пластине с ламинином покрытием, что позволяло эффективно и быстро вложения. CMs было разрешено согласиться на 4-6 ч до siRNA трансфекции. Культурные средства массовой информации обновлялись каждые 24 ч в течение 20 дней, а затем, CMs были зафиксированы и окрашены для сердечно-специфических маркеров, таких как Troponin и маркеры клеточного цикла, такие как KI67.

Введение

Сердечные заболевания являются одной из ведущих причин смерти во всем мире. Почти все виды сердечных травм приводят к значительной потере взрослых кардиомиоцитов (СМ). Взрослые сердца млекопитающих не в состоянии восстановить свои сердечные травмы из-за старческого характера взрослого CM¹. Таким образом, любое оскорбление сердца взрослого млекопитающего приводит к постоянной потере СМ, что приводит к снижению сердечной функции и сердечной недостаточности. В отличие от взрослых млекопитающих, мелкие животные, как зебрафиш и тритон сердца могут регенерировать свои сердечные травмы через существующие^{СМ распространения 2,3,4}. Во всем мире продолжаются усилия по поиску нового терапевтического вмешательства в связи с сердечной травмой с помощью как пролиферативных, так и нераспространенных подходов. В последние десятилетия, различные типы генетических моделей мыши были разработаны для изучения сердечной травмы и ремонта. Однако использование моделей животных in vivo по-прежнему является дорогостоящим подходом с дополнительной сложностью для расшифровки клеточно-автономного механизма от вторичных эффектов. Кроме того, in vivo системы являются сложными для анализа CM специфические эффекты фармакологического вмешательства, которое вызывает кардиопротекторной сигнализации от СМ.

Кроме того, для проведения анализа распространения СМ необходима долгосрочная культура взрослых СМ. Анализы распространения СМ требуют как минимум 4-5 дней для индуцированных клеток в клеточный цикл и получения точных данных после этого. Кроме того, исследования, которые используют изолированные CMs для электрофизиологических исследований, скрининга наркотиков, исследования токсичности,^и Ca й гомеостаза исследования все нуждаются в улучшенной системе^{культуры 5,6,7}. Кроме того, последние исследования показывают кардиопротекторное значение цитокинов, выделяется из СМ (кардиокинов)^8,,9. Для того, чтобы исследовать терапевтическую роль и молекулярный механизм этих кардиокинов во время ремонта и регенерации сердца, необходима длительная культура.

Взрослые крысы CMs являются достаточно надежными для одноклеточной изоляции и долгосрочной культуры в системе in vitro^10,11,12. Тем не менее, взрослые мыши CMs имеют большой интерес для in vitro анализы, из-за наличия различных генетически модифицированных моделей мыши, что позволяет для разработки и выполнения различных инновационных анализов, которые невозможны с крысой CM¹³. В отличие от взрослых крыс CM изоляции, это довольно сложно получить одноклеточную подвеску от взрослых сердца мыши, и долгосрочная культура взрослых мыши CMs в культуре является еще более сложной задачей.

Взрослый CM изоляции от мыши и крысы сердца с помощью системы Langendorff ранее была создана^{для изучения функции}CM 5^,14,15. Здесь мы подробно описали протоколы изоляции взрослых СМ как от крыс, так и от мышей, а также модифицированную долгосрочную культуру, трансфекцию и распространение СМ изолированных клеток.

протокол

Все эксперименты должны проводиться в соответствии с руководящими принципами Руководства по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованными Национальным институтом здравоохранения США (NIH). Все протоколы, отображаемые в видео, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными (IACUC) Университета Цинциннати, Медицинский колледж.

1. Подготовка перед извлечением сердца у взрослых мышей (и крыс)

1. Подготовка соответствующих перфузии, ферментов и стоп-решений, в соответствии с рецептами, данными в таблице 1 и таблице 2, для крыс и мыши изоляции, соответственно. Фильтр решения через фильтр 0,22 мкм, чтобы удалить любое загрязнение или неохолиденые частицы.
2. Очистите и стерилизовать хирургические инструменты, замачивая их в 70% алкоголя в течение 15 минут, а затем мыть двойной дистиллированной водой. Оставьте инструменты, чтобы высохнуть на чистом бумажном полотенце.
3. Предварительно разогреть водяную баню до 37 oC. Проверьте уровень воды в водяной бане, чтобы обеспечить бесперебойную циркуляцию теплой воды через перфузионный аппарат во время процедуры.
4. Очистите перфузионный аппарат, работает с 70% алкоголя в течение 5 мин. Повторите.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличьте скорость потока, что помогает очистить трубы.
5. После потока алкоголя, очистить остатки алкоголя, запуская двойную дистиллированную воду в течение 10 минут.
6. Настройка 3 средних одноразовых полистирола взвешивания блюд для очистки сердца после иссечения. Заполните посуду 20 мл буфера миоцитов.
7. Добавьте 2-3 капли гепарина в каждое блюдо с помощью пипетки Pasteur и хорошо перемешайте, промокая несколько раз.
8. Возьмите шприц 10 мл с тупой иглой канюли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тупая игла канюла может быть подготовлена путем резки кончик чистой, стерильной иглы. 21 G иглы и 14 G иглы были использованы, чтобы сделать канюлю для мыши и крысы, соответственно.
9. Заполните шприц буфером перфузии(таблица 1). Снимите пузырьки воздуха со шприца и поместите его в третье блюдо под углом. Закретись скотчем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для крыс вместо буфера перфузии миоцитов использовалось решение А (таблица2).
10. Подготовь свободный узел хирургическим швом и поместите его вокруг иглы.
11. Ввимите мышь гепарином (100 единиц USP/мышь) путем внутриперитонеальной инъекции за 20 минут до инъекции анестезии.
12. Циркулировать буфер перфузии миоцитов(таблица 1) через перфузионный аппарат. Снижение скорости потока до 3 мл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для крыс вместо буфера перфузии миоцитов использовалось решение А (таблица2).
13. Через 5 минут замените буфер перфузии раствором фермента(таблица 1). Насыщать ферментный раствор кислородом во время процесса. Используйте скорость потока 3 мл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для изоляции крыс CM, используйте решение E (Таблица 2) вместо.
14. Анестезия мыши путем внутриперитонеальной инъекции анестезии. Используйте соответствующую дозу анестезии, рекомендованную МАКУК, для терминальной хирургии.
15. Подтвердите достаточную глубину анестезии отсутствием реакции на щепотку нося. Затем положите мышь на хирургическую платформу.

2. Извлечение сердца из взрослых мышей (и крыс)

1. Стерилизовать кожу, вытирая 70% алкоголя.
2. Аккуратно откройте грудь.
3. Акциз на сердце. Избегайте несердечных тканей во время иссечения.
4. Положите сердце на первое блюдо, наполненное перфузией буфера(таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте раствор А для крысы(таблица 2).
5. Очистите кровь от сердца, мягко сжимая.
6. Перенесите сердце на второе блюдо.
7. Очистите кровь от сердца и удалите несердечные ткани. Впоследствии перенесите сердце на третье блюдо.
8. Обрезать легкие и другие окружающие ткани и cannulate через восходящую аорту. Эта процедура должна быть выполнена как можно быстрее (lt;5 мин) для улучшения качества и количества CM.

3. Пищеварение сердца

1. Переваривание сердца мыши
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все решения / буферы, которые циркулируют через сердце мыши должны быть насыщены кислородом на протяжении всей процедуры.
   1. Аккуратно снимите иглу из шприца и соедините ее с перфузионный аппарат Langendorff.
   2. Избегайте пузырьков воздуха, иных в сердце, которые могут повлиять на поток через ферментный раствор и пищеварение.
   3. Переместив водяной пиджак вверх, чтобы обеспечить однородную среду для сердца. Разрешить ферментный раствор течь через сердце со скоростью 2-3 мл/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость прохождения решения имеет решающее значение и оказывает значительное влияние на результат CM количество и качество.
   4. Пусть ферментный раствор течет через сердце в течение 2 минут.
   5. В 2 мин. добавьте 40 МКЛ из 100 МКМ CaCl_{2 раствора} фермента и перемешайте. Пусть ферментный раствор проходит через сердце еще 10-15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как только поток становится гладким, сердце становится коричневатым и мягким, что указывает на равномерное распределение фермента коллагеназы и правильное пищеварение сердца.
2. Переваривание крысиного сердца
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все решения / буферы, которые циркулируют через сердце крысы должны быть насыщены кислородом на протяжении всей процедуры.
   1. Аккуратно снимите иглу из шприца и соедините ее с перфузионный аппарат Langendorff.
   2. Избегайте пузырьков воздуха, иных в сердце, которые могут повлиять на поток через ферментный раствор и пищеварение.
   3. Переместив водяной пиджак вверх, чтобы обеспечить однородную среду для сердца.
   4. Начните поток раствора А со скоростью 2-3 мл/мин в течение 3-5 минут, чтобы удалить кровь из сердца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость прохождения решения имеет решающее значение и оказывает значительное влияние на результат качества CM.
   5. Как только кровь очищается от сердца, переключитесь с раствора А на раствор E(таблица 2). Titrate решение E с CaCl_2, как указано ниже для окончательной концентрации 0,1 мМ в растворе:
      1. После 10 мин перфузии добавьте 12,5 МКЛ из 0,1 М CaCl₂.
      2. После 15 мин перфузии добавьте 25 МКЛ из 0,1 М CaCl₂.
   6. Пусть ферментный раствор проходит через сердце еще 30-40 минут, пока поток не станет быстрым и сердце податливым.

4. Подготовка одноклеточной подвески CM

1. Подготовка одноклеточной подвески CM (мышь)
   1. Удалите сердце из перфузионой системы Лангендорфа. Переместите его в 60 мм чашку Петри, наполненную 5 мл ферментного раствора и перенесите блюдо в капюшон биобезопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить достаточное пищеварение сердца, прежде чем удалить сердце из системы перфузии Langendorff. Время пищеварения зависит от активности фермента, потока раствора и размера сердца.
   2. Выполните любую дальнейшую механическую дезагрегацию в капюшоне биобезопасности, чтобы обеспечить стерильность и избежать загрязнения.
   3. Тщательно удалите атрию (1/4^{й части} базального сердца) и жировые ткани.
   4. Фарш сердце с миппами на мелкие кусочки.
   5. Возьмите стерильный пипетку Pasteur и вырежьте ее кончик под углом 45o.
   6. Используйте эту пипету Pasteur, чтобы обойтись до ткани сердца в одноклеточной подвеске, нежной трубой. Оптимальное пищеварение обеспечивает суспензию одноклеточных кардиомиоцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите узкую, нижнюю часть трубы передачи, чтобы уменьшить повреждение CM из-за механического жгучего.
   7. Затем добавьте 5 мл стоп-раствора, чтобы остановить активность фермента, что позволяет избежать переварения желудка.
   8. Возьмите свежий 50 мл конической и поместите стерильные 100 мкм клетки ситечко на нем.
   9. Пройдите подвеску кардиомиоцитов через клеточный ситечко, чтобы удалить кусок ткани. Вымойте чашку Петри и ситечко с еще 5 млстоп-раствора (таблица 1), чтобы собрать любые кардиомиоциты, которые остаются прикрепленными к ситечко.
2. Подготовка одноклеточной подвески CM (крыса)
   1. Удалите сердце из перфузионой системы Лангендорфа. Перемести сердце в 100-мм чашку Петри, наполненную 5 мл раствора А, и перемести блюдо в биобезопасность капюшона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить достаточное пищеварение сердца, прежде чем удалить сердце из системы перфузии Langendorff. Время пищеварения зависит от активности фермента, потока раствора и размера сердца.
   2. Выполните любую дальнейшую механическую дезагрегацию в капюшоне биобезопасности, чтобы обеспечить стерильность и избежать загрязнения.
   3. Тщательно удалите атрию (1/4 части базального сердца) и жировые ткани.
   4. Фарш сердце с миппами на мелкие кусочки.
   5. Возьмите стерильный пипетку Pasteur и вырежьте ее кончик под углом 45o.
   6. Используйте эту пипету Pasteur, чтобы обойтись до ткани сердца в одноклеточной подвеске нежным пипеткой. Оптимальное пищеварение обеспечивает суспензию одноклеточных кардиомиоцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите узкую, нижнюю часть трубы передачи, чтобы уменьшить повреждение CM из-за механического жгучего.
   7. Добавьте 5 мл раствора B(таблица 2)к подвеске CM и перейдите раствор через 100 мкм клеточного ситечко, чтобы удалить оставшиеся кусочки жира или других непереваренных тканей.
   8. Соберите фильтрат в свежем коническом флаконе 50 мл.
   9. Используйте еще 5 мл раствора B для мытья чашки Петри и любого оставшегося CM через клеточный ситечко.

5. Удаление не-CMs

1. Удаление не-CMs из взрослых одноклеточной подвески (мышь)
   1. Центрифуга клеточной суспензии при 20 x g в течение 3 мин.
   2. Отбросьте супернатант и повторно посовекуйте ячейки в 10 мл стоп-раствора(таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение концентрации BSA в стоп-растворе увеличит его вязкость и снизит скорость осаждения не-CMs.
   3. Resuspend CMs нежной инверсии трубки 3-5 раз.
   4. С интервалом в 3 минуты добавьте 10 МКЛ из 100 мкм раствора CaCl₂ и смешайте. Повторите трижды.
   5. После четвертого добавления центрифуга подвески кардиомиоцита на 20 х г в течение 3 мин.
   6. Откажитесь от супернатанта.
   7. Resuspend CMs в предварительно разогретых (37 oC), взрослых мыши CM покрытие средств массовой информации (Таблица 3).
2. Удаление не-CMs из взрослых одноклеточных суспензий (крыса)
   1. Пеллетные клетки при 20 x g в течение 3 мин при 25 oC.
   2. Отбросьте супернатант и повторно посовейте клетки в 25 мл раствора B(таблица 2).
   3. Смешайте клетки нежной инверсии и поместите его в трубку стоять, чтобы позволить CM поселиться под действием силы тяжести.
   4. Осторожно отбросьте супернатант.
   5. Повторное включение клеток в свежие 25 мл раствора B и титровать его до 1,0 мМ CaCl₂ пошаговому добавлению 50 МЛ, 75 МЛ и 100 МКЛ 0,1 М CaCl₂ с интервалом 3-5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая концентрация BSA в растворе B может быть использована на этом этапе. Увеличение концентрации BSA в растворе B увеличивает вязкость и, таким образом, снижает скорость осаждения не-CMs.
   6. Пеллет клетки на 20 х г в течение 3 мин при 25 oC, аспирировать супернатант, и добавить желаемый объем взрослых крысиных клеток культуры средств массовой информации (Таблица 4).
   7. Семена CMs на пластине с ламинином покрытием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное покрытие CMs на пластине культуры без покрытия может быть использовано, чтобы свести к минимуму загрязнение не-CM клеток.

6. Взрослый CM покрытие

1. Предварительное покрытие
   1. Перепродюсовать кардиомиоциты в культурные средства массовой информации.
   2. Предварительно пластины клеток в 60 мм или 100 мм блюдо для мыши или крысы CM, соответственно.
   3. Инкубировать CMs в течение 2 ч в инкубаторе дополняется 5% CO₂ при 37 oC.
   4. Во время инкубации предварительной пластины, пальто пластины клеточной культуры с ламинином (10 мкг / мл в PBS) для долгосрочной культуры CM.
2. После 2 ч предварительного покрытия, собирать CMs в 50 мл конического флакона.
3. Соберите клетки из блюда и повторно пластины их в ламинин покрытием 24 хорошо культуры пластины для трансфекции экспериментов.
4. Культурные клетки в инкубаторе при 37 oC дополняются 5% CO_2. 4-6 часов достаточно, чтобы прилипать к кардиомиоцитам с поверхностью, а значит, трансфекцию можно выполнять 6 часов после покрытия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда покрытия, содержащая FBS, широко используется и показывает лучшую совместимость с исследованиями распространения. Тем не менее, среда без сыворотки может быть использована для экспериментов, где анализируются секреторные факторы.

7. Трансфекция

1. Инкубировать CMs к пластинам культуры клетки покрыть с laminin на 4-6 часов.
2. Через четыре часа после СМ посева на пластине с покрытием ламинина, трансфект клетки с siRNAs (50 нМ) интереса с использованием трансфекции реагент (например, липофектамин RNAiMAX) в соответствии с протоколом производителя.
3. Изменение средств массовой информации 24 часов после трансфекции и каждые 24 часа после этого на срок до 20 дней.
4. После 20 дней, исправить клетки с 4% PFA в PBS для вниз по течению приложений, в том числе иммуноцитохимии для сердечно-специфических маркеров, таких как Troponin для обеспечения живых кардиомиоцитов были успешно культурные долгосрочной перспективе.

Результаты

Текущий измененный протокол позволяет эффективно изоляции и культуры крыс и мышей CMs в пробирке. Для крысы CM изоляции, в общей сложности 3 взрослых (12-недельный) мужчина Фишер 344 крысы были использованы в процедуре. Рисунок 1 показывает хирургический аппарат и изоляционны...

Обсуждение

Существует критическая необходимость в создании протокола для взрослых кардиомиоцитов изоляции и долгосрочной культуры для выполнения клеточных механистических исследований. Есть только несколько докладов, обсуждающих взрослых ПРОТОКОЛов изоляции CM, и еще меньше из них используют?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butane Dione monoxime	Sigma-Aldrich	B-0753
Blebbistatin	APExBIO	B1387
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709
Cell culture plate	Corning Costar	3526
Cell strainer	BD Biosciences	352360
Cel-miR-67	Dharmacon	CN-001000-01-50
Collagenase type2	Worthington	LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes	Sigma-Aldrich	Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Thermo Scientific	SH30022.01
EdU	Life Technologies	C10337
Fetal bovine serum	Corning	35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps	Fisherbrand	22-327379
Glucose	Sigma-Aldrich	G-5400
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	PSLAB-018285-02
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-128
Hyaluronidase	Sigma	H3506
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P-8281
KCl	Sigma-Aldrich	746436
Light Microscope	Nikon
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778-150
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-2643
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
Natural Mouse Laminin	Invitrogen	23017-015
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Pentobarbital	Henry Schein	24352
Phosphate buffered saline	Life Technologies	20012-027
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147-1G
Selenium	Sigma-Aldrich	229865+5G
siMeis2	Dharmacon	s161030
siRb1	Dharmacon	s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors	Fisher Scientific	28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-120
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor	Fisherbrand	22-079-747
Water Bath	Fisher Scientific	3006S